药用层孔菌发酵产品及其制备方法和应用发明专利

专利名称：药用层孔菌发酵产品及其制备方法和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202211710629.6

专利申请（专利权）人：太和康美(北京)中医研究院有限公司
权利人地址：北京市房山区拱辰街道办事处学园北街11号教育实习楼七层80701

专利发明（设计）人：董银卯, 任晗堃, 吕永博

专利摘要：本发明涉及护肤品技术领域，尤其是涉及一种药用层孔菌发酵产品及其制备方法和应用。药用层孔菌发酵产品，在一定的液相色谱检测条件下得到的色谱图中，在保留时间为3.21～3.38min、3.61～3.69min、5.40～5.72min、7.58～8.05min、9.10～9.80min、11.96～12.75min和12.78～14.20min处具有吸收峰。本发明的药用层孔菌发酵产品，具有清除ABTS自由基的能力，同时对5α‑还原酶活性具有明显的抑制作用，具有抑制炎症因子TNF‑α、IL‑6表达的作用，具有控油和收缩毛孔的作用，可用于化妆品中。

主权利要求：药用层孔菌发酵产品及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及护肤品技术领域，尤其是涉及一种药用层孔菌发酵产品及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 控油、毛孔的关注度和保湿是消费者关注的热点方向。目前市面上通常是通过刷酸来进行控油和收缩毛孔，且在产品中多复配其它舒缓成分来平衡酸带来的刺激性。“刷酸”是一种化学换肤术，又称化学剥脱术，是将化学制剂涂在皮肤表面，导致皮肤可控的损伤后促进新的皮肤再生。化学制剂的种类、浓度、在皮肤上的停留时间都能影响换肤的深度。换肤作用深度越深，效果越明显，同时不良反应发生的几率也更大。所以急需一个能温和控油和收缩毛孔的产品。目前发酵产品已经成为化妆品行业热点之一。
[0003] 药用层孔菌，在中国主要分布于新疆的山区。是一种多年生大型药用真菌。化学成分丰富，主要活性成分有：三萜及甾体类、倍半萜类、多糖和直链烷烃类等；并且具有多种药理活性，如免疫调节、抗菌作用、抗肿瘤作用和抗氧化作用，目前对于药用层孔菌的研究集中在医药的抗肿瘤研究中，对于其成分在化妆品作用上的报道较少，其对于皮肤的相关作用研究也并不深入。
[0004] 药用层孔菌作为传统维药，应用于临床治疗已有悠久的历史，但由于近年来天然落叶松林的迅速减少以及树木病虫害的防治，天然药用层孔菌子实体减少。目前对药用层孔菌的研究主要集中在野生子实体中有效成分的提取、鉴定和功能方面。对药用层孔菌提取物的药理活性的研究报道比较少，且药用层孔菌的传统的提取方法，提取效率低，资源浪费严重，活性成分利用不充分，生物利用率低。
[0005] 药用层孔菌属于大型真菌类，其菌丝体及子实体由于细胞壁坚固，活性成分提取难度较高通常提取不充分，因此此类产品需经过复杂的破壁工艺或采用多种有机试剂进行提取才能获得其活性成分。然而，由于化妆品行业的要求，多数有机溶剂属于禁限用成分难以在化妆品行业使用，而复杂提取破壁工艺的应用带来的加工成本和仪器购买成本随之增加，也使药用层孔菌在化妆品行业中的应用价格高，仅能在高端产品中使用，应用面受限，此外药用层孔菌在化妆品行业使用时的功效目前也未见深入的报道研究。
[0006] 有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
[0007] 本发明的一个目的在于提供药用层孔菌发酵产品，具有控油和收缩毛孔的作用。
[0008] 本发明的另一目的在于提供药用层孔菌发酵产品的制备方法。
[0009] 本发明的又一目的在于提供药用层孔菌发酵产品在制备护肤品中的应用。
[0010] 为了实现本发明的上述目的，本发明一方面提供了一种药用层孔菌发酵产品，在液相色谱检测条件下得到的色谱图中，在保留时间为3.21～3.38min、3.61～3.69min、5.40～5.72min、7.58～8.05min、9.10～9.80min、11.96～12.75min和12.78～14.20min处具有吸收峰；
[0011] 所述液相色谱检测条件包括：
[0012] 色谱柱型号为艾杰尔VensilMPC18.5μm，100A，4.6×250mm；
[0013] 柱温为25℃；
[0014] 紫外检测器波长为214nm；
[0015] 流动相为0.1mol/L磷酸二氢铵溶液；采用所述流动相进行等度洗脱15min；流速为0.8mL/min；

[0016] 平衡柱子时间及压力分别为40min和84bar；
[0017] 进样量为5μL。
[0018] 在本发明的具体实施方式中，所述药用层孔菌发酵产品包括按质量份数计的如下组分：
[0019] 乳酸菌发酵产物62～70份和药用层孔菌提取物1～3份。
[0020] 在本发明的具体实施方式中，所述药用层孔菌发酵产品还包括添加剂。进一步的，所述添加剂包括甘油、1,2‑戊二醇、1,2‑己二醇和黄原胶中的至少一种。
[0021] 在本发明的具体实施方式中，所述药用层孔菌发酵产品包括按质量份数计的如下组分：
[0022] 乳酸菌发酵产物62～70份、药用层孔菌提取物1～3份、甘油25～32份、1,2‑戊二醇1～3份、1,2‑己二醇0.5～1.5份和黄原胶0.01～0.05份。

[0023] 在本发明的具体实施方式中，所述药用层孔菌发酵产品包括按质量份数计的如下组分：
[0024] 乳酸菌发酵产物64.98份、药用层孔菌提取物2份、甘油30份、1,2‑戊二醇2份、1,2‑己二醇1份和黄原胶0.02份。
[0025] 本发明另一方面提供了一种药用层孔菌发酵产品的制备方法，包括如下步骤：
[0026] 在含药用层孔菌的发酵培养基中接种乳酸菌种子液，发酵处理。
[0027] 在本发明的具体实施方式中，还包括：在所述发酵处理后，进行后处理。进一步的，所述后处理包括：粗滤收集滤液，脱色处理；然后趁热过滤，收集滤液。
[0028] 在本发明的具体实施方式中，所述含药用层孔菌的发酵培养基中，包括MRS培养基、药用层孔菌和水。进一步的，所述药用层孔菌与所述水的质量比为(0.5～10)：100。更进一步的，所述含药用层孔菌的发酵培养基，包括按质量比为(3～6)：(0.5～10)：100的MRS培养基、药用层孔菌和水。
[0029] 在本发明的具体实施方式中，所述含药用层孔菌的发酵培养基的pH为5～9，优选为7～7.5。
[0030] 在本发明的具体实施方式中，所述乳酸菌种子液的接种量为2％～30％。进一步的，所述乳酸菌种子液的接种量为10％～20％。
[0031] 在本发明的具体实施方式中，所述乳酸菌种子液的制备包括：乳酸菌接种于种子培养基中，于37℃培养24～72h。
[0032] 在本发明的具体实施方式中，所述种子培养基中，包括MRS培养基和水。进一步的，所述种子培养基包括按质量比为(3～6)：100的MRS培养基和水。
[0033] 在本发明的具体实施方式中，所述发酵处理的温度为25～45℃；所述发酵处理的时间为12～72h。进一步的，所述发酵处理的温度为30～40℃；所述发酵处理的时间为48～72h。

[0034] 在本发明的具体实施方式中，还包括：将所述后处理得到的滤液与添加剂混合复配。进一步的，所述添加剂包括甘油、黄原胶、1,2‑戊二醇和1,2‑己二醇。
[0035] 本发明又一方面提供了上述任意一种所述药用层孔菌发酵产品在制备护肤品中的应用。
[0036] 在本发明的具体实施方式中，所述护肤品包括控油和/或收缩毛孔的护肤品。
[0037] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0038] (1)本发明的药用层孔菌发酵产品，具有清除ABTS自由基的能力，同时对5α‑还原酶活性具有明显的抑制作用，具有抑制炎症因子TNF‑α、IL‑6表达的作用，具有控油和收缩毛孔的作用，可用于化妆品中。
[0039] (2)本发明通过乳酸菌与药用层孔菌液体双向发酵技术，相比于丁二醇等非极性溶剂进行成分提取的方式，本发明的制备方法更有助于活性成分的溶出，并避免了有机试剂的使用，更加绿色环保。
附图说明
[0040] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0041] 图1为本发明实施例1的药用层孔菌发酵产品的色谱图；
[0042] 图2为本发明实施例1和实施例22的药用层孔菌发酵产品的外观照片；
[0043] 图3为本发明实施例1和对比例4发酵处理后的药用层孔菌滤渣的扫描电镜图；
[0044] 图4为采用样品1对应的面部成像测试照片；
[0045] 图5为采用样品1对应的面部成像测试数据分析结果；
[0046] 图6为采用样品1和样品2后皮肤油脂含量测试结果；
[0047] 图7为本发明实施例1的药用层孔菌发酵产品为对炎症因子TNF‑α的抑制实验测试结果图；
[0048] 图8为本发明实施例1的药用层孔菌发酵产品为对炎症因子IL‑6的抑制实验测试结果图。
具体实施方式
[0049] 下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0050] 本发明一方面提供了一种药用层孔菌发酵产品，在液相色谱检测条件下得到的色谱图中，在保留时间为3.21～3.38min、3.61～3.69min、5.40～5.72min、7.58～8.05min、9.10～9.80min、11.96～12.75min和12.78～14.20min处具有吸收峰；

[0051] 所述液相色谱检测条件包括：
[0052] 色谱柱型号为艾杰尔VensilMPC18.5μm，100A，4.6×250mm；
[0053] 柱温为25℃；
[0054] 紫外检测器波长为214nm；
[0055] 流动相为0.1mol/L的磷酸二氢铵水溶液；采用所述流动相进行等度洗脱15min；流速为0.8mL/min；
[0056] 平衡柱子时间及压力分别为40min和84bar；
[0057] 进样量为5μL。
[0058] 本发明的药用层孔菌发酵产品，在上述液相色谱条件下进行检测，得到相应的色谱图，其中至少具有保留时间在相应范围内的上述7个吸收峰。
[0059] 在本发明的具体实施方式中，所述色谱图中，还包括在保留时间为1.15～3.00min、3.02～3.20min、3.39～3.60min、3.70～3.88min、4.22～4.51min、4.52～
4.66min、4.66～4.84min、5.14～5.39min、5.90～6.22min、6.23～6.78min、7.10～
7.45min、7.45～7.65min、7.96～8.65min、9.81～10.18min、10.18～10.45min、10.45～
10.68min、10.68～11.00min和14.57～15.00min处的吸收峰中的至少一个。

[0060] 在本发明的具体实施方式中，所述药用层孔菌发酵产品中，总糖含量≥12.28mg/mL，蛋白含量≥6.9mg/mL。
[0061] 在本发明的具体实施方式中，所述药用层孔菌发酵产品的pH为6～6.2。
[0062] 如在不同实施方式中，所述药用层孔菌发酵产品的pH可以示例性的为6、6.05、6.1、6.15、6.2等。

[0063] 在本发明的具体实施方式中，所述药用层孔菌发酵产品包括按质量份数计的如下组分：
[0064] 乳酸菌发酵产物62～70份和药用层孔菌提取物1～3份。
[0065] 在本发明的具体实施方式中，所述药用层孔菌发酵产品还包括添加剂。进一步的，所述添加剂包括保湿剂和增稠剂。如所述保湿剂包括甘油、1,2‑戊二醇和1,2‑己二醇中的至少一种，所述增稠剂包括黄原胶。
[0066] 其中，添加剂的种类可根据护肤品的实际需求进行常规调整。
[0067] 在本发明的具体实施方式中，所述药用层孔菌发酵产品包括按质量份数计的如下组分：
[0068] 乳酸菌发酵产物62～70份、药用层孔菌提取物1～3份、甘油25～32份、1,2‑戊二醇1～3份、1,2‑己二醇0.5～1.5份和黄原胶0.01～0.05份。

[0069] 如在不同实施方式中，所述药用层孔菌发酵产品中，按重量份数计，各组分的用量可分别示例性的如下：
[0070] 乳酸菌发酵产物可以为62份、63份、64份、65份、66份、67份、68份、69份、70份；
[0071] 药用层孔菌提取物可以为1份、1.2份、1.5份、1.8份、2份、2.2份、2.5份、2.8份、3份等；
[0072] 甘油可以为25份、26份、27份、28份、29份、30份、31份、32份等；
[0073] 1,2‑戊二醇可以为1份、1.2份、1.5份、1.8份、2份、2.2份、2.5份、2.8份、3份等；
[0074] 1,2‑己二醇可以为0.5份、0.6份、0.7份、0.8份、0.9份、1份、1.1份、1.2份、1.3份、1.4份、1.5份等；

[0075] 黄原胶可以为0.01份、0.02份、0.03份、0.04份、0.05份等。
[0076] 在本发明的具体实施方式中，所述药用层孔菌发酵产品包括按质量份数计的如下组分：
[0077] 乳酸菌发酵产物64.98份、药用层孔菌提取物2份、甘油30份、1,2‑戊二醇2份、1,2‑己二醇1份和黄原胶0.02份。
[0078] 本发明另一方面提供了一种药用层孔菌发酵产品的制备方法，包括如下步骤：
[0079] 在含药用层孔菌的发酵培养基中接种乳酸菌种子液，发酵处理。
[0080] 本发明基于双向发酵技术，药用层孔菌作为发酵基质，乳酸菌作为发酵菌，得到的药用层孔菌发酵产品具有控油和收缩毛孔的作用，且温和不刺激。
[0081] 并且，通过本发明的发酵处理方式，有助于活性成分的溶出，同时避免了有机试剂的使用，更加绿色环保。
[0082] 在本发明的具体实施方式中，所述乳酸菌(Lactococcuslactis)的菌种编号为CICC20408。
[0083] 在本发明的具体实施方式中，还包括：在所述发酵处理后，进行后处理。进一步的，所述后处理包括：对发酵处理后的料液进行粗滤收集滤液，脱色处理；然后趁热过滤，收集滤液。
[0084] 在本发明的具体实施方式中，所述粗滤包括：发酵处理后的料液降温至65℃以下后，采用滤布过滤得到滤液1；然后将滤液1采用纸板过滤，得到滤液2。将滤液2进行后续脱色处理等。其中，所述纸板的平均孔径为15～25μm。
[0085] 在本发明的具体实施方式中，所述脱色处理包括：将所述滤液与活性炭混合，在60±2℃脱色1～2h。进一步的，所述活性炭的用量为所述滤液的质量的1％～3％，如2％。
[0086] 在本发明的具体实施方式中，采用纸板进行所述趁热过滤。进一步的，所述纸板的平均孔径为15～25μm。
[0087] 在本发明的具体实施方式中，还包括：将所述后处理后得到的滤液与添加剂按比例混合调配。进一步的，所述添加剂包括甘油、黄原胶、1,2‑戊二醇和1,2‑己二醇。
[0088] 在本发明的具体实施方式中，所述含药用层孔菌的发酵培养基中，包括MRS培养基、药用层孔菌和水。进一步的，所述药用层孔菌与所述水的质量比为(0.5～10)：100。更进一步的，所述含药用层孔菌的发酵培养基，包括按质量比为(3～6)：(0.5～10)：100的MRS培养基、药用层孔菌和水。
[0089] 当发酵培养基中药用层孔菌的含量在上述范围内，可使发酵处理后的料液中具有较高的乳酸含量。
[0090] 如在不同实施方式中，所述含药用层孔菌的发酵培养基中，所述MRS培养基与所述水的质量比可以示例性的为3：100、3.5：100、4：100、4.5：100、5：100、5.5：100、6：100等，所述药用层孔菌与所述水的质量比可以示例性的为0.5：100、1：100、2：100、3：100、4：100、5：100、6：100、7：100、8：100、9：100、10：100等。

[0091] 在本发明的优选实施方式中，所述药用层孔菌与所述水的质量比为(2～5)：100。
[0092] 在本发明的具体实施方式中，所述含药用层孔菌的发酵培养基的pH为5～9，优选为7～7.5。
[0093] 当含药用层孔菌的发酵培养基的pH在上述条件下，可使发酵处理后的料液中具有较高的乳酸含量。
[0094] 在本发明的具体实施方式中，所述含药用层孔菌的发酵培养基的制备包括：MRS培养基、水和药用层孔菌混合搅拌直至培养基溶解，调节pH至5～9。优选的，调节pH至7～7.5。
[0095] 在实际操作中，可通过常规酸碱试剂对pH进行调节。如可采用柠檬酸钠和氢氧化钠进行调节。
[0096] 在本发明的具体实施方式中，所述乳酸菌种子液的接种量为2％～30％。进一步的，所述乳酸菌种子液的接种量为10％～20％。
[0097] 其中，乳酸菌种子液的接种量是指乳酸菌种子液的质量占含药用层孔菌的发酵培养基的质量的百分比。
[0098] 当乳酸菌种子液的接种量在上述范围内，可使发酵处理后的料液中具有较高的乳酸含量。
[0099] 如在不同实施方式中，所述乳酸菌种子液的接种量可以示例性的为2％、5％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、22％、25％、28％、30％等。

[0100] 在本发明的具体实施方式中，所述乳酸菌种子液的制备包括：乳酸菌接种于种子培养基中，于37℃培养24～72h。
[0101] 如在不同实施方式中，所述乳酸菌种子液的制备中，培养的时间可以示例性的为24h、30h、36h、40h、48h、54h、60h、64h、72h等。

[0102] 在本发明的具体实施方式中，所述种子培养基中，包括MRS培养基和水。进一步的，所述种子培养基包括按质量比为(3～6)：100的MRS培养基和水。
[0103] 如在不同实施方式中，所述种子培养基中，所述MRS培养基和所述水的质量比可以示例性的为3：100、、3.5：100、4：100、4.5：100、5：100、5.5：100、6：100等。
[0104] 在本发明的具体实施方式中，所述乳酸菌种子液的制备中，所述乳酸菌的接种量为0.15％～0.25％，如0.2％。
[0105] 其中，乳酸菌的接种量是指乳酸菌的体积占种子培养基的体积的百分比。
[0106] 在本发明的具体实施方式中，所述发酵处理的温度为25～45℃；所述发酵处理的时间为24～72h。进一步的，所述发酵处理的温度为30～40℃；所述发酵处理的时间为48～72h。

[0107] 采用上述发酵温度及发酵时间，可保证发酵处理后的料液中具有较高的乳酸含量。
[0108] 如在不同实施方式中，所述发酵处理的温度可以示例性的为25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃等；所述发酵处理的时间可以示例性的为24h、28h、32h、36h、40h、48h、56h、60h、64h、72h等。

[0109] 在本发明的具体实施方式中，所述发酵处理过程中，搅拌器的转速为40～60rpm，无通气。其中，搅拌器的转速可以为50rpm等。
[0110] 在本发明的具体实施方式中，所述发酵处理后，先进行121℃高压灭菌，再进行后处理。其中，所述灭菌可采用离位灭菌的方式。
[0111] 在实际操作中，所述含药用层孔菌的发酵培养基以及种子培养基在配制完成后，分别进行灭菌处理。所述灭菌处理的条件包括：121℃高压灭菌15min；所述灭菌可采用离位灭菌的方式。
[0112] 在本发明的具体实施方式中，在所述混合调配后，还包括灭菌处理。进一步的，所述灭菌处理的条件包括：于95～100℃灭菌35～45min，如40min。
[0113] 本发明又一方面提供了上述任意一种所述药用层孔菌发酵产品在制备护肤品中的应用。
[0114] 在本发明的具体实施方式中，所述护肤品包括控油和/或收缩毛孔的护肤品。
[0115] 下述实施例中所采用的乳酸菌为：乳酸菌(Lactococcuslactis)，菌种编号为CICC20408。
[0116] 实施例1
[0117] 本实施例提供了一种药用层孔菌发酵产品的制备方法，包括如下步骤：
[0118] (1)乳酸菌种子液的制备
[0119] 称取MRS培养基19.32g、水400g常温混合搅拌至溶解；
[0120] 平均分装成每份约100mL分别置于250mL三角瓶中，共4瓶；
[0121] 121℃高压灭菌15min，在超净台中冷却至室温备用，为种子培养基；
[0122] 挑取乳酸菌0.2mL于种子培养基中，置于恒温培养箱中，于37℃培养48h，得到一级乳酸菌种子液。
[0123] (2)发酵培养
[0124] 称取MRS培养基144.9g、水3000g、粉碎处理的药用层孔菌粉60g，常温混合搅拌至培养基溶解，调节pH至7.0，得到含药用层孔菌的发酵培养基；
[0125] 将发酵培养基装于5L发酵罐中，插入pH电极，121℃高压灭菌15min，灭菌结束后，放置于试验台，连接好管路后，调节转速为50rpm，无通气；
[0126] 然后按照10％的接种量，将步骤(1)得到的乳酸菌种子液接种于发酵培养基中，在37℃的发酵温度下发酵48h；

[0127] 取出发酵后的料液，121℃高压灭菌15min，灭菌结束后进行后处理。
[0128] (3)后处理
[0129] 将步骤(2)最终得到的料液降温至65℃以下，先采用滤布过滤得到滤液1；然后将滤液1采用平均孔径为25μm的纸板F100再进行过滤，得到滤液2；
[0130] 向滤液2中加入质量为滤液2质量的2％的活性炭，升温至60℃，脱色处理1h；然后趁热采用平均孔径为25μm的纸板F100进行过滤，收集滤液3。
[0131] 将滤液3、甘油、黄原胶按质量比为70：30：0.02复配混合(其中黄原胶预先使用10倍甘油分散均匀)，得到混合物1；将混合物1、1,2‑戊二醇、1,2‑己二醇按质量比为100：2：1复配混合，得到混合物2。
[0132] 将混合物2在95～100℃灭菌处理40min，得到药用层孔菌发酵产品。
[0133] 实施例2～4
[0134] 本实施例参考实施例1的药用层孔菌发酵产品的制备方法，区别仅在于：步骤(2)中，发酵温度不同。
[0135] 实施例1～4的制备方法中，步骤(2)具体采用的发酵温度及步骤(2)得到的料液在灭菌结束后的乳酸含量及SD值具体见表1。
[0136] 表1不同发酵温度对比
[0137]
[0138] 实施例5～9
[0139] 本实施例参考实施例1的药用层孔菌发酵产品的制备方法，区别仅在于：步骤(2)中，发酵时间不同。
[0140] 实施例1、5～9的制备方法中，步骤(2)具体采用的发酵时间及步骤(2)得到的料液在灭菌结束后的乳酸含量及SD值具体见表2。
[0141] 表2不同发酵时间对比
[0142]
[0143] 实施例10～13
[0144] 本实施例参考实施例1的药用层孔菌发酵产品的制备方法，区别仅在于：步骤(2)中，含药用层孔径的发酵培养基的pH不同。
[0145] 实施例1、10～13的制备方法中，步骤(2)具体发酵培养基的pH及步骤(2)得到的料液在灭菌结束后的乳酸含量及SD值具体见表3。
[0146] 表3不同发酵培养基的pH对比
[0147]
[0148] 实施例14～17
[0149] 本实施例参考实施例1的药用层孔菌发酵产品的制备方法，区别仅在于：步骤(2)中，乳酸菌种子液的接种量不同。
[0150] 实施例1、14～17的制备方法中，步骤(2)具体乳酸菌种子液的接种量及步骤(2)得到的料液在灭菌结束后的乳酸含量及SD值具体见表4。
[0151] 表4不同乳酸菌种子液接种量对比
[0152]
[0153]
[0154] 实施例18～21
[0155] 本实施例参考实施例1的药用层孔菌发酵产品的制备方法，区别仅在于：步骤(2)中，含药用层孔菌的发酵培养基的制备中，药用层孔菌的添加量不同(以药用层孔菌与水的质量比计)不同。
[0156] 实施例1、18～21的制备方法中，步骤(2)具体发酵培养基制备中药用层孔菌的添加量及步骤(2)得到的料液在灭菌结束后的乳酸含量及SD值具体见表5。
[0157] 表5不同药用层孔菌添加量对比
[0158]
[0159] 实施例22
[0160] 本实施例参考实施例1的药用层孔菌发酵产品的制备方法，区别仅在于：步骤(3)对应的后处理不同。
[0161] 本实施例的后处理步骤包括：
[0162] 将步骤(2)最终得到的料液降温至65℃以下，先采用平均孔径为25μm的纸板F100过滤得到滤液；然后将滤液采用平均孔径为25μm的纸板F100再进行过滤，得到滤液即为药用层孔菌发酵产品。
[0163] 对比例1
[0164] 对比例1提供了一种药用层孔菌提取产品的制备方法，包括如下步骤：
[0165] (1)称取药用层孔菌10.02g、纯水501.33g混合，置于培养箱中静置培养，培养温度为37℃，培养时间为48h。
[0166] (2)将步骤(1)得到的料液升温处理进行热过滤，采用平均孔径为25μm的纸板F100通过布氏漏斗抽滤，得到粗滤液，记录浊度为7.68FNU(若浊度≤5.0FNU，则无需后续冷精滤，直接进行后续复配步骤)。
[0167] (3)将步骤(2)得到的粗滤液降低温度至40℃以下，然后采用平均孔径为25μm的纸板F100通过布氏漏斗抽滤，控制精滤液的浊度≤5.0FNU，得到澄清透亮的提取物。
[0168] (4)精滤液、甘油、黄原胶按质量比为70：30：0.02复配混合(其中黄原胶预先使用10倍甘油分散均匀)，常温搅拌均匀，得到混合物；将混合物、1,2‑戊二醇、1,2‑己二醇按质量比为100：2：1复配混合，然后在95～100℃灭菌处理30min，得到药用层孔菌发酵产品。

[0169] 对比例2
[0170] 对比例2提供了一种药用层孔菌发酵产品的制备方法，包括如下步骤：
[0171] (1)按料液比1：30(m/m)称取药用层孔菌20.09g、丁二醇600.61g混合，在37℃提取48h，过滤得到药用层孔菌丁二醇提取液。

[0172] (2)向步骤(1)得到的药用层孔菌丁二醇提取液中加入28.98gMRS培养基，于121℃高压灭菌15min；然后按照10％的比例接种乳酸乳球菌种子液(同实施例1)，在37℃静置培养48h；培养结束后，将得到的发酵液于121℃高压灭菌15min。
[0173] (3)将步骤(2)最终得到的料液降温至65℃以下，采用纸板F100通过布氏漏斗抽滤，得到粗滤液；
[0174] 向粗滤液中加入质量为粗滤液质量的2％的活性炭，升温至60℃，脱色处理1h；然后趁热采用平均孔径为25μm的纸板F100进行过滤，收集滤液为澄清透亮提取物。
[0175] 将提取物、甘油、黄原胶按质量比为70：30：0.02复配混合(其中黄原胶预先使用10倍甘油分散均匀)，得到混合物；将混合物、1,2‑戊二醇、1,2‑己二醇按质量比为100：2：1复配混合，然后在95～100℃灭菌处理30min，得到药用层孔菌发酵产品。
[0176] 对比例3
[0177] 对比例3提供了一种药用层孔菌发酵产品的制备方法，包括如下步骤：
[0178] (1)称取MRS培养基9.74g、水200.16g于容器中常温混合搅拌至溶解；121℃高压灭菌15min，在超净台中冷却至室温备用；挑取乳酸菌单菌0.2mL于前述含培养基的容器中。置于恒温培养箱中，于37℃培养48h，得到乳酸菌发酵液。于121℃高压灭菌15min。
[0179] (2)取粉碎处理的药用层孔菌粉和水加入容器中，搅拌均匀；其中药用层孔菌粉的质量为水的质量的4％。置于恒温培养箱中，于37℃培养48h，得到药用层孔菌提取物。
[0180] (3)将步骤(1)灭菌处理后的乳酸菌发酵液和步骤(2)的药用层孔菌提取物按质量比为1：1进行混合，得到混合物。
[0181] (4)将步骤(3)得到的混合物先采用滤布过滤得到滤液；待滤液温度降低至65℃以下采用平均孔径为25μm的纸板F100再进行过滤，收集滤液。
[0182] 向上述得到的滤液中加入质量为滤液质量的2％的活性炭，升温至60℃，脱色处理1h；然后趁热采用平均孔径为25μm的纸板F100进行过滤，收集滤液为澄清透亮提取物。

[0183] 将提取物、甘油、黄原胶按质量比为70：30：0.02复配混合(其中黄原胶预先使用10倍甘油分散均匀)，得到混合物；将混合物、1,2‑戊二醇、1,2‑己二醇按质量比为100：2：1复配混合，然后在95～100℃灭菌处理30min，得到药用层孔菌发酵产品。
[0184] 对比例4
[0185] 对比例4参考实施例1的药用层孔菌发酵产品的制备方法，区别在于：不包括步骤(1)，在步骤(2)中在发酵培养基中直接接种乳酸菌单菌落，每400g发酵培养基中对应接种0.2mL乳酸菌单菌落。

[0186] 实验例1
[0187] 对本发明实施例1的药用层孔菌发酵产品进行液相色谱检测，测试条件为：
[0188] 色谱柱型号为艾杰尔VensilMPC18.5μm，100A，4.6×250mm；
[0189] 柱温为25℃；
[0190] 紫外检测器波长为214nm；
[0191] 流动相为0.1mol/L磷酸二氢铵溶液；采用所述流动相进行等度洗脱15min；流速为0.8mL/min；

[0192] 平衡柱子时间及压力分别为40min和84bar；
[0193] 进样量为5μL。
[0194] 测试得到的色谱图如图1所示，色谱图中对应的吸收峰信息见表6。
[0195] 表6色谱图吸收峰位置信息
[0196]
[0197]
[0198] 实验例2
[0199] 本发明实施例1、对比例1～3的药用层孔菌发酵产品(或提取产品)的理化指标见表7。
[0200] 表7不同药用层孔菌发酵产品的理化指标
[0201]
[0202]
[0203] 备注：表格中“—”说明未对相应项目进行测试
[0204] 从上述测试结果可知，本发明实施例1的的药用层孔菌发酵产品中，总糖含量和蛋白含量分别为12.28mg/mL和6.90mg/mL，远高于对比例1～3的药用层孔菌发酵产品。
[0205] 图2为本发明实施例1和实施例22的药用层孔菌发酵产品的外观照片。图2中的a和b为不同放大倍数的照片，其中a和b的左侧均为实施例22的产品，右侧均为实施例1的产品。
[0206] 从图2中可知，实施例22的颜色比较深且浑浊，在溶液中存在悬浮物，整个体系不稳定；实施例1的产品整体澄清，颜色较浅，体系稳定。综上，实施例1的产品在颜色和稳定性等方面明显优于实施例22。
[0207] 实验例2
[0208] 5α‑还原酶实验
[0209] 5α‑还原酶(5α‑reductase)是依赖还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的膜蛋白酶，其功能为催化睾酮(T)转化为二氢睾酮(DHT)，当DHT在前列腺和皮肤内积累到高水平后会引起许多病理变化，如良性前列腺增生症(BHP)、痤疮、男性秃发、女性多毛等。
[0210] 实验方法：
[0211] 解剖取小鼠肝脏，按1：5比例加入Tris缓冲液0℃匀浆，4℃、10000g离心15min，上清液0℃、55000g离心1h后取上清，4℃放置备用。按照反应体系加入试剂盒样品，药用层孔菌发酵产品使用原液作为第1个浓度，终浓度为20μl/mL，受试品和阳性对照品均做7个2倍梯度稀释，每个稀释度重复4次。37℃温育60min后测定吸光度值下降值ΔA。
[0212]
[0213] 5α‑还原酶反应体系见下表8。
[0214] 表85α‑还原酶反应体系试剂用量
[0215]物质名称 加入量μL 终浓度μmol/L
5α‑还原酶液 10 —
T 5 25
NADPH 10 100
待测物 5 —
PBS 220 —

[0216] 按照上述方法对实施例1、对比例1和对比例4的药用层孔菌发酵产品(或提取产品)进行测试，测试结果见表9。
[0217] 表9不同药用层孔菌发酵产品的5α‑还原酶实验结果
[0218]
[0219] 由上述结果可知，对比例1和对比例4在受试浓度范围内对5α‑还原酶活性均无抑制作用。但对于实施例1的药用层孔菌发酵产品来说，反应终浓度为10μL/mL时，药用层孔菌发酵产品100％抑制5α‑还原酶活性，达到最大有效浓度，在反应终浓度为2.5μL/mL时，药用层孔菌发酵产品对5α‑还原酶活性的抑制率为11％，为最小有效浓度。
[0220] 综上，本发明实施例1的药用层孔菌发酵产品对5α‑还原酶的抑制作用明显高于对比例1和对比例4。
[0221] 进一步对实施例1和对比例4发酵处理后的药用层孔菌滤渣进行扫描电镜测试，测试结果见图3，其中图3中的a和b分别对应对比例4和实施例1发酵处理后的药用层孔菌滤渣。从图中可知，对比例4的滤渣中药用层孔菌表面仍层次分明，原组织结构仍保持一定机械支撑；实施例1的滤渣中药用层孔菌微观结构出现塌陷、粘合，由于生物作用原组织结构被破坏。由此可以得出本发明的方法对药用层孔菌的提取更加充分，且对5α‑还原酶的抑制作用更强。
[0222] ABTS自由基清除测试
[0223] 实验方法：
[0224] 将样品稀释至相应浓度，旋涡混匀。
[0225] 试验按照下表10中各试剂添加量配制反应体系，反应一定时间，734nm波长处测定吸光值。
[0226] 表10反应体系
[0227]添加试剂 受试样品 阳性物 50％乙醇 ABTS溶液
样品组 + ‑ ‑ +
阳性对照组 ‑ + ‑ +
阴性对照组 ‑ ‑ + +
空白对照组 + ‑ + ‑

[0228] 备注：表中“+”代表“添加”，“‑”代表“未添加”。
[0229] ABTS自由基清除率计算公式：
[0230] 清除率＝[(B+C)‑A]/B*100％
[0231] 式中：
[0232] A‑试样溶液与ABTS溶液混合后吸光值；
[0233] B‑50％乙醇与ABTS溶液混合后吸光值；
[0234] C‑50％乙醇与试样溶液混合后吸光值。
[0235] 按照上述方法对实施例1和对比例3的药用层孔菌发酵产品进行测试，测试结果见表11。
[0236] 表11ABTS自由基清除率测试结果
[0237]
[0238] 备注：测试样品浓度为样品最终在反应体系下的浓度
[0239] 由上述结果可知，在浓度为0.05％～1.00％范围内，实施例1的产品对自由基的清除率均优于对比例3。
[0240] 实验例3
[0241] 收缩毛孔测试、控油测试
[0242] 本发明对产品的收缩毛孔及控油功效的测试方案如下表12。
[0243] 表12收缩毛孔及控油功效的测试方案
[0244]
[0245]
[0246] 其中，样品1的组成包括按质量百分数计的：2％药用层孔菌发酵产品(实施例1)、1％AVC(丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物)、0.13％MTI(甲基异噻唑啉酮/碘丙炔醇丁基氨甲酸酯)和余量水；

[0247] 样品2的组成包括：0.13％MTI和余量水。
[0248] 图4和图5分别为采用样品1对应的面部成像测试照片和毛孔面积占比变化情况结果。从上述测试结果可知，与使用前相比，在使用测试样品后15min和30min，样品1测试区域的毛孔面积占比的降低率均高于样品2。本发明实施例1的药用层孔菌发酵产品对毛孔表现出收缩毛孔的趋势。
[0249] 图6为使用样品1和样品2后不同时间的皮肤油脂含量测试结果。从图中可知，本发明实施例1的药用层孔菌发酵产品具有抑制油脂分泌的作用。
[0250] 抑制炎症因子作用测试
[0251] 实验方法：
[0252] (1)接种：将细胞接种至24孔板中，37℃，5％CO2培养箱孵育18～24h。
[0253] (2)配液：根据下图7和图8中受试物和对照的浓度配制。
[0254] (3)给样：待24孔板中细胞铺板生产18～24h后，进行分组给样，每个处理组设3个复孔，于37℃，5％CO2培养箱继续培养18～24h。
[0255] (4)LPS诱导：培养18～24h后，将板内培养基吸出，均加入PBS轻洗一次，空白对照组加入细胞培养基，别的组加入含有LPS的细胞培养基，37℃，5％CO2培养箱继续培养18～24h后收集上清液

[0256] (5)炎症因子含量检测：取各孔细胞上清液，根据ELISA试剂盒操作说明，进行细胞炎症因子含量检测。
[0257] (6)数据处理：试验中取得的各项数据经过Excel软件进行处理与作图。用SPSS17.0进行统计学分析，组件比较采用单因素方差分析(ANOVA)，当P<0.05时判断为差异显著。
[0258] 图7和图8分别为本发明实施例1的药用层孔菌发酵产品为对炎症因子TNF‑α和IL‑6的抑制实验测试结果图。实验结果表明，本发明实施例1的药用层孔菌发酵产品在浓度为
1.25％、2.5％、5％时，对TNF‑α表达有显著性抑制作用；在浓度为1.25％时对IL‑6的表达有显著性抑制作用。综上可知，本发明实施例1的药用层孔菌发酵产品具有抑制炎症因子TNF‑α、IL‑6表达的作用，说明其可以预防或缓解皮肤炎症的发生。

[0259] 综上可知，本发明的药用层孔菌发酵产品对毛孔表现出收缩毛孔的趋势、可以抑制油脂分泌、具有抑制5α还原酶的作用、抑制炎症因子TNF‑α、IL‑6的表达，可用于化妆品中。
[0260] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

专利地区：北京

专利申请日期：2022-12-29

专利公开日期：2023-09-15

专利公告号：CN115844774B