一种促进云南独蒜兰组培苗快速成苗的方法发明专利

专利名称：一种促进云南独蒜兰组培苗快速成苗的方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310558545.3

专利申请（专利权）人：云南省农业科学院高山经济植物研究所
权利人地址：云南省丽江市古城区义正街古路坞下段33号

专利发明（设计）人：徐春莲,和寿星,郭承刚,汤王外,黄杏娥,郭应杰,杨文宏,曹杨,王玲,苏畅

专利摘要：本发明公开了一种促进云南独蒜兰组培苗快速成苗的方法，涉及独蒜兰培养技术领域。本发明包括培养云南独蒜兰获得蒴果，并选择成熟且未开裂的蒴果作为外植体；对作为外植体的蒴果进行消毒杀菌；取出无菌蒴果的种子并将其播于培养基上，完成接种后将其置于培养室中培养，诱导种子萌发阶段避光培养，待种子萌发出原始球茎后采用光照培养；播种15‑20d后开始萌发产生原球茎，随后转至光照培养，在播种40d后形成苗和原球茎混杂的块状物；把云南独蒜兰组培苗经过除培养基、消毒和分拣处理，置于炼苗棚中进行炼苗培养。本发明通过优化改良配方，使云南独蒜兰组培苗快速生根，从而加快云南独蒜兰组培苗出苗速度，提高云南独蒜兰炼苗成活率和成苗率。

主权利要求：
1.一种促进云南独蒜兰组培苗成苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将4‑5月开花的云南独蒜兰进行自交授粉，授粉成功后继续培养4‑5个月获得蒴果，选择成熟且未开裂的蒴果作为外植体；
步骤二、用适量清水加洗洁剂洗涤蒴果30min，然后用无菌水冲净蒴果表面的洗洁精，在超净工作台上将洗涤后的蒴果用75%的酒精进行表面消毒处理30s，再用0.1%的氯化汞消毒16min，然后用无菌水冲洗5‑6次，用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分后备用；
步骤三、取出无菌蒴果的种子，再将种子播于培养基上并分散均匀，完成接种后将其置于培养室中培养，诱导种子萌发阶段避光培养，待种子萌发出原始球茎后采用光照培养；
此阶段所用培养基由以下几种组分构成：1/2MS+1.5mg/LNAA，0.5mg/L6‑BA，
1.0g/L水解酪蛋白，1.0g/L炭粉，30.0g/L蔗糖，5.0g/L琼脂，该培养基的pH为6.0；
步骤四、原球茎增殖、生根培养：在播种15‑20d后开始萌发，出现白色类原球茎，然后转至光照培养，在播种40天后极少数开始分化出叶，同时原球茎继续增殖，形成苗和原球茎混杂的块状物；
此阶段所用培养基由以下几种组分构成：1/2MS+1.5mg/LIBA，1.0mg/LNAA，1.0g/L水解酪蛋白，1.0g/L炭粉，30.0g/L蔗糖，5.0g/L琼脂，50.0g/L香蕉泥，50.0g/L土豆泥，该培养基的pH为6.0；在所述培养基上培养15d后有根系长出；
步骤五、把优化培养基培养好的云南独蒜兰组培苗经过除培养基、消毒和分拣处理，置于炼苗棚中进行炼苗培养。
2.根据权利要求1所述的一种促进云南独蒜兰组培苗成苗的方法，其特征在于，所述步骤三中诱导种子萌发阶段避光培养的温度控制在25℃；
待种子萌发出原始球茎后采用光照培养时的温度控制在25℃，光照时间控制在8h/d，光照强度控制在1500lx。
3.根据权利要求1所述的一种促进云南独蒜兰组培苗成苗的方法，其特征在于，所述步骤四中光照培养的具体条件为：温度控制在25℃，光照时间控制在10h/d，光照强度控制在
1500lx。 说明书 : 一种促进云南独蒜兰组培苗快速成苗的方法技术领域[0001] 本发明属于独蒜兰培养技术领域，特别是涉及一种促进云南独蒜兰组培苗快速成苗的方法。背景技术[0002] 云南独蒜兰〔Pleioneyunnanensis(Rolfe)Rolfe〕，为兰科独蒜兰属的一种半附生兰，药用价值和观赏园艺价值高，国内主要产于四川、贵州和云南，其干燥假鳞茎为珍稀药材山慈菇，习称“冰球子”。云南独蒜兰具有清热解毒、止咳化痰和止血生肌的功效，主治肺结核，百日咳，气管炎，痈肿，消化道出血，外伤出血等，近年来由于其含有抗肿瘤的活性，云南独蒜兰市场需求量不断增加，但其种子小，自然状态下很难成功萌发及生长，加之野生资源破坏严重，所以通过组织培养是获得大量完整再生植株的重要技术手段，亦是缓解资源环境压力的主要途径。[0003] 近年来有不少关于独蒜兰组织培养方面的报道，但是组培出来的种苗在炼苗过程中出现的问题还是较多，最根本的原因是其炼苗成活率和成苗率低，从而影响其种苗质量和产业化发展。[0004] 现有的云南独蒜兰都是与传统的植物组培方式一致，通过无菌萌发、增殖培养、生根培养、炼苗等步骤的培育，获得云南独蒜兰组培苗；但是在组培过程中其组培苗假鳞茎过小，而叶片和须根较少，从而影响炼苗成活率和成苗率，同时，通过常规组培方式培育出来的云南独蒜兰组培苗，通常最少也要转接2至3次才能达到炼苗水平要求，培养室培育时间长、成本高，从而易错过炼苗的最佳物候期。发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种促进云南独蒜兰组培苗快速成苗的方法，通过优化改良配方，使云南独蒜兰组培苗快速生根，增加根系数量促进假鳞茎膨大，从而加快云南独蒜兰组培苗出苗速度，提高云南独蒜兰炼苗成活率和成苗率。[0006] 为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：[0007] 本发明为一种促进云南独蒜兰组培苗快速成苗的方法，包括如下步骤：[0008] 步骤一、培养云南独蒜兰获得蒴果，并选择成熟且未开裂的蒴果作为外植体；[0009] 步骤二、对作为外植体的蒴果进行消毒杀菌，用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分进行备用；[0010] 步骤三、取出无菌蒴果的种子，再将种子播于培养基上并分散均匀，完成接种后将其置于培养室中培养，诱导种子萌发阶段避光培养，待种子萌发出原始球茎后采用光照培养；[0011] 此阶段所用培养基由以下几种组分构成：1.5mg/L的1/2MS+NAA，0.5mg/L6‑BA，1.0g/L水解酪蛋白，1.0g/L炭粉，30.0g/L蔗糖，5.0g/L琼脂，该培养基的pH为6.0；[0012] 步骤四、播种15‑20d后开始萌发产生白色原球茎，随后转至光照培养，在播种40d后形成苗和原球茎混杂的块状物；[0013] 此阶段所用培养基由以下几种组分构成：1.5mg/L的1/2MS+IBA，1.0mg/LNAA，1.0g/L水解酪蛋白，1.0g/L炭粉，30.0g/L蔗糖，5.0g/L琼脂，50.0g/L香蕉泥，50.0g/L土豆泥，该培养基的pH为6.0；[0014] 步骤五、把优化培养基培养好的云南独蒜兰组培苗经过除培养基、消毒和分拣处理，置于炼苗棚中进行炼苗培养。[0015] 优选地，所述步骤一具体为：将4‑5月开花的云南独蒜兰进行自交授粉，授粉成功后继续培养4‑5个月获得蒴果，选择成熟且未开裂的蒴果作为外植体。[0016] 优选地，所述步骤二具体为：用适量清水加洗洁剂洗涤蒴果30min，然后用无菌水冲净蒴果表面的洗洁精，在超净工作台上将洗涤后的蒴果用75％的酒精进行表面消毒处理30s，再用0.1％的氯化汞消毒16min，然后用无菌水冲洗5‑6次，用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分后备用。[0017] 优选地，所述步骤三中诱导种子萌发阶段避光培养的温度控制在25℃；[0018] 待种子萌发出原始球茎后采用光照培养时的温度控制在25℃，光照时间控制在8h/d，光照强度控制在1500lx。[0019] 优选地，所述步骤四中光照培养的具体条件为：温度控制在25℃，光照时间控制在10h/d，光照强度控制在1500lx。[0020] 本发明具有以下有益效果：[0021] 本发明通过优化培养基，使得云南独蒜兰组培苗减少转接2‑3次，缩短培养室培养时间3个月，云南独蒜兰植株须根长度增长60％，须根数量增加70％，叶片长度增加64％，株高提高66.7％，叶片数量增加50％，麟茎大小增加62.5％，培育100天可以到达炼苗标准，从而到达节约成本，提前炼苗时间的目的，鳞茎膨大明显，炼苗成活率提高14.9％，成苗率提高10.5％，有效解决独蒜兰炼苗成活率和成苗率低的问题，提高了云南独蒜兰种苗经济效益，为云南独蒜兰今后大规模种植提供优质种苗打下基础，不会导致错过炼苗的最佳物候期。[0022] 当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。具体实施方式[0023] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。[0024] 本发明为一种促进云南独蒜兰组培苗快速成苗的方法，包括如下步骤：[0025] 步骤一、获得外植体：把4‑5月开花的云南独蒜兰〔Pleioneyunnanensis(Rolfe)Rolfe〕进行自交授粉，培养4‑5个月获得蒴果，以云南独蒜兰成熟且未开裂的蒴果为外植体。[0026] 步骤二、外植体消毒：①加适量清水和洗洁剂用毛刷洗涤蒴果，然后用自来水冲洗30min；②在超净工作台上先将洗涤后的蒴果用75％的酒精表面消毒处理30S，再用0.1％的升汞(HgCl2)消毒16min，之后用无菌水冲洗5‑6次，最后用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分备用。[0027] 步骤三、接种培养：超净工作台上用消毒后的手术刀将消毒处理过的蒴果两端切除，纵向剖开蒴果，将种子均匀撒于培养基上。完成接种后将其置于培养室培养，此阶段的培养条件为：诱导种子萌发阶段避光培养，温度为25℃，待种子萌发出原始球茎后采用光照培养，温度为25℃，光照时间8h/d，光照强度1500lx。此阶段培养基为：1/2MS+NAA(1.5mg/L)+6‑BA(0.5mg/L)+水解酪蛋白(1g/L)+炭粉(1g/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(5g/L)，pH＝6.0。[0028] 步骤四、原球茎增殖、生根培养：在播种15‑20d后开始萌发，出现白色类原球茎，然后转至光照培养，白色原球茎逐渐形成黄绿色芽点，原球茎逐渐长大，颜色转绿，在播种40天后极少数开始分化出叶，同时原球茎继续增殖，形成苗和原球茎混杂的块状物，此时的原球茎经过继代培养，有利于原球茎的增殖，生长速度加快。[0029] 此阶段的培养条件为：温度25℃，光照时间10h/d，光照强度1500lx。此阶段的培养基为：1/2MS+IBA(1.5mg/L)+NAA(1.0mg/L)+水解酪蛋白(1g/L)+炭粉(1g/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(5g/L)+香蕉泥(50g/L)+土豆泥(50g/L)，pH＝6.0。在此培养基上培养15d后就可以看见有根系长出。继续培育30d后根系长度达到3cm，肉眼可见瓶底有20‑25条根系，鳞茎最大达0.2mm，云南独蒜兰组培苗植株高度达到7cm。而传统培育的不见根系长出，鳞茎最大也只有0.1mm左右，植株高度最高的也只有4cm。[0030] 转接100d后，云南独蒜兰组培苗通过优化培养基后其植株高度达15cm，鳞茎达0.8mm，根系长达5cm，已布满瓶底，而传统培育的株高5cm，鳞茎最大0.3mm，根只有零星几根，最长2cm。[0031] 通过优化培养基，使得云南独蒜兰组培苗减少转接2‑3次，缩短培养室培养时间3个月，云南独蒜兰植株须根长度增长60％，须根数量增加70％，叶片长度增加64％，株高提高66.7％，叶片数量增加50％，麟茎大小增加62.5％，培育100天可以到达炼苗标准，从而到达节约成本，提前炼苗时间的目的，效果见表1所示。[0032] 表1，优化改良培养基和传统培养基的效果对比[0033][0034] 步骤五、炼苗：[0035] 把用优化培养基培育好的云南独蒜兰组培苗经过除培养基、消毒、分拣等步骤，在炼苗棚中进行炼苗培养，通过炼苗对比，炼苗成活率为94％，成苗率为95％，而传统培育的进行炼苗，炼苗成活率达到80％，成苗率达到85％。[0036] 表2，优化培育与传统培育成活率和成苗率对比效果[0037]测量项目 成活率(％) 成苗率(％)优化培育 94 95传统培育 80 85通过本发明，云南独蒜兰鳞茎膨大明显，炼苗成活率提高14.9％，成苗率提高10.5％(见表2)，有效解决独蒜兰炼苗成活率和成苗率低的问题，为云南独蒜兰今后大规模种植提供优质种苗打下基础。[0038] 上述各个培养基中的MS指基本培养基，其是只含有无机盐、蔗糖、维生素和水等最基本成分的合成培养基；NAA指人工合成激素萘乙酸，6‑BA指6‑苄氨基嘌呤，IBA指吲哚‑3‑丁酸。[0039] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。[0040] 以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

专利地区：云南

专利申请日期：2023-05-17

专利公开日期：2024-07-19

专利公告号：CN116548310B