一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法和菌粉制备方法

专利名称：一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法和菌粉制备方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210676828.3

专利申请（专利权）人：漯河微康生物科技有限公司
权利人地址：河南省漯河市郾城区淞江路西段方汇花园北邻

专利发明（设计）人：方曙光,达旭阳,史祯晖,朱建国

专利摘要：本发明“一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法和菌粉制备方法”属于微生物发酵工程技术领域。所述一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法包括：种子罐发酵、补料分批发酵；其特征在于，种子罐发酵过程中的DO维持大于30％；所述补料分批发酵包括第一阶段发酵和第二阶段发酵；第一阶段发酵过程中的DO维持大于30％，并在DO回升时启动补料；第二阶段发酵降低DO维持10‑20％；所述DO回升指1min内DO上升10％及以上。本发明基于所述发酵方法还提供一种高芽孢数的凝结芽孢杆菌菌粉制备方法，本发明的发酵方法操作简单，芽孢数高，可保存较长时间仍能保持较高的存活率，稳定性好。

主权利要求：
1.一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法，包括：种子罐发酵和补料分批发酵；其特征在于，种子罐发酵过程中的DO维持大于30％；所述补料分批发酵包括第一阶段发酵和第二阶段发酵；第一阶段发酵过程中的DO维持大于30％，并在DO回升时启动补料；第二阶段发酵降低DO维持10‑20％；所述DO回升指1min内DO上升10％及以上；所述启动补料指添加补料培养基；
所述补料培养基包括下述质量百分比的组分：葡萄糖5‑6％，酵母粉1.5‑2％，硫酸铵
0.5‑1％，其余为水；
所述种子罐发酵的条件包括：温度37‑42℃，转速150‑500rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压
0.03‑0.05Mpa、pH5.5‑6.0、时间为6‑8h；
所述种子罐发酵的培养基包括：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉3g/L，葡萄糖25g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.5g/L；
所述补料分批发酵的第一阶段发酵的条件包括：种子罐发酵产物的接种量5％，培养温度37‑42℃，pH5.5‑6.0，转速100‑200rpm，通气量0.6‑1.2vvm，罐压0.05Mpa；
所述第一阶段发酵的培养基包括：蛋白胨15g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖
25g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾4g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钙0.3g/L，消泡剂
0.05％；所述补料分批发酵的第二阶段发酵的条件包括：培养温度37‑42℃，pH7.5‑8.5，转速50‑100rpm，通气量0.3‑0.6vvm，罐压0.05Mpa，DO维持10‑20％，时间16h；
所述补料分批发酵的第二阶段发酵结束后提高温度至60‑75℃，维持10‑30min，然后降温至25℃；
所述凝结芽孢杆菌菌株为BC99菌株，保藏编号为：CGMCCNo.21801。
2.根据权利要求1所述的一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法，其特征在于，还包括：在进行种子罐发酵前对菌株复壮、菌株活化；
所述菌株复壮包括：将冻存的菌株保存液热处理后涂布于固体培养基，挑取上述涂布了菌株保存液的固体培养基上的单菌落再进行热处理并二次涂布固体培养基；所述热处理条件为在80‑95℃热水中进行热处理15‑30min；
所述固体培养基指营养琼脂培养基；
所述菌株活化包括：将复壮的菌株的单菌落接种于营养琼脂培养基，30‑45℃培养18‑
36h；所述营养琼脂培养基包括：葡萄糖2g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15‑20g/L，pH7.0‑7.2。
3.根据权利要求2所述的一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法，其特征在于，还包括：在菌株复壮、菌株活化后、进行种子罐发酵前的摇瓶培养；
所述摇瓶培养包括：将营养琼脂培养基上活化的菌株洗脱接种至摇瓶培养基中振荡培养；所述摇瓶培养基包括：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，氯化钠
5g/L；
所述振荡培养的条件包括：摇瓶转速200r/min，温度30‑45℃，培养时间8‑12h。
4.根据权利要求3所述的一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法，其特征在于，所述种子罐发酵包括一级种子罐发酵和二级种子罐发酵；
所述一级种子罐发酵的接种量为5％，发酵条件包括：温度37‑42℃，转速150‑500rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压0.05Mpa，pH5.5‑6.0，培养时间8h；
所述二级种子罐发酵的条件包括：温度37‑42℃，转速150‑300rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压0.05Mpa，pH5.5‑6.0，培养时间6h；
一级种子罐发酵结束后将一级种子罐的发酵液转移至二级种子罐中进行二级种子罐发酵。
5.一种凝结芽孢杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，包括采用权利要求1‑4任一所述的发酵方法对凝结芽孢杆菌进行发酵。
6.根据权利要求5所述的凝结芽孢杆菌菌粉的制备方法，其特征在于，还包括：补料分批发酵结束后分离发酵液，收集菌泥，采用喷雾干燥方式获得菌粉。
7.根据权利要求6所述的凝结芽孢杆菌菌粉的制备方法，
所述分离发酵液指：用蝶式离心机分离发酵液；
所述喷雾干燥的进风温度180‑220℃，出风温度90‑100℃。 说明书 : 一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法和菌粉制
备方法技术领域[0001] 本发明属于微生物发酵工程技术领域，特别涉及一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法及其菌粉制备方法。背景技术[0002] 益生菌是对人体有益的活性微生物。乳酸菌作为最重要的一类益生菌，其具有改善肠道功能、调节肠道菌群平衡和提高机体健康水平的作用，被广泛地应用于食品、医疗、保健、畜牧业和水产等行业。但乳酸菌对环境的抗逆性弱，乳酸菌活菌制剂普遍存在易失活、货架期短等缺点，极大制约其产业化发展。[0003] 凝结芽孢杆菌是一种能形成芽孢的特殊益生菌，是《可食用菌种名单》中唯一的一株芽孢类乳酸菌。其不仅具备乳酸菌所具有的维持肠道微生态平衡，刺激免疫，提高机体健康水平，促进消化吸收等益生功能，同时由于其能形成芽孢，具有较强的环境抗逆性，耐高温高压、耐酸碱、耐干燥的生物特性。这使得其成为益生菌市场追捧的对象，特别是在食品领域的应用。[0004] 我国对凝结芽孢杆菌的研究起步相对较晚，2016年国家将凝结芽孢杆菌列入可食用菌种名单后，国内才正式开启了凝结芽孢杆菌在食品领域的产业化进程。尤其是在食品领域的应用，至今还主要依赖从国外进口原料。依赖进口不仅受限因素多，生产成本高，而且不利于相关产业的快速发展。而且目前市场上的凝结芽孢杆菌产品普遍存在芽孢数低、稳定性差等问题。因此凝结芽孢杆菌低成本制备工艺是其大规模地应用的前提和关键。目前凝结芽孢杆菌研究主要有固体发酵工艺及液体发酵工艺。固体发酵工艺易污染，对于大规模生产具有相当大的制约性，且难以满足食品生产要求。液体发酵工艺制备凝结芽孢杆菌的方法工艺简单，但芽孢形成率低，成本高，储存期短。发明内容[0005] 针对项目技术存在的上述问题，本发明提供了一种凝结芽孢杆菌及其高芽孢数菌粉的制备方法。本发明是新开发的凝结芽孢杆菌，具有高密度和高产量的特点，有利于降低产品成本，且其芽孢数高、稳定性高，有利于产品应用，对于促进凝结芽孢杆菌在食品领域的应用有非常重要的意义。[0006] 本发明技术方案如下：[0007] 一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法，包括：种子罐发酵、补料分批发酵；其特征在于，种子罐发酵过程中的DO维持大于30％；所述补料分批发酵包括第一阶段发酵和第二阶段发酵；第一阶段发酵过程中的DO维持大于30％，并在DO回升时启动补料；第二阶段发酵降低DO维持10‑20％；所述DO回升指1min内DO上升10％及以上。[0008] 采用具有上述各发酵阶段控制DO水平的特征的发酵方法即可获得高芽孢数、高存活率的菌种发酵产物(例如，菌粉)，其中第二阶段发酵降低DO维持在10‑20％可有效促进芽孢形成。[0009] 所述启动补料指添加补料培养基；[0010] 优选地，所述补料培养基包括下述质量百分比的组分：葡萄糖5‑6％，酵母粉1.5‑2％，硫酸铵0.5‑1％，其余为水。[0011] 所述种子罐发酵的条件包括：温度30‑45℃，转速150‑500rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压0.03‑0.05Mpa、pH5‑7、时间为6‑12h；[0012] 优选地，所述种子罐发酵的条件包括：温度37‑42℃，转速150‑500rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压0.03‑0.05Mpa、pH5.5‑6.0、时间为6‑8h；[0013] 所述种子罐发酵的培养基包括：蛋白胨5‑25g/L，牛肉浸粉5‑25g/L，酵母粉3‑15g/L，葡萄糖10‑30g/L，氯化钠5‑20g/L，磷酸氢二钾1‑5g/L，硫酸镁0.2‑1g/L；[0014] 优选地，所述种子罐发酵的培养基包括：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉3g/L，葡萄糖25g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.5g/L；[0015] 所述补料分批发酵的第一阶段发酵的条件包括：种子罐发酵产物的接种量2‑10％，培养温度30‑45℃，pH5‑7，转速100‑200rpm，通气量0.6‑1.2vvm，罐压0.03‑0.05Mpa；[0016] 优选地，所述第一阶段发酵的条件包括：种子罐发酵产物的接种量5％，培养温度37‑42℃，pH5.5‑6.0，转速100‑200rpm，通气量0.6‑1.2vvm，罐压0.05Mpa；[0017] 所述第一阶段发酵的培养基包括：蛋白胨5‑25g/L，牛肉浸粉5‑25g/L，酵母粉3‑15g/L，葡萄糖10‑30g/L，氯化钠5‑20g/L，磷酸氢二钾1‑5g/L，硫酸镁0.2‑1g/L，硫酸锰0.2‑1g/L，氯化钙0.2‑1g/L，消泡剂0.05‑0.2％；[0018] 优选地，所述第一阶段发酵的培养基包括：蛋白胨15g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖25g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾4g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钙0.3g/L，消泡剂0.05％。[0019] 所述补料分批发酵的第二阶段发酵的条件包括：培养温度30‑45℃，pH5.5‑8.5，转速50‑100rpm，通气量0.3‑0.6vvm，罐压0.03‑0.05Mpa，DO维持10‑20％，时间12‑24h；[0020] 优选地，所述补料分批发酵的第二阶段发酵的条件包括：培养温度37‑42℃，pH7.5‑8.5，转速50‑100rpm，通气量0.3‑0.6vvm，罐压0.05Mpa，DO维持10‑20％，时间16h；[0021] 优选地，所述补料分批发酵的第二阶段发酵结束后提高温度至60‑75℃，维持10‑30min，然后降温至25℃。[0022] 这一步的作用是：短时升温加速芽孢成熟，增强芽孢的耐热性；同时使未形成芽孢的菌体失活，进而提高菌粉芽孢数。[0023] 第二阶段发酵的pH配合DO水平降低维持在10‑20％这一条件可以使芽孢数最大限度地形成。[0024] 所述的一种用于提高凝结芽孢杆菌芽孢数和存活率的发酵方法还包括：在进行种子罐发酵前对菌株复壮、菌株活化；[0025] 优选地，所述菌株复壮包括：将冻存的菌株保存液热处理后涂布于固体培养基；[0026] 优选地，所述菌株复壮包括：挑取上述涂布了菌株保存液的固体培养基上的单菌落再进行热处理并二次涂布固体培养基；[0027] 优选地，所述固体培养基指营养琼脂培养基；[0028] 优选地，所述菌株活化包括：将复壮的菌株的单菌落接种于营养琼脂培养基，30‑45℃培养18‑36h；[0029] 优选地，所述营养琼脂培养基包括：葡萄糖2g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15‑20g/L，pH7.0‑7.2。[0030] 所述的一种用于提高凝结芽孢杆菌芽孢数和存活率的发酵方法还包括：在菌株复壮、菌株活化后、进行种子罐发酵前进行摇瓶培养；[0031] 优选地，所述摇瓶培养包括：将营养琼脂培养基上活化的菌株洗脱接种至摇瓶培养基中振荡培养；[0032] 优选地，所述摇瓶培养基包括：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L；[0033] 优选地，所述振荡培养的条件包括：摇瓶转速200r/min，温度30‑45℃，培养时间8‑12h；[0034] 优选地，所述菌株为凝结芽孢杆菌菌株；所述凝结芽孢杆菌菌株选自：凝结芽孢杆菌BC99菌株、BC10菌株、BC3702菌株。[0035] 所述种子罐发酵包括一级种子罐发酵和/或二级种子罐发酵；[0036] 优选地，所述一级种子罐发酵的接种量为5％，发酵条件包括：温度37‑42℃，转速150‑500rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压0.05Mpa，pH5.5‑6.0，培养时间8h；[0037] 优选地，所述二级种子罐发酵的条件包括：温度37‑42℃，转速150‑300rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压0.05Mpa，pH5.5‑6.0，培养时间6h；[0038] 优选地，一级种子罐发酵结束后将一级种子罐的发酵液转移至二级种子罐中进行二级种子罐发酵。[0039] 一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和存活率的菌粉的制备方法，其特征在于，包括权利要求1‑7任一所述的一种菌种发酵方法对凝结芽孢杆菌进行发酵。[0040] 所述的一种高存活率的菌粉的制备方法还包括：补料分批发酵结束后分离发酵液，收集菌泥，采用喷雾干燥方式获得菌粉。[0041] 优选地，所述分离发酵液指：用蝶式离心机分离发酵液；[0042] 优选地，所述喷雾干燥的进风温度180‑220℃，出风温度90‑100℃；[0043] 优选地，所述凝结芽孢杆菌选自：凝结芽孢杆菌BC99菌株、BC10菌株、BC3702菌株。[0044] 所述凝结芽孢杆菌BC99已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其微生物保藏号为CGMCCNo.21801；分类命名为：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans；保藏时间：2021年02月01日。[0045] 本发明的有益技术效果在于：[0046] 1、根据凝结芽孢杆菌BC99生长阶段和芽孢形成阶段对环境需求不同，设置了不同控制方式。在菌体生长阶段，通过补料方式延长对数生长期，既解除了高浓度底物对菌体生长的抑制，又能短期快速提高菌体密度，同时通过DO判断补料时机，既方便又准确，同时又控制合适的pH、DO，为菌体生长提供最佳生长条件，不会对菌体增殖造成影响。在芽孢形成阶段，通过升高pH，降低DO，提供恶劣的环境，促进芽孢形成，显著提高芽孢形成率，并在发酵结束后，通过升温热激的方式增强芽孢的耐热性，提高菌粉的稳定性。[0047] 2、本发明通过对菌种复壮、培养基、发酵过程及后处理优化，获得了一种高芽孢数的凝结芽孢杆菌菌粉制备方法。制备过程简单，芽孢数高，可保存较长时间仍能保持较高的存活率，稳定性好，显著降低了生产成本，有利于凝结芽孢杆菌产品的推广。具体实施方式[0048] 下面结合具体实施例对本发明的详细内容做进一步描述，但并不以此限制本发明的保护范围。[0049] 生物材料的来源[0050] 凝结芽孢杆菌BC99菌株来自武汉微康益生菌研究院有限公司，是发明专利申请202110285874.6中记载的菌株，其保藏号为CGMCCNo.21801；[0051] BC10菌株为发明专利申请202010538017.8中记载的BC99菌株；[0052] BC3702菌株为发明专利申请202110285874.6中记载的3702菌株；[0053] 第1组实施例、本发明的发酵方法[0054] 本组实施例提供一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和存活率的发酵方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和存活率的发酵方法包括：种子罐发酵、补料分批发酵；其特征在于，种子罐发酵过程中的DO维持大于30％；所述补料分批发酵包括第一阶段发酵和第二阶段发酵；第一阶段发酵过程中的DO维持大于30％，并在DO回升时启动补料；第二阶段发酵降低DO维持10‑20％；所述DO回升指1min内DO上升10％及以上。[0055] 采用具有上述各发酵阶段控制DO水平的特征的发酵方法即可获得高芽孢数、高存活率的菌种发酵产物(例如，菌粉)，其中第二阶段发酵降低DO维持在10‑20％可有效促进芽孢形成。[0056] 在一些实施例中，所述启动补料指添加补料培养基；[0057] 优选地，所述补料培养基包括下述质量百分比的组分：葡萄糖5‑6％，酵母粉1.5‑2％，硫酸铵0.5‑1％，其余为水。[0058] 在另一些实施例中，所述种子罐发酵的条件包括：温度30‑45℃，转速150‑500rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压0.03‑0.05Mpa、pH5‑7、时间为6‑12h；[0059] 优选地，所述种子罐发酵的条件包括：温度37‑42℃，转速150‑500rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压0.03‑0.05Mpa、pH5.5‑6.0、时间为6‑8h；[0060] 所述种子罐发酵的培养基包括：蛋白胨5‑25g/L，牛肉浸粉5‑25g/L，酵母粉3‑15g/L，葡萄糖10‑30g/L，氯化钠5‑20g/L，磷酸氢二钾1‑5g/L，硫酸镁0.2‑1g/L；[0061] 优选地，所述种子罐发酵的培养基包括：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉3g/L，葡萄糖25g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.5g/L；[0062] 在具体的实施例中，所述补料分批发酵的第一阶段发酵的条件包括：种子罐发酵产物的接种量2‑10％，培养温度30‑45℃，pH5‑7，转速100‑200rpm，通气量0.6‑1.2vvm，罐压0.03‑0.05Mpa；[0063] 优选地，所述第一阶段发酵的条件包括：种子罐发酵产物的接种量5％，培养温度37‑42℃，pH5.5‑6.0，转速100‑200rpm，通气量0.6‑1.2vvm，罐压0.05Mpa；[0064] 所述第一阶段发酵的培养基包括：蛋白胨5‑25g/L，牛肉浸粉5‑25g/L，酵母粉3‑15g/L，葡萄糖10‑30g/L，氯化钠5‑20g/L，磷酸氢二钾1‑5g/L，硫酸镁0.2‑1g/L，硫酸锰0.2‑1g/L，氯化钙0.2‑1g/L，消泡剂0.05‑0.2％；[0065] 优选地，所述第一阶段发酵的培养基包括：蛋白胨15g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖25g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾4g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钙0.3g/L，消泡剂0.05％。[0066] 在一些实施例中，所述补料分批发酵的第二阶段发酵的条件包括：培养温度30‑45℃，pH5.5‑8.5，转速50‑100rpm，通气量0.3‑0.6vvm，罐压0.03‑0.05Mpa，DO维持10‑20％，时间12‑24h；[0067] 优选地，所述补料分批发酵的第二阶段发酵的条件包括：培养温度37‑42℃，pH7.5‑8.5，转速50‑100rpm，通气量0.3‑0.6vvm，罐压0.05Mpa，DO维持10‑20％，时间16h；[0068] 优选地，所述补料分批发酵的第二阶段发酵结束后提高温度至60‑75℃，维持10‑30min，然后降温至25℃。[0069] 这一步的作用是：短时升温加速芽孢成熟，增强芽孢的耐热性；同时使未形成芽孢的菌体失活，进而提高菌粉芽孢数。[0070] 第二阶段发酵的pH配合DO水平降低维持在10‑20％这一条件可以使芽孢数最大限度地形成。[0071] 在进一步的实施例中，所述的一种用于提高凝结芽孢杆菌芽孢数和存活率的发酵方法还包括：在进行种子罐发酵前对菌株复壮、菌株活化；[0072] 优选地，所述菌株复壮包括：将冻存的菌株保存液热处理后涂布于固体培养基；[0073] 优选地，所述菌株复壮包括：挑取上述涂布了菌株保存液的固体培养基上的单菌落再进行热处理并二次涂布固体培养基；[0074] 优选地，所述固体培养基指营养琼脂培养基；[0075] 优选地，所述菌株活化包括：将复壮的菌株的单菌落接种于营养琼脂培养基，30‑45℃培养18‑36h；[0076] 优选地，所述营养琼脂培养基包括：葡萄糖2g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15‑20g/L，pH7.0‑7.2。[0077] 在更进一步的实施例中，所述的一种用于提高凝结芽孢杆菌芽孢数和存活率的发酵方法，其特征在于，还包括：在菌株复壮、菌株活化后、进行种子罐发酵前进行摇瓶培养；[0078] 优选地，所述摇瓶培养包括：将营养琼脂培养基上活化的菌株洗脱接种至摇瓶培养基中振荡培养；[0079] 优选地，所述摇瓶培养基包括：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L；[0080] 优选地，所述振荡培养的条件包括：摇瓶转速200r/min，温度30‑45℃，培养时间8‑12h；[0081] 优选地，所述菌株为凝结芽孢杆菌菌株；所述凝结芽孢杆菌菌株选自：凝结芽孢杆菌BC99菌株、BC10菌株、BC3702菌株。[0082] 在一些实施例中，所述种子罐发酵包括一级种子罐发酵和二级种子罐发酵；[0083] 优选地，所述一级种子罐发酵的接种量为5％，发酵条件包括：温度37‑42℃，转速150‑500rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压0.05Mpa，pH5.5‑6.0，培养时间8h；[0084] 优选地，所述二级种子罐发酵的条件包括：温度37‑42℃，转速150‑300rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压0.05Mpa，pH5.5‑6.0，培养时间6h；[0085] 优选地，一级种子罐发酵结束后将一级种子罐的发酵液转移至二级种子罐中进行二级种子罐发酵。[0086] 第2组实施例、本发明菌粉的制备方法[0087] 本组实施例提供一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和存活率的菌粉的制备方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和存活率的菌粉的制备方法包括第1组实施例任一项所提供的一种菌种发酵方法对凝结芽孢杆菌进行发酵。[0088] 在进一步的实施例中，所述的一种高存活率的菌粉的制备方法还包括：补料分批发酵结束后分离发酵液，收集菌泥，采用喷雾干燥方式获得菌粉。[0089] 优选地，所述分离发酵液指：用蝶式离心机分离发酵液；[0090] 优选地，所述喷雾干燥的进风温度180‑220℃，出风温度90‑100℃；[0091] 优选地，所述目标菌株为凝结芽孢杆菌BC99菌株。[0092] 实验例1、凝结芽孢杆菌BC99的复壮[0093] (1)将凝结芽孢杆菌BC99制成菌悬液进行梯度稀释，选择合适稀释梯度的菌悬液涂布平板，37‑42℃培养48h；[0094] (2)挑取形成芽孢的单菌落制成菌悬液，在80‑95℃热水中进行热处理15‑30min；[0095] (3)将热处理后的菌悬液进行梯度稀释，选择合适稀释梯度的菌悬液涂布平板，37‑42℃培养36h；[0096] (4)挑取形成芽孢的单菌落制成菌悬液，在80‑95℃热水中进行二次热处理15‑30min；[0097] (5)取热处理后的菌悬液进行梯度稀释，选择合适稀释梯度的菌悬液涂布平板，37‑42℃培养24h，形成芽孢的单菌落为快速产孢的凝结芽孢杆菌。[0098] 实验例2、100L发酵罐的菌粉制备[0099] 本实验例以100L发酵罐为例，提供一种高芽孢数凝结芽孢杆菌发酵及菌粉制备方法，包括如下步骤：[0100] (1)将复壮的凝结芽孢杆菌单菌落接种至营养琼脂斜面上，37℃培养24‑36h。营养琼脂培养基组成为：葡萄糖2g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15‑20g/L，pH7.0‑7.2，121℃灭菌15min。[0101] (2)将活化好的菌种洗脱接种至摇瓶，振荡培养8‑12h。摇瓶培养基配方：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L，调节pH7.0‑7.2，121℃灭菌30min。500mL摇瓶装液量为100mL。培养条件：摇瓶转速200r/min，温度37℃。[0102] (3)将摇瓶培养种子接种到种子罐，接种量5％，种子罐体积5L，装液60％。种子罐培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉3g/L，葡萄糖25g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，121℃灭菌30min。培养条件：温度37℃，转速150‑500rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压0.03‑0.05Mpa，DO维持大于30％，pH控制为5.5‑6.0，培养时间8h。[0103] (4)将步骤3的种子液接种至100L罐进行补料分批发酵，发酵培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖25g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钙0.3g/L，消泡剂0.05％，121℃灭菌30min。装液量为60％。第一阶段发酵控制条件：接种量5％，培养温度37℃，pH控制为5.5‑6.0，转速100‑250rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压0.03‑0.05Mpa，DO控制大于30％，当DO回升时进行补料，补料培养基组成：葡萄糖5％，酵母粉2％，硫酸铵0.5％，115℃灭菌30min，补料周期12h。第二阶段发酵控制条件：培养温度37℃，pH控制为7.5‑8.5，转速50‑100rpm，通气量0.3‑0.6vvm，罐压0.03‑0.05Mpa，DO维持10‑20％，该阶段培养时间16h。当发酵结束后提高温度至75℃，维持30min。所述DO回升指：当转速、通气量、罐压不变下，1minDO上升10％及以上。[0104] (5)通过蝶式离心机分离发酵液，收集菌泥，采用喷雾干燥方式获得凝结芽孢杆菌11菌粉。喷雾干燥塔进风温度200℃，出风温度90℃。经检测菌粉芽孢数为9.5×10 cfu/g。芽孢数检测培养组成：葡萄糖5.0g、蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠0.25g、无水氯化钙0.15g、一水硫酸锰0.1g、L‑半胱氨酸盐酸盐0.5g、琼脂粉15.0g，定容至1000mL，调节pH至5.0‑5.5。[0105] (6)取200g菌粉用铝箔袋封口，放置于37℃培养箱存放，每6个月检测菌粉芽孢数，计算存放不同时间菌粉存活率。不同菌株菌粉芽孢数和存活率数据分别如下表1和表2所示：[0106] 表1.不同凝结芽孢杆菌菌株制备的菌粉芽孢数[0107][0108][0109] 表2.不同BC菌株制备的菌粉储存稳定性[0110][0111] (7)BC99菌株菌粉存放3年存活率仍有90％，如此高的存活率不仅与菌株自身特性有关，最主要的原因还是在于本发明的菌粉制备工艺。[0112] 实验例3、20T发酵罐的菌粉制备[0113] 本实验例以20T发酵罐为例，提供一种高芽孢数凝结芽孢杆菌发酵及菌粉制备方法，包括如下步骤：[0114] (1)将复壮的凝结芽孢杆菌单菌落接种至营养琼脂斜面上，37℃培养24‑36h。营养琼脂培养基组成为：葡萄糖2g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15‑20g/L，pH7.0‑7.2，121℃灭菌15min。[0115] (2)将活化好的菌种洗脱接种至摇瓶，振荡培养8‑12h。摇瓶培养基配方：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，氯化钠5g/L，调节pH7.0‑7.2，121℃灭菌30min。500mL摇瓶装液量为150mL。培养条件：摇瓶转速200r/min，温度37℃。[0116] (3)将摇瓶培养种子接种到种子罐，接种量5％，一级种子罐体积50L，装液量60％。培养条件：温度37℃，转速150‑500rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压0.05Mpa，DO维持大于30％，pH控制为5.5‑6.0，培养时间8h。将培养好的一级种子液移种至二级种子罐，二级种子罐体积1000L，装液量为60％，培养条件：温度37℃，转速150‑300rpm，通气量0.6‑1.0vvm，罐压0.05Mpa，DO维持大于30％，pH控制为5.5‑6.0，培养时间6h。种子罐培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉3g/L，葡萄糖25g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.5g/L，121℃灭菌30min。所述移种指将全部的一级种子液转移至二级种子罐。[0117] (4)将步骤3的种子液接种至20L罐进行分批补料分批发酵，发酵培养基组成：蛋白胨15g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖25g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾4g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，氯化钙0.3g/L，消泡剂0.05％，121℃灭菌30min。第一阶段发酵控制条件：接种量5％，培养温度37℃，pH控制为5.5‑6.0，转速100‑200rpm，通气量0.6‑1.2vvm，罐压0.05Mpa，DO控制大于30％，当DO开始回升时及时进行补料操作，补料培养基组成：葡萄糖6％，酵母粉1.5％，硫酸铵1％，115℃灭菌30min，补料周期12h。第二阶段发酵控制条件：培养温度37℃，pH控制为7.5‑8.5，转速50‑100rpm，通气量0.3‑0.6vvm，罐压0.05Mpa，DO维持10‑20％，该阶段培养时间16h。当发酵结束后提高温度至75℃，维持30min。[0118] (5)通过蝶式离心机分离发酵液，收集菌泥，采用喷雾干燥方式获得凝结芽孢杆菌11菌粉。喷雾干燥塔进风温度200℃，出风温度90℃。经检测菌粉芽孢数为8.2×10 cfu/g。[0119] 以上所述仅为本发明的优选实验例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

专利地区：河南

专利申请日期：2022-06-16

专利公开日期：2024-07-16

专利公告号：CN115261260B