跨膜蛋白Tmem63b在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物中的应用

专利名称：跨膜蛋白Tmem63b在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210856218.1

专利申请（专利权）人：南通大学
权利人地址：江苏省南通市啬园路9号

专利发明（设计）人：刘晓宇,孙诚,姜育辉

专利摘要：本发明公开了一种跨膜蛋白Tmem63b在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物中的应用。本发明提供了跨膜蛋白Tmem63b的新用途，且效果好；研究机理的方法简便，准确。

主权利要求：
1.一种跨膜蛋白Tmem63b在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物中的应用，其特征是：所述周围神经脱髓鞘类疾病是坐骨神经脱髓鞘疾病。 说明书 : 跨膜蛋白Tmem63b在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物
中的应用技术领域[0001] 本发明涉及一种跨膜蛋白Tmem63b的药物用途。背景技术[0002] 目前治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物，在治疗效果等方面存在一定缺陷，需要进一步寻找开发新的药物。跨膜蛋白Tmem63b的作用尚未有可以制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物的报道。发明内容[0003] 本发明的目的在于提供一种效果好的跨膜蛋白Tmem63b在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物中的应用。[0004] 本发明的技术解决方案是：[0005] 一种跨膜蛋白Tmem63b在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物中的应用。[0006] 所述的跨膜蛋白Tmem63b在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物中的应用，是2+在制备作为Ca 依赖性脂肪翻转酶，通过调节细胞膜磷脂酰丝氨酸的分布，进而影响受损外周神经修复的药物中的应用。[0007] 本发明提供了跨膜蛋白Tmem63b的新用途，且效果好；研究机理的方法简便，准确。附图说明[0008] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。[0009] 图1是周围神经受损的Tmem63b敲除小鼠运动恢复能力下降示意图。相较于野生型‑/‑小鼠，敲除小鼠的坐骨神经功能指数(SFI)在不同的时间段均较小，Tmem63b ：敲除小鼠；WT：野生型小鼠。[0010] 图2是周围神经受损的Tmem63b敲除小鼠运动恢复能力下降示意图。相较于野生型‑/‑小鼠，敲除小鼠的神经传导速率和转棒时间均较差。Tmem63b ：敲除小鼠；WT：野生型小鼠；Proxmial：损伤近端坐骨神经组织，Distal：损伤远端坐骨神经组织，NCV：神经传导速率。[0011] 图3是Tmem63b敲除后的外周神经夹伤小鼠再生髓鞘结构异常示意图。相较于神经‑/‑夹伤的野生型小鼠，神经受损14天后的Tmem63b敲除小鼠再生髓鞘结构畸形。Tmem63b ：敲除小鼠；WT：野生型小鼠。[0012] 图4是周围神经受损的Tmem63b过表达小鼠运动恢复能力改善示意图。相较于野生型小鼠，过表达小鼠的坐骨神经损伤14天后功能指数(SFI)增加。Tmem63b：过表达小鼠，WT：野生型小鼠。[0013] 图5是周围神经受损的Tmem63b过表达小鼠运动恢复能力改善示意图。相较于野生型小鼠，过表达小鼠坐骨神经损伤14天后的神经传导速率和转棒时间均较好。Proxmial：损伤近端坐骨神经组织，Distal：损伤远端坐骨神经组织，NCV：神经传导速率.Tmem63b：过表达小鼠，WT：野生型小鼠。[0014] 图6是Tmem63b过表达后的外周神经夹伤小鼠再生髓鞘结构异常示意图。相较于神经夹伤的野生型小鼠，神经受损14天后的Tmem63b过表达小鼠再生髓鞘结构增厚。Tmem63b：过表达小鼠，WT：野生型小鼠。[0015] 图7是细胞免疫荧光实验验证Tmem63b蛋白定位示意图。pLX304‑Tmem63b‑V5表达质粒转染HEK293T细胞24小时，并通过蔡司荧光显微镜确定Tmem63b蛋白定位于细胞膜上。[0016] 图8是Tmem63b蛋白在Ca2+作用下促进囊泡小体Vesicle的形成示意图。脂质染料2+FM4–64染色15分钟后，荧光显微镜检测发现Tmem63b蛋白在Ca 存在下可形成囊泡小体。A.2+ 2+相比于未添加Ca 组，Ca 添加促进囊泡小体的形成；B.囊泡小体放大图；Vesicle：囊泡小体。[0017] 图9是Tmem63b蛋白只有在Ca2+作用下改变细胞膜磷脂酰丝氨酸的分布示意图。Annexin5：细胞膜外的磷脂酰丝氨酸特异性染料；Alexa488：二抗显绿色；Alexa568：二抗显红色；PS：磷脂酰丝氨酸；Vesicle：囊泡小体；DAPI：细胞核染料。具体实施方式[0018] 一种跨膜蛋白Tmem63b在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物中的应用。[0019] 所述的跨膜蛋白Tmem63b在制备治疗周围神经脱髓鞘类疾病的药物中的应用，是2+在制备作为Ca 依赖性脂肪翻转酶，通过调节细胞膜磷脂酰丝氨酸的分布，进而影响受损外周神经修复的药物中的应用。[0020] 一、实验材料[0021] 1、实验试剂及过表达质粒[0022] 细胞培养所用的血清，培养基，抗生素，多聚赖氨酸，多聚甲醛，CaCl2，FM4‑64等试剂购自Sigma公司，lipofectamine2000购自Invitrogen公司，Annexin5购自Thermo公司，DAPI，Anti‑V5一抗，小鼠二抗购自CST公司，pLX304‑Tmem63b‑V5过表达质粒购自Addgene公司。[0023] 2、细胞培养[0024] 细胞系HEK293T所用的培养基是完全培养基，成分是：89％的DMEM高糖培养基，10％的胎牛血清(FBS)，1％的链霉素和青霉素双抗生素(PS)。该细胞放置在37℃，5％的CO2培养箱中进行培养，根据细胞生长状态进行传代培养。[0025] 3、细胞处理[0026] HEK293T细胞接种到多聚赖氨酸(PLL)包被的方形盖玻片上，次日待细胞密度达到70％时，按照质粒与lipofectamine2000(1μg:1μl)比例进行脂质体转染。24h后，5％的Annexin5室温处理细胞20分钟后，进行后续的细胞免疫荧光实验。实验分为：pCAG‑GFP+Annexin5+2.5mMCaCl2组；pLX304‑Tmem63b‑V5组；pLX304‑Tmem63b‑V5+2.5mMCaCl2处理组；pLX304‑Tmem63b‑V5+Annexin5组；pLX304‑Tmem63b‑V5+Annexin5+2.5mMCaCl2处理组。[0027] 4、细胞免疫荧光[0028] 转染质粒24h后的HEK293T细胞，去掉培养基，加入1ml4％多聚甲醛(PFA)固定细胞15分钟，PBS清洗一次，随后含0.2％Triton的PBS通透细胞膜8分钟，促进后续DAPI的结合，PBS清洗一次，含10％胎牛血清(SVF)的PBS封闭细胞30分钟，PBS清洗一次。含2％SVF的PBS稀释anti‑V5抗体(稀释比例1:1000)4℃孵育过夜，PBS清洗四次，接着相应的小鼠二抗(稀释比例1:5000)室温孵育1小时，PBS清洗四次，最后用含DAPI的封闭液封片并用蔡司荧光显微镜()拍照及ImageJ数据分析。[0029] 5、囊泡小体的提取及染色标记[0030] 转染表达质粒24h后的细胞，经2.5mMCaCl2处理15分钟后，吸取培养基20微升，加入0.2微升的脂质染料FM4‑64染色15分钟，最后用蔡司荧光显微镜()拍照及ImageJ数据分析。[0031] 6、Tmem63b敲除小鼠及过表达小鼠坐骨神经夹伤模型[0032] 8周龄Tmem63b全身性敲除小鼠购自美国杰克森实验动物中心。8周龄Tmem63b全身性过表达小鼠购自南京大学动物中心。坐骨神经夹伤模型建立过程如下：在皮下注射3％戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉。切开臀部以下的皮肤，用精细的手术剪刀和镊子将肌肉钝性切开，露出大腿中部的右侧坐骨神经。神经在腓肠、腓总支和胫支断裂处上方0.5厘米处被压碎。首先用直尖锯齿状5.0细镊子压迫坐骨神经15s，直到出现明显的半透明区。以右后肢未受损伤的坐骨神经为对照。所有动物实验方案均经南通大学动物保护与利用委员会和江苏省动物保护伦理委员会批准。小鼠坐骨神经损伤模型的建立是按照批准的指南进行的。[0033] 7、动物行为学检测[0034] 为了进一步明确Tmem63b蛋白对坐骨神经髓鞘再生及运动恢复的影响，我们进行了转棒实验、电生理实验及步态实验检测。[0035] 转棒实验：采用的是加速旋转棒装置(LE8500型，Pan实验室)，在试验前，让小鼠在试验室中习惯30分钟。通过轻轻摆动小鼠，将小鼠轻轻放在转棒上，并在转棒上以3分钟和5分钟的间隔以加速模式(4‑40转/分)训练3天。以恒定速度(16转/分)重复训练，直到小鼠能够在杆上停留至少300秒。对于正式试验，将小鼠置于旋转鼓上，并将转棒设置为加速模式，即在5分钟内以4至40转/分的速度加速。在测量下落之前，记录在转棒上移动的时间。[0036] 步态实验：通过Digigait成像系统对小鼠的足迹分析来评估四足动物的步态动力学，以8cm/s的速度评估后肢的步幅。通过以下四种测量方法分析脚印：与对侧脚的距离、脚印长度、第一和第五脚趾之间的最大脚趾伸展以及第二和第四脚趾中心之间的爪子伸展。[0037] 电生理实验：在这项研究中，用复合麻醉剂麻醉小鼠。然后，使用肌电图设备(NeuropackS1MEB‑9402,Nihon‑Kohden,Tokyo,Japan)测量传导速度(NCV)。将针状电极插入小鼠的腓肠肌，将接地电极夹在暴露的皮肤上。刺激强度从0.1mA逐渐增加到3.0mA，触发波形。以1Hz的频率进行1ms的刺激。记录相应数据以供进一步分析。在整个实验过程中，使用加热灯将小鼠的体温保持在37℃±0.5℃。[0038] 8、坐骨神经组织电镜观察[0039] 分别随机抽取不同组别(敲除组和野生型组)、(过表达组和野生型组)不同时间段(损伤后7d，14d，28d)坐骨神经夹伤小鼠3只，在动物深度麻醉下，取损伤处的坐骨神经组织并切成电镜标本大小(1.2mmx1mmx1mm),浸入到4％戊二醛溶液进行固定，用1％的锇酸进行二次固定，醋酸铀染色，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，半薄切片定位，超薄切片经枸橼酸铅复染，透射电镜选片观察。所得照片在仪器自带图像分析系统上测量有髓神经直径和轴突直径，以轴突直径/有髓神经直径数值(g‑ratio)衡量髓鞘厚度，从而推测Tmem63b蛋白对髓鞘再生进程的影响。[0040] 二、实验结果[0041] 1、Tmem63b敲除后的神经夹伤小鼠运动行为恢复能力下降。本课题通过转棒实验，电生理实验及步态实验检测受损神经的恢复情况。结果显示，与野生型小鼠相比，同等程度周围神经受损14天后，Tmem63b敲除小鼠神经传导速率更慢，坐骨神经功能指数更差，即运动恢复能力更差。因此，Tmem63b蛋白利于神经受损小鼠运动恢复(图1,2)。[0042] 2、Tmem63b敲除后的外周神经夹伤小鼠再生组织髓鞘结构异常。为了揭示Tmem63b蛋白影响神经受损小鼠运动能力的机制，本课题进一步通过透射电镜检测了神经组织髓鞘的微观结构。结果显示，在损伤14天后，Tmem63b敲除小鼠再生神经组织髓鞘畸形。因此，Tmem63b蛋白利于维持再生神经组织髓鞘的完整性(图3)。[0043] 3、Tmem63b过表达后的神经夹伤小鼠运动行为恢复能力得到改善。为了明确Tmem63b蛋白过表达后是否能改善周围神经受损后的小鼠运动能力。本课题通过转棒实验，电生理实验及步态实验检测受损神经的恢复情况。结果显示，周围神经受损14天后的Tmem63b过表达小鼠转棒时间更持久，神经传导速率更快速，坐骨神经功能指数增加，即运动恢复能力更好。因此，Tmem63b蛋白大量表达后利于神经受损小鼠运动恢复(图4,5)。[0044] 4、Tmem63b过表达后的外周神经夹伤小鼠再生组织髓鞘结构更完整。为了揭示Tmem63b蛋白影响神经受损小鼠运动能力的机制，本课题进一步通过透射电镜检测了神经组织髓鞘的微观结构。结果显示，在损伤14天后，Tmem63b过表达小鼠再生神经组织髓鞘更完整。因此，Tmem63b蛋白利于维持再生神经组织髓鞘的完整性(图6)。[0045] 5、为了进一步阐明Tmem63b蛋白影响小鼠外周神经组织髓鞘结构的缘由。本课题通过lipofectamine2000成功将[0046] pLX304‑Tmem63b‑V5质粒转染至HEK293T细胞中，经细胞免疫荧光实验检测发现Tmem63b蛋白定位在细胞膜上，与前人研究结果一致(图7)。[0047] 6、小鼠外周神经髓鞘由施万细胞组成，髓鞘结构的异常可能与施万细胞膜结构有关。施万细胞膜与其他细胞膜最大的区别是，施万细胞膜富含大量脂质。Tmem63b蛋白是否2+与脂质形成，转运等过程相关？众所周知，Tmem63b蛋白是一种Ca 依赖性的机械离子通道蛋白。为了揭示该蛋白是否改变细胞膜脂质分布或组成，本项目用2.5mMCaCl2处理转染pLX304‑Tmem63b‑V5质粒的细胞培养基15分钟。随后用脂质特异性染料FM4‑64染色15分钟，2+经蔡司荧光显微镜观察是否有脂质小体形成。结果显示，只有经Ca 处理后的Tmem63b蛋白可以促进脂质囊泡小体Vesicle的形成(图8)。[0048] Tmem63b蛋白是否是一种依赖Ca2+的Scramblase？Scramblase是脂质翻转酶，催化细胞膜一侧的磷脂酰丝氨酸(PS)向细胞膜另一侧翻转，无特定方向性。Annexin5特异性与磷脂酰丝氨酸结合。结果显示，只有Ca2+作用下的Tmem63b蛋白可以促进磷脂酰丝氨酸从细2+胞膜一侧转移至另一侧(图9)。因此，Tmem63b蛋白确是一种依赖Ca 的Scramblase。[0049] 三、实验结论[0050] 外周神经髓鞘含有大量的脂质，Tmem63b蛋白的缺失引起施万细胞膜脂质分布异常，随后造成再生坐骨神经髓鞘结构畸形，从而导致小鼠运动行为能力变差，相反，过量表达Tmem63b蛋白后可以促进周围神经的损伤后修复。[0051] Tmem63b是一个具有10个跨膜区的Ca2+依赖性通道膜蛋白，HEK293T细胞中过表达2+Tmem63b蛋白后在Ca 的作用下会形成大量囊泡小体Vesicle，且该囊泡小体被脂质染料FM4‑64特异性标记，同时过表达Tmem63b蛋白的293T细胞膜能够特异性的被Annexin5染料(特异性标记细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸)标记，即Tmem63b促进磷脂酰丝氨酸的细胞膜内2+外翻。因此，上述实验结果得出跨膜蛋白Tmem63b是一种新型的Ca 依赖性脂肪翻转酶，调节细胞膜磷脂酰丝氨酸的分布，进而影响受损外周神经的修复。[0052] 因此，Tmem63b是一种可用于治疗外周神经脱髓鞘类疾病的潜在的药物分子。

专利地区：江苏

专利申请日期：2022-07-20

专利公开日期：2024-07-26

专利公告号：CN114984187B