一种用于快速检测鱼类鮰爱德华氏菌的试剂盒及检测方法

专利名称：一种用于快速检测鱼类鮰爱德华氏菌的试剂盒及检测方法

专利类型：发明专利

专利申请（专利权）人：内江师范学院
权利人地址：四川省内江市东桐路705号

专利发明（设计）人：贺扬,王均,陈杰,姜静,王成鑫,向捷,刘用平,黎金玉

专利摘要：本发明提供了一种用于快速检测鱼类鮰爱德华氏菌的试剂盒及检测方法，试剂盒包括经多聚赖氨酸处理过的玻片、兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔lgG、封闭液和显色液。本发明以玻片作为固相载体，大大降低了检测成本；本发明制得的兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体可以识别同一抗原的多个表位，特异性强，灵敏度高；TMB为过氧化物酶底物，本发明使用TMB作为显色液，其可产生一种可溶性的淡蓝色产物，淡蓝色产物吸附在滤纸上，因此可直观的通过肉眼观察到颜色变化。该检测方法对设备要求低，成本低廉，操作简便，绿色环保，且灵敏度高。

主权利要求：一种用于快速检测鱼类鮰爱德华氏菌的试剂盒及检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于快速检测鱼类鮰爱德华氏菌的试剂盒及检测方法。
背景技术
[0002] 随着经济的发展，人们对营养物质的追求更加强烈。鱼富含蛋白质，是良好的营养来源，尤其是黄颡鱼，黄颡鱼(pelteobagrusfulvidraco)属于鲇形目、鲿科、黄颡鱼属，是我国优质的名贵淡水鱼类，俗称黄鼓鱼、黄腊丁等。黄颡鱼富含蛋白质，具有维持钾钠平衡、消除水肿、提高免疫力、调低血压、缓冲贫血的功效，有利于青少年的生长发育。同时，黄颡鱼富含铜，铜是人体健康不可缺少的微量营养索，对于血液、中枢神经和免疫系统、头发、皮肤和骨骼组织以及脑和肝、心等内脏的发育和功能有重要影响，可调节渗透压，维持酸碱平衡和血压正常，增强神经肌肉兴奋性。
[0003] 我国黄颡鱼的人工养殖已经有十几年的历史，2018年全国黄颡鱼的总产量达到50万吨。四川是黄颡鱼养殖的主要养殖地，据《中国渔业统计年鉴》统计，2017年我省黄颡鱼的总产量高达3.05万吨，平均市场价值约6305万元，2018年我省黄颡鱼的总产量高达3.41万吨。随着养殖面积和养殖密度的扩大，黄颡鱼疾病越来越多，其中爱德华氏菌的危害也越来越严重。
[0004] 鮰爱德华氏菌最早在1979年由HawkeJP从发病的斑点叉尾鮰体内分离发现，命名为爱德华氏菌“GA7752”群,1981年将其确定为肠杆菌科爱德华氏菌属的一个新菌种并命名为鮰爱德华氏菌，菌体短杆状，大小为0.5～1μm×2～3μm，具周鞭毛，有动力，在20～30℃具有较弱的运动能力，37℃不具有运动能力，革兰氏染色阴性。在普通培养基上生长缓慢，在温度为25℃～30℃，BHI培养基上需要培养25～30个小时，在TSA培养基上需要培养48小时才能长出针尖大小的菌落，当温度达到37℃则不生长。患病黄颡鱼可呈现急性死亡和慢性死亡2种表现。急性死亡表现为典型的败血症；而慢性死亡鱼体在发病初期时表现为食欲减退，离群独游，但外表无明显症状；随着病情发展，病鱼头顶部出现充血点，并不断扩大，最后在两眼之间的头颅形成充血性病灶，严重时可导致头顶穿孔，头盖骨开裂，甚至露出脑组织；病鱼临死前失去平衡，悬垂在水中，呈“吊水”状，受到刺激时，即作螺旋状快速翻转或不规则游动，继而发生死亡。该病具有传染性强、发病急、防治困难、发病率和死亡率高等特点。给渔业养殖造成了重大的经济损失。
[0005] 传统的诊断方法，耗时长、成本高、操作复杂，对设备要求高。所以准确预防和治疗爱德华氏菌病，即及时、快速、方便的诊断检测方法必不可少。
发明内容
[0006] 针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于快速检测鱼类鮰爱德华氏菌的试剂盒及检测方法，可有效解决现有的诊断方法成本高，操作复杂，对设备要求高和耗时长的问题。
[0007] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] 一种用于快速检测鱼类鮰爱德华氏菌的试剂盒，包括：经多聚赖氨酸处理过的玻片、兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔lgG封闭液和显色液。
[0009] 玻片经过多聚赖氨酸处理后，多聚赖氨酸带正电荷，其可与鮰爱德华氏菌表面所带的负电荷相互作用，产生较强的粘合力，在洗涤过程中可避免细菌脱落。
[0010] 进一步地，经多聚赖氨酸处理过的玻片通过以下方法制得：将多聚赖氨酸进行稀释，然后均匀涂抹在玻片磨砂面，反复涂抹2‑3次，最后自然干燥，制得。
[0011] 进一步地，兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体通过以下方法制备得到：培养鮰爱德华氏菌，并将其制成灭活疫苗，将灭活疫苗免疫兔，免疫四次，于第四次免疫后，采集血液，收集血清，将血清进行IgG纯化，制得兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体；具体过程为：培养鮰爱德8
华氏菌，使用0.6％甲醛灭活细菌，制成浓度为1×10cfu/ml灭活疫苗，将灭活疫苗免疫新西兰兔，免疫四次，于第四次免疫后，采集血液，收集血清，将血清进行IgG纯化，制得兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体。

[0012] 进一步地，封闭液为质量浓度为5％的BSA；具体制备过程为：在无菌条件下，称取5.0g牛血清白蛋白(BSA)，用低盐缓冲液(Trisbase24.2g，NaCl222.2g，吐温205ml，溶解于1L蒸馏水中，调节pH至7.3)溶解后定容到100ml制得，放入4℃保存。

[0013] 进一步地，显色液为TMB溶液。
[0014] 采用上述试剂盒快速检测鱼类鮰爱德华氏菌的方法，包括以下步骤：
[0015] (1)将鮰爱德华氏菌菌液固定于经多聚赖氨酸处理过的玻片上；
[0016] (2)常温下用封闭液对步骤(1)所得玻片进行封闭；
[0017] (3)将兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体涂抹在步骤(2)所得玻片上进行反应；
[0018] (4)将HRP标记的羊抗兔lgG涂抹在步骤(3)所得玻片上进行反应；
[0019] (5)将含有显色液的滤纸贴附于步骤(4)所得玻片上进行显色。
[0020] 进一步地，步骤(1)具体过程为：将鮰爱德华氏菌菌液涂抹于经多聚赖氨酸处理过的玻片上，自然干燥或者经火焰固定，然后再依次采用10％的福尔马林和无水甲醇浸泡玻片。
[0021] 进一步地，步骤(2)中封闭时间为20‑60min；优选为30min。
[0022] 进一步地，步骤(3)中反应温度为35‑40℃，反应时间为40‑60min；优选反应温度为37℃，反应时间为1h。

[0023] 进一步地，步骤(4)中反应温度为35‑40℃，反应时间为40‑60min；优选反应温度为37℃，反应时间为1h。

[0024] 本发明提供的用于快速检测黄颡鱼鮰爱德华氏菌的试剂盒及检测方法，，具有以下有益效果：
[0025] (1)本发明以玻片作为固相载体，大大降低了检测成本；本发明制得的兔抗黄颡鱼鮰爱德华氏菌多克隆抗体可以识别同一抗原的多个表位，特异性强，灵敏度高；TMB为过氧化物酶底物，本发明使用TMB作为显色液，可产生一种可溶性的淡蓝色产物，而将白色规则滤纸片浸泡在TMB单组份染色液中后，贴附于玻片上，进行显色5min，，其淡蓝色产物就会吸附在滤纸上，可直观的通过肉眼观察到颜色变化，该检测方法对设备要求低，成本低廉，操作简便，且灵敏度高，可广泛应用于渔业养殖人员、鱼病工作者和科研者，为提高鱼类尤其是黄颡鱼养殖的经济效益及食品使用安全提供保障。
附图说明
[0026] 图1为爱德华氏菌经革兰氏染色液染色后的镜检图。
[0027] 图2为爱德华氏菌经PCR法测序后的核酸凝胶电泳图。
[0028] 图3为采用本发明方法进行检测的结果图。
具体实施方式
[0029] 实施例1
[0030] 一种用于快速检测黄颡鱼鮰爱德华氏菌的试剂盒，包括：经多聚赖氨酸处理过的玻片(固相载体玻片)、兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔lgG、封闭液和显色液。
[0031] 其中，封闭液为质量浓度为5％的BSA，显色液为TMB溶液。
[0032] 兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体通过以下方法制备得到：
[0033] (1)将鮰爱德华氏菌接种到BHI平板，于27℃培养箱培养24h后，用革兰氏染色法验纯，利用PCR法测序，确定为爱德华氏菌且无其他杂菌后，使用0.6％甲醛灭活细菌，制成浓8
度为1×10cfu/ml灭活疫苗；

[0034] (2)使用步骤(1)制得的灭活疫苗免疫新西兰大白兔，免疫4次，每间隔一周免疫1次，前3次免疫疫苗使用量为1ml，第4次为0.5ml，于第4次免疫后颈动脉放血，采集血液，收集血清；
[0035] (3)将步骤(2)所得血清使用饱和硫酸铵沉淀法进行IgG纯化，并采用玻片凝集法测定IgG的抗体效价1：32。
[0036] 上述经革兰氏染色液染色后的镜检图见图1，由图1可知，染色后的爱德华氏菌在显微镜下观察为红色短杆状。
[0037] PCR法测序后的核酸凝胶电泳图见图2，其中蛋白Marker的分子量大小为2000bp(由上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1位PCR扩增后的爱德华氏菌，泳道2位PCR扩增后的爱德华氏菌，泳道3为对照。
[0038] 采用上述试剂盒快速检测黄颡鱼鮰爱德华氏菌的方法，具体包括以下步骤：
[0039] (1)将多聚赖氨酸和无菌水按质量比为1:10稀释，然后均匀涂抹在玻片磨砂面，反复涂抹2次，最后自然干燥，得经多聚赖氨酸处理过的玻片；
[0040] (2)将鮰爱德华氏菌菌液涂抹于经多聚赖氨酸处理过的玻片上，自然干燥或者经火焰固定5min，然后使用10％的福尔马林浸泡固定玻片10min，再用无水甲醇于‑20℃条件下浸泡固定10min，最后使用质量分数为5％的封闭液即5％的BSA在常温下封闭0‑60min；
[0041] (3)将兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体和0.9％的生理盐水按质量比为1:5稀混合后，涂抹于步骤(2)处理后的玻片上，放于湿盒中以保持反应环境湿度，然后于37℃处理1h，然后用蒸馏水清洗3‑5次；
[0042] (4)将HRP标记的羊抗兔lgG和0.9％的生理盐水按质量比为1:5稀混合后，涂抹于步骤(3)处理后的玻片上，于37℃处理1h，最后用蒸馏水清洗3‑5次；
[0043] (5)将白色规则滤纸片浸泡在TMB单组分染色液中，然后贴附于步骤(4)所得玻片上，显色5min。
[0044] 上述检测方法中，封闭时间为0、5、10、15、30、60min，当封闭时间为5到10min时无法显色，15min时显色效果不佳，30min和60min时的显色效果一致，所以确定最佳时间为30min；步骤(3)中鮰爱德华氏菌和兔抗鮰爱德华氏菌多克隆抗体反应时间为0、5、10、15、
30、60min，当反应时间为5到30min时，无法显色，60min时显色效果最佳。

[0045] 上述检测结果见图3，图3中A图为实验组结果，B为对照组结果即未经双抗夹心法处理的鮰爱德华氏菌对照图。
[0046] 由图3可知，经TMB单组份染色液，通过白色规则滤纸片浸润，贴附于玻片上经过双抗夹心处理的鮰爱德华氏菌，呈现的亮蓝色结果图。

专利地区：四川

专利申请日期：2020-03-13

专利公开日期：2023-08-01

专利公告号：CN111273007B