重组胶原蛋白-聚谷氨酸盐水凝胶及其制备方法

专利名称：重组胶原蛋白-聚谷氨酸盐水凝胶及其制备方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210555097.7

专利申请（专利权）人：西安臻研生物科技有限公司
权利人地址：陕西省西安市西咸新区沣东新城科源三路137号康鸿橙方科技园1号楼B单元2层西侧

专利发明（设计）人：李亚婧,黄文涛,乔保坤,李冉,仵西凤

专利摘要：本发明公开了一种重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶及其制备方法，涉及生物医用材料技术领域；本发明利用辐照技术，将重组胶原蛋白、聚谷氨酸盐和聚乙二醇交联形成水凝胶创面敷料，其中，重组胶原蛋白的存在提高了水凝胶材料的生物相容性，并且有利于细胞的爬行、生长和繁殖，有利于创面的快速愈合；同时重组胶原蛋白和聚谷氨酸盐在创面酶的作用下，水解产生大量氨基酸，可进一步促进创面的快速修复；最后，使用高能辐照交联制备得到复合网络结构的水凝胶，不需要任何交联剂和引发剂，不仅优化了凝胶的制备工艺，还避免了化学试剂残留带来的生物安全性风险。

主权利要求：
1.一种重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶，其特征在于，所述水凝胶由混合液经脱泡成膜、热压预组装、辐照交联制成；
所述混合液由重组胶原蛋白、聚谷氨酸盐、交联引发剂溶于缓冲溶液中制成；其中，所述交联引发剂为聚乙二醇；所述重组胶原蛋白的分子量为50～100kDa；所述聚谷氨酸盐的分子量为80～150kDa；所述聚乙二醇的分子量为200～600；
所述重组胶原蛋白与聚谷氨酸盐的质量比为1～5：1；
所述混合液中：
重组胶原蛋白的含量为0.01～10％；
聚谷氨酸盐的含量为0.01～10％；
聚乙二醇的含量为0.2～20％；
基于所述混合液的总重量。
2.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶，其特征在于，所述重组胶原蛋白与聚谷氨酸盐的质量比为为1.5～3：1。
3.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶，其特征在于，所述混合液中：重组胶原蛋白的含量为0.5～5％；
聚谷氨酸盐的含量为0.2～3％；
聚乙二醇的含量为1～10％；
基于所述混合液的总重量。
4.根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶，其特征在于，所述重组胶原蛋白选自重组人源化I型胶原蛋白、重组人源化III型胶原蛋白、重组人源化IV型胶原蛋白、重组人源化VII型胶原蛋白、重组人源化XVII型胶原蛋白中的一种或多种组合。
5.根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶，其特征在于，所述聚谷‑氨酸盐为γ 聚谷氨酸盐。
6.根据权利要求1或2所述的重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶，其特征在于，所述聚谷+ ‑ 2+ ‑ 2+ ‑氨酸盐为Na 形式的γ 聚谷氨酸盐、Mg 形式的γ 聚谷氨酸盐、Ca 形式的γ 聚谷氨酸盐、+ ‑NH形式的γ 聚谷氨酸盐中的一种或多种组合。
7.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为PEG‑200、PEG‑400或PEG‑600。
8.根据权利要求1所述的重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶，其特征在于，所述缓冲溶液选自碳酸盐缓冲溶液、磷酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氨基酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液中的一种或多种组合。
9.一种如权利要求1‑8任一项所述的重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶的制备方法，特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)将重组胶原蛋白、聚谷氨酸盐、聚乙二醇用缓冲溶液溶解，配置得到混合液；
(2)静置、超声或真空脱除气泡后，将上述混合液浇注模具中流延成膜，热压预组装后，进行冷却，得到水凝胶膜；
(3)对水凝胶膜进行辐照交联，得到所述重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的热压预组装的条件分别为：温度30～40℃、压强5～20MPa、时间1～10min；
步骤(3)中，所述辐照交联采用Co60、电子束中的一种；所述辐照的剂量为10～100kGy。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的热压预组装的条件分别为：温度35℃、压强10MPa、时间5min。 说明书 : 重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶及其制备方法技术领域[0001] 本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶及其制备方法。背景技术[0002] 水凝胶类创面敷料与细胞外基质相近，是含有大量亲水基团的三维网络结构，早期可以吸收创面渗液，后期可以给伤口提供一个湿润的环境，能促进伤口愈合，改善创面微环境。因此，被视为临床应用价值较高的材料。[0003] 智能水凝胶对温度、pH、离子强度、压力和电场等外部条件的变化有很强的响应，因此，在医疗器械、组织工程、生物传感器、分离系统和能量转换系统中有良好的应用前景。作为一种创面敷料，其不仅能提供湿润的条件，还能根据伤口的生理状况自动调节，形成有利于创面愈合的微环境。[0004] 发酵来源的聚谷氨酸盐由于含有大量的羧基阴离子、氨基阳离子，便于功能化改性(交联、螯合、衍生化)，使得聚谷氨酸盐制备的水凝胶不仅具有高吸附性，还具有温度、pH敏感性。但是聚谷氨酸盐水凝胶作为医用敷料，其力学强度较弱，使用受到一定限制。[0005] 重组胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，能够控制细胞的生长分化，有利于细胞的爬行、生长和繁殖，有利于创面的快速愈合。重组胶原蛋白侧链上的羟基、氨基和羧基，可以作为物理凝胶的稳定支架，形成机械性能与粘附能力较强的创面敷料。但是常见的重组胶原蛋白水凝胶均是经化学交联剂进行交联，因此增加了生物安全性风险。发明内容[0006] 为克服现有的技术缺陷，本发明的目的在于提供一种重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶及其制备方法，本发明提供的水凝胶作为创面敷料使用，不仅力学性能好，使用便捷(形变和断裂强度大)，可以大量吸收创面渗液，还有利于细胞的爬行、生长和繁殖，可以促进创面的快速愈合。[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：[0008] 第一方面，提供了一种重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶，所述水凝胶由混合液经脱泡成膜、辐照交联制成；[0009] 所述混合液由重组胶原蛋白、聚谷氨酸盐、交联引发剂溶于缓冲溶液中制成；其中，所述交联引发剂为聚乙二醇。[0010] 优选地，本发明中的聚乙二醇为医用聚乙二醇，其为线性聚合物。[0011] 具体地，本发明的水凝胶是作为创面敷料，在此背景下本发明选择了重组胶原蛋白和聚谷氨酸盐，具体原因如下：[0012] 本发明中，选用的聚谷氨酸盐具有极好的吸水能力，可吸收1400‑5000倍于自身重量的水分，因此，聚谷氨酸盐有利于用作伤口敷料，其目的是吸收高水平的伤口渗出物。聚谷氨酸盐在不添加任何引发剂的情况下，可直接辐照交联制备水凝胶，但是聚谷氨酸盐水凝胶存在力学性能很弱的问题。[0013] 重组胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，其能促进天然细胞的粘附、扩散、增殖和分化，可增加基质张力强度，促进细胞增生和迁移，在外伤敷料应用中较为广泛。但是将重组胶原蛋白制备成水凝胶需要使用交联剂，交联剂的使用，降低了敷料的生物安全性，不仅不利于后期细胞的粘附、扩散、增殖和分化，同时其有限的吸水能力也使之不能单独使用。[0014] 基于聚谷氨酸盐和重组胶原蛋白在使用时存在的缺陷，本发明通过大量实验，采用重组胶原蛋白、聚谷氨酸盐和聚乙二醇配合使用，具体的交联原理在于：[0015] 在辐照时，利用高能射线作为引发方式，使得聚谷氨酸盐中的C‑H键断裂，产生亚甲基碳自由基，这些亚甲基碳自由基相互作用，形成稳定的网络结构，聚谷氨酸盐发生了自交联，形成了聚谷氨酸盐水凝胶；聚乙二醇引发并交联重组胶原蛋白，形成以共价键作用的重组胶原蛋白聚合物；最后，采用半互穿网络技术，将重组胶原蛋白聚合物引入到聚谷氨酸盐水凝胶网络中，通过酰基化反应将重组胶原蛋白聚合物接枝到聚谷氨酸盐水凝胶自由的羟基上，制备出具有半互穿网络结构的重组胶原蛋白基聚谷氨酸盐水凝胶。[0016] 在此过程中，存在着三种不同的聚合方式，其一为辐照引发物理聚合，该聚合方式不受温度、压力等条件的限制，反应过程没有使用引发剂，得到的产品纯度较高，反应易控制，操作简便等；其二为聚乙二醇与重组胶原蛋白相互作用，形成重组胶原蛋白聚合物；其三为重组胶原蛋白聚合物通过酰基化反应与聚谷氨酸盐水凝胶聚合，最终形成半互穿聚合物网络结构。[0017] 结合本发明的交联机理可知，通过在水凝胶中引入重组胶原蛋白，不仅可以增加水凝胶的力学性能，同时重组胶原蛋白的存在提高了水凝胶材料的生物相容性；水凝胶的机械性能也会随着聚乙二醇分子量的增加而迅速增大。通过本发明制备的复合水凝胶作为创面敷料使用，不仅力学性能好，使用便捷(形变和断裂强度大)，可以大量吸收创面渗液，还有利于细胞的爬行、生长和繁殖，可以促进创面的快速愈合。且本发明制备的水凝胶原料简单，非生物来源，无需额外添加交联剂和引发剂，安全性较高，工艺简单易于实现，质量可控。[0018] 在本发明中，所述辐照可采用现有的辐照方式，优选地，辐照的方式采用Co60、电子束中的一种；优选地，所述辐照的剂量为10～100kGy。[0019] 进一步地，本发明中，所述重组胶原蛋白与聚谷氨酸盐的质量比为1～5：1；优选为1.5～3：1。[0020] 进一步地，所述混合液中：[0021] 重组胶原蛋白的含量为0.01～10％(wt)，优选为0.5～5％(wt)；[0022] 聚谷氨酸盐的含量为0.01～10％(wt)，优选为0.2～3％(wt)；[0023] 聚乙二醇的含量为0.2～20％(wt)，优选为1～10％(wt)。[0024] 上述各组分的含量基于混合液的总重量。[0025] 在本发明中，重组胶原蛋白为本领域常用的重组胶原蛋白，如重组人源化I型胶原蛋白、重组人源化III型胶原蛋白、重组人源化IV型胶原蛋白、重组人源化VII型胶原蛋白、重组人源化XVII型胶原蛋白。[0026] 例如，上述重组胶原蛋白可采用如专利公开号CN112552393A所示的重组人源化III型胶原蛋白。[0027] 同理，本发明的重组胶原蛋白还可采用现有已知的其他重组胶原蛋白。[0028] 优选地，所述重组胶原蛋白的分子量为10～300kDa，更优选为10～150kDa。[0029] 进一步地，所述聚谷氨酸盐为γ‑聚谷氨酸盐；优选为Na+形式的γ‑聚谷氨酸盐、2+ 2+ +Mg 形式的γ‑聚谷氨酸盐、Ca 形式的γ‑聚谷氨酸盐、NH4形式的γ‑聚谷氨酸盐中的一种或多种组合。[0030] 优选地，所述聚谷氨酸盐的分子量为10～3000kDa，优选为10～300kDa。[0031] 进一步地，所述聚乙二醇的分子量为200～600；优选为PEG‑200、PEG‑400或PEG‑600；更优选为PEG‑200或PEG‑400。[0032] 进一步地，所述缓冲溶液选自碳酸盐缓冲溶液、磷酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氨基酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液中的一种或多种组合。[0033] 优选为碳酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液或柠檬酸缓冲溶液。[0034] 第二方面，提供了一种如第一方面所述的重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：[0035] (1)将重组胶原蛋白、聚谷氨酸盐、聚乙二醇用缓冲溶液溶解，配置得到混合液；[0036] (2)静置、超声或真空脱除气泡后，将上述混合液浇注模具中流延成膜，热压预组装后，进行冷却，得到水凝胶膜；[0037] (3)对水凝胶膜进行辐照交联，得到所述重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶。[0038] 进一步地，步骤(2)中，所述热压预组装的条件分别为：温度30～40℃、压强5～20MPa、时间1～10min；优选为温度35℃、压强10MPa、时间5min。[0039] 步骤(3)中，所述辐照为Co60、电子束中的一种；所述辐照的剂量为10～100kGy。[0040] 本发明中，在混合溶液脱泡后，还可采用常规的成膜技术将混合液制成膜。本发明中，混合溶液成膜的模具形状，根据临床需要，可以有多种不同形状以及厚度。[0041] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：[0042] 本发明利用辐照技术，将重组胶原蛋白、聚谷氨酸盐和聚乙二醇交联形成半互穿聚合物网络的水凝胶创面敷料，其中，重组胶原蛋白的存在提高了水凝胶材料的生物相容性，并且有利于细胞的爬行、生长和繁殖，有利于创面的快速愈合；同时，重组胶原蛋白和聚谷氨酸盐在创面酶的作用下，水解产生大量氨基酸，可进一步促进创面的快速修复；本发明采用热压预组装和辐照结合的方式，在热压预组装阶段初步形成具有一定取向和力学强度的水凝胶膜，同时原料的生物活性和天然结构也得以保持，再结合辐照技术进一步形成多网络凝胶，进一步提升水凝胶的力学性能；本发明制备的复合水凝胶作为创面敷料使用，具有优异的力学性能，形变和断裂强度大，使用便捷，可以大量吸收创面渗液；同时，使用高能辐照交联制备得到复合网络结构的水凝胶，其不需要任何交联剂和引发剂，不仅优化了凝胶的制备工艺，还避免了化学试剂残留带来的生物安全性风险。[0043] 本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。附图说明[0044] 此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：[0045] 图1为本发明实施例1、实施例2、实施例5以及实施例7的水凝胶的扫描电镜图片；[0046] 图2为本发明实施例1‑9的水凝胶溶胀率的测试结果示意图；[0047] 图3为本发明实施例1‑9的水凝胶力学性能的测试结果示意图；[0048] 图4为本发明实施例1‑9的水凝胶pH敏感性的测试结果示意图；[0049] 图5为本发明实施例6的水凝胶的细胞毒性评价测试结果示意图；[0050] 图6为本发明实施例6‑8的水凝胶的细胞迁移显微镜图；[0051] 图7为本发明实施例2以及实施例6‑9的水凝胶的细胞迁移速率测试结果示意图。具体实施方式[0052] 为了更充分的理解本发明的技术内容，下面将结合附图以及具体实施例对本发明作进一步介绍和说明；需要说明的是，术语“第一”、“第二”等描述，是用于区分不同的部件等，不代表先后顺序，也不限定“第一”和“第二”是不同的类型。[0053] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0054] 以下实施例中，重组胶原蛋白均采用专利公开号CN112552393A所示的重组人源化III型胶原蛋白，其他试剂均可通过市售购得。[0055] 发明人通过实验得出，以下实施例中，重组胶原蛋白的具体种类不会影响水凝胶的功效。因此，除上述重组胶原蛋白外，还可采用现有已知的其他重组胶原蛋白。[0056] 为方便描述，实施例1‑9中的水凝胶即为本发明提供的重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶。[0057] 实施例[0058] 实施例1：[0059] 称取0.5％(wt)的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白(分子量为80kDa)、0.2％(wt)的聚谷氨酸钠(分子量为150kDa)，1％(wt)的PEG‑200于烧杯中，加入余量的磷酸盐缓冲溶液，50℃搅拌直至完全溶解；然后将混合液静置1～2h除泡；再将该混合液倒入模具中，于35℃、6010MPa进行热压5min，待混合液冷却后进行包装，于10kGy进行Co 辐照即得水凝胶。[0060] 实施例2：[0061] 称取0.5％(wt)的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白(分子量为50kDa)、0.2％(wt)的聚谷氨酸钠(分子量为80kDa)，1％(wt)的PEG‑400于烧杯中，加入余量的磷酸盐缓冲溶液，将该溶液置于50℃超声水浴中溶解并消除气泡；然后将该混合液倒入模具中，于35℃、10MPa进60行热压3min，待混合液冷却后进行包装，于20kGy进行Co 辐照即得水凝胶。[0062] 实施例3：[0063] 称取0.5％(wt)的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白(分子量为80kDa)、0.2％(wt)的聚谷氨酸钠(分子量为150kDa)，1％(wt)的PEG‑400于烧杯中，加入余量的碳酸盐缓冲溶液，50℃搅拌直至完全溶解；然后将溶液静置1～2h除泡；再将该混合液倒入模具中，于35℃、10MPa进行热压5min，待混合液冷却后进行包装，于30kGy进行电子束辐照即得水凝胶。[0064] 实施例4：[0065] 称取0.5％(wt)的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白(分子量为60kDa)、0.2％(wt)的聚谷氨酸钠(分子量为120kDa)，1％(wt)的PEG‑400于烧杯中，加入余量的柠檬酸缓冲溶液，50℃搅拌直至完全溶解；然后将溶液静置1～2h除泡；再将该混合液倒入模具中，于35℃、10MPa进行热压5min，待混合液冷却后进行包装，于40kGy进行电子束辐照即得水凝胶。[0066] 实施例5：[0067] 称取0.5％(wt)的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白(分子量为80kDa)、0.2％(wt)的聚谷氨酸钠(分子量为150kDa)，1％(wt)的PEG‑400于烧杯中，加入余量的碳酸盐缓冲溶液，50℃搅拌直至完全溶解；然后将混合物静置1～2h除泡；再将该混合液倒入模具中，于35℃、6010MPa进行热压5min，待混合液冷却后进行包装，于80kGy进行Co 辐照即得水凝胶。[0068] 实施例6：[0069] 称取1.0％(wt)的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白(分子量为90kDa)、0.5％(wt)的聚谷氨酸钠(分子量为140kDa)，2％(wt)的PEG‑200于烧杯中，加入余量的磷酸盐缓冲溶液，50℃搅拌直至完全溶解；然后将混合液静置1～2h除泡；再将该混合液倒入模具中，于35℃、6010MPa进行热压3min，待混合液冷却后进行包装，于20kGy进行Co 辐照即得水凝胶。[0070] 实施例7：[0071] 称取2.0％(wt)的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白(分子量为100kDa)、1.0％(wt)的聚谷氨酸钠(分子量为130kDa)，2％(wt)的PEG‑200于烧杯中，加入余量的磷酸盐缓冲溶液，50℃搅拌直至完全溶解；然后将混合液静置1～2h除泡；再将该混合液倒入模具中，于35℃、10MPa进行热压3min，待混合液冷却后进行包装，于20kGy进行电子束辐照即得水凝胶。[0072] 实施例8：[0073] 称取0.5％(wt)的聚谷氨酸钠(分子量为140kDa)，2％(wt)的PEG‑200于烧杯中，加入余量的磷酸盐缓冲溶液，50℃搅拌直至完全溶解；然后将混合液静置1～2h除泡；再将该混合液倒入模具中，于35℃、10MPa进行热压3min，待混合液冷却后进行包装，于20kGy进行60Co 辐照即得水凝胶。[0074] 实施例9：[0075] 称取1.0％(wt)的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白(分子量为90kDa)，2％(wt)的PEG‑200于烧杯中，加入余量的磷酸盐缓冲溶液，50℃搅拌直至完全溶解；然后将混合液静置1～2h除泡；再将该混合液倒入模具中，于35℃、10MPa进行热压3min，待混合液冷却后进行包装，60于20kGy进行Co 辐照即得水凝胶。[0076] 其中，上述实施例中，重组人源化Ⅲ型胶原蛋白还可采用重组人源化I型胶原蛋白、重组人源化IV型胶原蛋白、重组人源化VII型胶原蛋白、重组人源化XVII型胶原蛋白中的一种或多种组合；[0077] 所述缓冲溶液还可选自碳酸盐缓冲溶液、磷酸缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氨基酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液中的一种或多种组合。[0078] 对实施例1‑9制备得到的水凝胶的微观结构、溶胀率、力学性能、pH敏感性、细胞毒性、细胞迁移、皮肤刺激性以及皮肤致敏性进行测试评价。[0079] 水凝胶的微观结构[0080] 为研究水凝胶的微观结构，使用场发射扫描电子显微镜观察水凝胶的横截面。首先需要将样品在液氮中冷冻，然后在冻干机中干燥，样品表面需要镀金，然后用扫描电镜观察，测试结果如图1所示，图1中，a为实施例1的水凝胶；b为实施例2的水凝胶；c为实施例5的水凝胶；d为实施例7的水凝胶。[0081] 图1所示图片均在相同放大倍数和光强度下得出。[0082] 从图1中可以看出，相比较其他的实施例，实施例1(图1(a))的孔密度最大，随着辐照剂量的增加，实施例2(图1(b))、实施例5(图1(c))的孔密度下降，但是形成了半互穿的孔道，且随着辐照剂量的增加，孔通道的数量减少，这是由于辐照剂量的增加，使得聚谷氨酸盐产生的自由基较多，胶原蛋白聚合物与聚谷氨酸钠水凝胶的网络交联节点增多，交联密度增大，孔道的数量减少。对比分析实施例2和实施例7(图1(d))可以看出，随着聚乙二醇含量的增加，其与胶原蛋白之间形成的共价键增多，从而也增加了交联密度，使得相互贯穿的孔通道数量减少。[0083] 水凝胶的溶胀率[0084] 具体测试步骤如下：[0085] 将实施例1‑9制备的水凝胶裁切成长10mm，宽3mm，厚2mm的立方体样品，称量记录其重量，记录为M0，然后将其浸泡在纯化水中，于1h、2h、4h、8h、24h、48h和72h取出样品，用滤纸吸干表面多余的水分，再进行称量，记录为M1，所有实验平行测量三次，使用以下公式计算水凝胶的溶胀率，测试结果如图2所示；图2中，横坐标表示测试时间。[0086] 溶胀率(g/g)＝(M1‑M0)/M0[0087] 通过重量法，测试实施例1‑9制备的水凝胶吸水溶胀能力。[0088] 通过图2的测试结果可知，溶胀与水凝胶的交联度及其三维网络结构有关，在低剂量下，所激发的自由基较少，交联度低，网络结构松散，力学性能较差，使得水分子能够快速的进入网络结构，导致样品在短时间内吸水量大，且破裂；当辐照剂量增加时，随着交联度的提高和微观结构的致密化，溶胀速率明显减慢和减小。随着时间的延长，其溶胀率有所增加，但是在48h之后，溶胀率趋于稳定。[0089] 水凝胶的力学性能[0090] 采用力学性能测试机，对实施例1‑9制备的水凝胶进行拉伸力学性能检测。[0091] 拉伸测试样品处理为：将样品裁剪成长15mm，宽3mm，厚2mm的哑铃型试样，测试速率为5mm/min。测试结果见图3所示。[0092] 从图3中可以看出，随着辐照剂量的增加(从10kGy增加到20kGy)，所制备的水凝胶样品拉伸强度和断裂伸长率均有显著增加，但是当剂量超过30kGy时，样品的拉伸强度和断裂伸长率有所下降。由此可以说明，辐照诱导的自由基促使水凝胶的交联程度增加，且具有很强的韧性，但是过度交联则会导致水凝胶的脆性。[0093] 进一步对比可得，实施例8在缺少重组胶原蛋白时，水凝胶的力学性能出现显著下降，说明本发明通过引入重组胶原蛋白，可以显著增加水凝胶的力学性能；而实施例9由于缺少聚谷氨酸盐，不仅不能通过聚谷氨酸盐自身的化学交联形成稳定的网路结构，也不能与重组胶原蛋白以及聚乙二醇相互结合，无法形成双交联的复合网络结构，使得实施例9的水凝胶敷料的力学性能相对于实施例6也出现显著下降。[0094] 水凝胶的pH敏感性[0095] 具体测试步骤如下：[0096] 将实施例1‑9制备的水凝胶裁切成长10mm，宽3mm，厚2mm的立方体样品，称量记录其重量，记录为M0，然后将其浸泡在pH为2～14的缓冲液中，于5min后取出样品，用滤纸吸干表面多余的水分，再进行称量，记录为M1，所有实验平行测量三次，使用以下公式计算水凝胶的溶胀率，溶胀率(g/g)＝(M1‑M0)/M0，具体结果如图4所示。[0097] 从图4可以看出，在pH较低(＜4)时，水凝胶的溶胀率相对较小，这是由于γ‑PGA侧链羧基受酸性环境中的质子化影响，阻碍了凝胶的网络结构的舒展，导致溶胀体积减小；在碱性环境中，pH的敏感性降低，这是由于γ‑PGA中的酰胺与重组胶原蛋白中的羧基、羟基在氢键协同作用下，羧基去质子化，溶胀增强。[0098] 水凝胶的细胞毒性评价[0099] 具体测试步骤如下：[0100] 在96孔板中接种成纤维细胞L929，细胞密度为2.5×105细胞/孔，使用含有抗生素和10％血清的MEM培养基，在37℃5％CO2条件下培养24h。设置阴性对照和阳性对照组。[0101] 然后弃去原培养液，阴性对照组加入培养基，阳性对照组加入10％二甲基亚砜，实验组将各样品的浸提液，加入到有细胞的培养板中，继续培养24h，然后将孔中的细胞液吸出，向每个孔中加入100uL的培养基和10uL的MTT溶液，继续孵化培养4h。[0102] 培养结束后，弃去孔内液体，加入150uL二甲基亚砜，置振荡器上震荡10min，用酶标仪检测每个样品在570nm下的吸光度。计算细胞存活率，公式如下：[0103] 细胞增殖率＝(实验组吸光度的平均值/对照组吸光度的平均值)×100％[0104] 在倒置显微镜下观察各组的细胞形态，结果如图5所示。[0105] 根据图5的测试结果显示，实验组(实施例6)、阴性对照组、阳性对照组的细胞增殖率分别为98％、102％和20％；阴性对照与实施例6的细胞形态相似，无细胞溶解、无细胞增殖下降情况，综合细胞增殖率和细胞形态，可判定本发明的水凝胶敷料无细胞毒性。[0106] 水凝胶的细胞迁移[0107] 具体测试步骤如下：[0108] 细胞划痕实验[0109] (1)铺板：将2×106个L929细胞数接入6孔板中，培养24小时(可调节)后用枪头划线，加入PBS清洗细胞3次。[0110] (2)随后加入含不同实施例(实施例6‑8)的溶液无血清培养基培养，同时设置空白对照为只含无血清培养基。培养0、6、20、28小时在显微镜下拍照，结果如附图6所示，图6中，空白区域即为划痕。图6所示图片均在相同放大倍数和光强度下得出。[0111] (3)细胞划痕实验中，将照片用imageJ以及prism8进行数据分析，绘制细胞增长率和时间柱状图，结果如图7所示。[0112] 由图6和图7可知，与空白对照组相比，本发明制备的水凝胶敷料在24h内能够提高成纤维细胞的迁移速率，而且随着重组胶原蛋白含量的增加，细胞迁移速率越快，说明本发明的水凝胶敷料促进细胞增殖的作用显著。[0113] 水凝胶的皮肤刺激性[0114] 试验前，去除动物背部脊柱两侧背毛，将本发明所制备的水凝胶敷料直接贴于试验区域，用生理盐水湿化2.5×2.5cm的吸水性纱布块贴敷于对照区域，用半封闭性包扎固定敷料4h后，去除敷料及纱布。于1h、24h、48h及72h记录各接触部位的情况，按GB/T16886.10标准中皮肤反应分类记分系统进行记分、评价。具体检测结果如表1所示。[0115] 表1：本发明所制备的水凝胶(实施例6)各时期皮肤红斑及水肿记分[0116][0117][0118] 根据表1的测试结果：本发明所制备的水凝胶敷料原发刺激指数为0，无皮肤刺激反应，具有优异的安全性能。[0119] 水凝胶的皮肤致敏性[0120] 以无菌生理盐水为浸提介质，按3cm2/mL的浸提比例，37℃±1℃下浸提72h±2h，制备浸提液。取浸提液，根据GB/T16886.10《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验》中推荐的皮肤致敏的要求对浸提物进行评价。以巯基苯并噻唑为阳性对照，以生理盐水为阴性对照。检测结果如表2所示。[0121] 表2：本发明所制备的水凝胶(实施例6)对豚鼠皮肤致敏反应试验结果[0122][0123][0124] 根据表2的测试结果可得：在本实验条件下被检品对豚鼠皮肤致敏率为0，按照Magnusson和Kligman分级标准为0级，表明本实施例制得的水凝胶不会引起致敏反应，具有优异的安全性能。[0125] 综上所述，本发明提供的重组胶原蛋白‑聚谷氨酸盐水凝胶，通过在水凝胶中引入重组胶原蛋白，不仅可以增加水凝胶的力学性能，同时重组胶原蛋白的存在提高了水凝胶材料的生物相容性；通过本发明制备的复合水凝胶作为创面敷料使用，不仅力学性能好，使用便捷(形变和断裂强度大)，可以大量吸收创面渗液，还有利于细胞的爬行、生长和繁殖，可以促进创面的快速愈合。且本发明制备的水凝胶原料简单，非生物来源，无需额外添加交联剂和引发剂，安全性较高，工艺简单易于实现，质量可控。[0126] 以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

专利地区：陕西

专利申请日期：2022-05-20

专利公开日期：2024-07-26

专利公告号：CN114835920B