一种清除细菌生物被膜的方法发明专利

专利名称：一种清除细菌生物被膜的方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210264213.X

专利申请（专利权）人：西北农林科技大学
权利人地址：陕西省咸阳市杨凌区邰城路3号

专利发明（设计）人：石超, 李雨露, 郑晓营, 王灏然, 张春玲, 李卓, 郭都, 王沐雪, 罗琨瑶, 王硕, 王瑞霞, 战相君, 苏芮莹, 宋璐忆, 杨慧, 程帅

专利摘要：本发明涉及一种清除细菌生物被膜的方法，其包括对细菌生物被膜依次用二癸基二甲基铵盐水溶液进行第一处理和微酸性电解水进行第二处理。通过应用该方法，使二癸基二甲基铵盐和微酸性电解水起到了协同增效的作用，同时解决了二癸基二甲基铵盐残留问题和微酸性电解水清除生物被膜能力有限的问题，显著提高了对细菌生物被膜的清除效果，具有操作简便、成本低廉的优点，可以满足环境友好、食品安全、人类健康、高效彻底的要求，具有良好的应用前景。

主权利要求：一种清除细菌生物被膜的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种清除细菌生物被膜的方法。
背景技术
[0002] 细菌生物被膜是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。细菌生物被膜在自然、工业和医疗等领域中普遍存在。细菌生物被膜可以保护细菌免受外界环境压力、增强微生物的存活性。
[0003] 当细菌以生物被膜的形式附着在自然环境中有生命和无生命的物体表面时，这种生活方式可以帮助其抵抗环境中各种不利因素如过酸或过碱的环境。细菌生物被膜对消毒剂的抵抗力是浮游细菌的数百倍甚至上千倍，具有难以去除的特性。例如，在工厂中，流经管道的原料会带有一定的细菌，细菌附着于管道壁上，会形成生物被膜。在食品工厂中，细菌生物被膜可以导致食品污染，进而增加疾病发生的风险，包括慢性病等。
[0004] 常见的控制细菌生物被膜的方法有高压喷射处理、亚硝酸、过氧化氢和次氯酸等，这些方法对生物被膜有一定破坏作用，然而往往具有抗菌效果不明显、清除细菌生物被膜不彻底、试剂用量大成本高昂、操作复杂等缺陷。酸性电解质水被视为一种环境友好型的杀菌剂，具有低pH值、高氧化还原电位和一定的有效氯等特点，其主要通过干扰膜的平衡使微生物的细胞膜电位发生改变，导致细胞通透性增强、细菌肿胀及细胞代谢酶的破坏，胞内物质溢出、溶解，从而达到杀灭微生物的作用。酸性电解质水已被报道可以用于清除生物被膜，但是效果较弱。中国专利CN112806519A公开了一种清除细菌生物被膜的方法，包括先用酸性电解水处理生物被膜不低于5min，再用含0.5g/100mLNaS2O3的PBS缓冲液中和不低于5min。然而，该方法对细菌生物被膜的清除效率仅达到33.33‑53.07％，难以满足食品行业管道要求的标准。

[0005] 因此，本领域亟需开发新的清除细菌生物膜的方法，以克服现有技术中抗菌效果不明显、清除细菌生物被膜不彻底、成本高昂、操作复杂等缺陷。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种清除细菌生物被膜的方法，通过应用该方法，使二癸基二甲基铵盐和微酸性电解水起到了协同增效的作用，显著提高了对细菌生物被膜的清除效果，具有操作简便、成本低廉的优点、符合食品安全标准的优点。
[0007] 为此，第一方面，本发明提供一种清除细菌生物被膜的方法，其包括对细菌生物被膜依次用二癸基二甲基铵盐水溶液进行第一处理和微酸性电解水进行第二处理。
[0008] 进一步，所述第一处理和第二处理各自独立地选自浸泡或者冲洗。
[0009] 根据本发明的技术方案，对所述第一处理和第二处理的温度条件不做特别限定；例如可以为室温，被清理表面的通常工作温度条件等。

[0010] 进一步，所述二癸基二甲基铵盐水溶液的浓度为32‑600μg/mL，例如32μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、350μg/mL、400μg/mL、450μg/mL、500μg/mL、550μg/mL、600μg/mL等。

[0011] 进一步，所述二癸基二甲基铵盐为二癸基二甲基溴化铵、二癸基二甲基氯化铵中的一种或两种。
[0012] 进一步，所述微酸性电解水为现配现用。
[0013] 进一步，所述微酸性电解水的有效氯浓度为10‑30mg/L，pH值为5.0‑6.5，氧化还原电位为700‑900mV。
[0014] 在一些实施方式中，所述微酸性电解水的有效氯浓度为10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L等。

[0015] 在一些实施方式中，所述微酸性电解水的pH值为约5.0、5.2、5.5、5.8、6.0、6.2、6.5等。

[0016] 在一些实施方式中，所述微酸性电解水的氧化还原电位为约700mV、725mV、750mV、775mV、800mV、825mV、850mV、875mV、900mV等。

[0017] 进一步，用二癸基二甲基溴化铵水溶液处理的时间为不小于5min、10min、15min、20min等。在一些实施方式中，用二癸基二甲基溴化铵水溶液处理的时间为5‑10min、10‑
15min、10‑20min等；例如，5min、10min、15min、20min等。

[0018] 进一步，用微酸性电解水处理的时间为不小于5min、10min、15min、20min等。在一些实施方式中，用微酸性电解水处理的时间为5‑10min、10‑15min、10‑20min等；例如，5min、10min、15min、20min等。

[0019] 进一步，在所述二癸基二甲基溴化铵水溶液处理之前、在所述二癸基二甲基溴化铵水溶液处理与微酸性电解水处理之间、在所述微酸性电解水处理之后还任选地包括以下处理步骤：用无菌水进行清洗。
[0020] 根据本发明的技术方案，所述用无菌水进行清洗不是必要步骤，仅为可选/优选步骤。使用无菌水进行清洗是为了洗掉浮游态细菌和死菌，在实际应用过程可根据实际情况进行选择。
[0021] 在一些实施方式中，在所述二癸基二甲基溴化铵水溶液处理之前包括用无菌水进行清洗的步骤。
[0022] 在一些实施方式中，在所述二癸基二甲基溴化铵水溶液处理与微酸性电解水处理之间包括用无菌水进行清洗的步骤。
[0023] 在一些实施方式中，在所述微酸性电解水处理之后包括用无菌水进行清洗的步骤。
[0024] 进一步，所述细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等。
[0025] 在某一实施方式中，所述细菌为金黄色葡萄球菌，所述二癸基二甲基溴化铵水溶液的浓度为32μg/mL。
[0026] 在另一实施方式中，所述细菌为铜绿假单胞菌，所述二癸基二甲基溴化铵水溶液的浓度为600μg/mL
[0027] 季铵盐类化合物是阳离子表面活性剂，具有出色的硬表面清洁和抗菌活性，广泛用于生产清洁剂、织物、化妆品、消毒剂和其他工业产品。二癸基二甲基溴化铵(Didecyldimethylammoniumbromide,DDAB)是一种市售的二癸基二甲基铵盐家族的阳离子C10双链表面活性剂，属于第四代季铵化合物，可以用作杀菌剂、杀菌剂、木材防腐剂和消毒剂。但是季铵盐类化合物过量和高浓度使用会导致耐药菌株的产生和环境污染，并且季铵盐类化合物清洁不彻底会在食品加工管道中留下残留物，影响食品质量。

[0028] 微酸性电解水(Slightlyacidicelectrolyzedwater,SAEW)是一种pH值为5.0‑6.5，含有次氯酸的电解水。微酸性电解水可以通过使用氧化还原电位水发生器电解含有稀HCl水溶液来制备，该发生器配备有阳极和阴极，且两者之间没有隔离膜的电解池。微酸性电解水中的有效氯浓度(Availablechlorineconcentration,ACC)为10–30mg/L。微酸性电解水冲洗管道后可以满足食品行业管道要求的标准。

[0029] 与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
[0030] (1)本发明提供了一种清除细菌生物被膜的方法，通过应用该方法，使二癸基二甲基铵盐和微酸性电解水起到了协同增效的作用，同时解决了二癸基二甲基铵盐残留问题和微酸性电解水清除生物被膜能力有限的问题，显著提高了对细菌生物被膜的清除效果，可确保清洗后的管道满足食品管道行业标准。
[0031] (2)本发明提供的清除细菌生物被膜的方法对革兰氏阳性菌和阴性菌所形成的生物被膜均有优良的清除效果，具有广泛的适用范围。
[0032] (3)本发明提供的清除细菌生物被膜的方法具有操作简便、成本低廉的优点，可以满足环境友好、食品安全、人类健康、高效彻底的要求，具有良好的应用前景。
附图说明
[0033] 通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
[0034] 图1：具有金黄色葡萄球菌生物被膜的不锈钢片经处理后的细菌数量计数结果；其中，最小抑菌浓度(MinimalInhibitoryConcentrations，MIC)为2μg/mL；
[0035] 图2：具有铜绿假单胞菌生物被膜的不锈钢片经处理后的细菌数量计数结果；其中，MIC为25μg/mL。
具体实施方式
[0036] 下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0037] 实施例1生物被膜的制备
[0038] 本实施例制备得到了形成于不锈钢片上的金黄色葡萄球菌生物被膜和铜绿假单胞菌生物被膜，制备得到的细菌生物被膜用于实施例2‑9和对比例1‑2。
[0039] 将保存于‑80℃冰箱的金黄色葡萄球菌ATCC29213和铜绿假单胞菌PAO1分别划于TSA平板上在37℃下培养24h，之后将单菌落挑取到含有30mLTSB肉汤的锥形瓶中，然后将锥形瓶放置在转速为130rpm的37℃恒温摇床中培养12h。随后，将经培养的30mL菌悬液离心(8000×g,5min,4℃)，使用无菌磷酸盐缓冲溶液(PhosphateBufferSolution,PBS,pH＝7.2)清洗菌体两次，离心参数设置同前。随后使用YPD肉汤调整金黄色葡萄球菌菌液浓度为
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2×10CFU/mL；使用YPD肉汤调整铜绿假单胞菌菌液浓度为4×10CFU/mL，备用。

[0040] 将重悬浮于YPD肉汤的菌悬液稀释菌浓度至约为107CFU/mL，分装于含有不锈钢片(10mm×10mm)的24孔板中，每孔加入2mL菌液，金黄色葡萄球菌放置于25℃恒温培养箱中恒温培养72h，而铜绿假单胞菌放置于25℃恒温培养箱中恒温培养48h，使金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在不锈钢片上形成成熟的生物被膜，得到具有金黄色葡萄球菌生物被膜的不锈钢片和具有铜绿假单胞菌生物被膜的不锈钢片。
[0041] 实施例2
[0042] 取实施例1制备得到的具有金黄色葡萄球菌生物被膜的不锈钢片，用无菌水清洗后，立即进行以下处理：二癸基二甲基溴化铵水溶液浸泡处理10min，然后用微酸性电解水浸泡处理10min。进行三组独立平行实验。
[0043] 其中，二癸基二甲基溴化铵水溶液的浓度为32μg/mL。微酸性电解水为现配现用，通过使用氧化还原电位水发生器电解含有稀HCl水溶液制备得到，该发生器配备有阳极和阴极，且两者之间没有隔离膜的电解池。微酸性电解水的有效氯浓度为30mg/L，pH为6.30，氧化还原电位为875mV。
[0044] 实施例3
[0045] 取实施例1制备得到的具有金黄色葡萄球菌生物被膜的不锈钢片进行浸泡处理，除二癸基二甲基溴化铵水溶液的浓度为8μg/mL外，其他条件同实施例2。
[0046] 实施例4
[0047] 取实施例1制备得到的具有金黄色葡萄球菌生物被膜的不锈钢片进行浸泡处理，除二癸基二甲基溴化铵水溶液的浓度为16μg/mL外，其他条件同实施例2。
[0048] 实施例5
[0049] 取实施例1制备得到的具有金黄色葡萄球菌生物被膜的不锈钢片进行浸泡处理，除二癸基二甲基溴化铵水溶液的浓度为24μg/mL外，其他条件同实施例2。
[0050] 实施例6
[0051] 取实施例1制备得到的具有铜绿假单胞菌生物被膜的不锈钢片，用无菌水清洗后，立即进行以下处理：二癸基二甲基溴化铵水溶液浸泡处理10min，然后用微酸性电解水浸泡处理10min。
[0052] 其中，二癸基二甲基溴化铵水溶液的浓度为600μg/mL。微酸性电解水为现配现用，通过使用氧化还原电位水发生器电解含有稀HCl水溶液制备得到，该发生器配备有阳极和阴极，且两者之间没有隔离膜的电解池。微酸性电解水的有效氯浓度为30mg/L，pH为6.30，氧化还原电位为875mV。
[0053] 实施例7
[0054] 取实施例1制备得到的具有铜绿假单胞菌生物被膜的不锈钢片进行浸泡处理，除二癸基二甲基溴化铵水溶液的浓度为300μg/mL外，其他条件同实施例6。
[0055] 实施例8
[0056] 取实施例1制备得到的具有铜绿假单胞菌生物被膜的不锈钢片进行浸泡处理，除二癸基二甲基溴化铵水溶液的浓度为400μg/mL外，其他条件同实施例6。
[0057] 实施例9
[0058] 取实施例1制备得到的具有铜绿假单胞菌生物被膜的不锈钢片进行浸泡处理，除二癸基二甲基溴化铵水溶液的浓度为500μg/mL外，其他条件同实施例6。
[0059] 对比例1
[0060] 取实施例1制备得到的具有金黄色葡萄球菌生物被膜的不锈钢片，用无菌水清洗后，立即分别进行下组处理：
[0061] 组1‑1：用无菌水浸泡处理10min，然后用微酸性电解水浸泡处理10min；其中，所述微酸性电解水与实施例2中的微酸性电解水相同。
[0062] 组1‑2：用浓度为8μg/mL的二癸基二甲基溴化铵水溶液浸泡处理10min，然后用无菌水处理10min；
[0063] 组1‑3：用浓度为16μg/mL的二癸基二甲基溴化铵水溶液浸泡处理10min，然后用无菌水处理10min；
[0064] 组1‑4：用浓度为24μg/mL的二癸基二甲基溴化铵水溶液浸泡处理10min，然后用无菌水处理10min；
[0065] 组1‑5：用浓度为32μg/mL的二癸基二甲基溴化铵水溶液浸泡处理10min，然后用无菌水处理10min。
[0066] 对比例2
[0067] 取实施例1制备得到的具有铜绿假单胞菌生物被膜的不锈钢片，用无菌水清洗后，立即分别进行下组处理：
[0068] 组1‑1：用无菌水浸泡处理10min，然后用微酸性电解水浸泡处理10min；其中，所述微酸性电解水与实施例2中的微酸性电解水相同。
[0069] 组1‑2：用浓度为300μg/mL的二癸基二甲基溴化铵水溶液浸泡处理10min，然后用无菌水处理10min；
[0070] 组1‑3：用浓度为400μg/mL的二癸基二甲基溴化铵水溶液浸泡处理10min，然后用无菌水处理10min；
[0071] 组1‑4：用浓度为500μg/mL的二癸基二甲基溴化铵水溶液浸泡处理10min，然后用无菌水处理10min；
[0072] 组1‑5：用浓度为600μg/mL的二癸基二甲基溴化铵水溶液浸泡处理10min，然后用无菌水处理10min。
[0073] 实验例
[0074] 取实施例2‑9和对比例1‑2处理得到的不锈钢片，分别用无菌水漂洗两次，然后放置到4mL离心管中，离心管中含有2mL无菌PBS和0.5g玻璃珠，将离心管充分涡旋5min，保证离心管里的玻璃珠使形成在不锈钢片上的生物被膜完全脱落。从中吸取1mL吹打均匀的菌液进行稀释，取不同菌浓度的菌液在TSA平板上涂布，置于37℃培养箱中培养18h后计数，计2
数单位表示为logCFU/cm。

[0075] 细菌计数的统计结果见图1和图2所示，图1为具有金黄色葡萄球菌生物被膜的不锈钢片的处理结果，图2为具有铜绿假单胞菌生物被膜的不锈钢片的处理结果。其中，图1中MIC为2μg/mL，图2中MIC为25μg/mL；SDW表示无菌水，SAEW表示微酸性电解水，DDAB表示二癸基二甲基溴化铵水溶液。
[0076] 需要说明的是，以上实施例以浸泡处理、处理时间为10min为例进行了说明，在其他条件不变的情况下，采用冲洗处理、或采取更长的处理时间也可以获得相同甚至更优的技术效果。
[0077] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

专利地区：陕西

专利申请日期：2022-03-17

专利公开日期：2023-09-19

专利公告号：CN114711232B