检测与白山羊体尺性状关联的SNP分子标记的试剂、试剂盒和应用

专利名称：检测与白山羊体尺性状关联的SNP分子标记的试剂、试剂盒和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210764890.8

专利申请（专利权）人：铜仁学院
权利人地址：贵州省铜仁市碧江区川硐教育园区铜仁学院

专利发明（设计）人：安清明,黄琴,杨驰,段明筠,陈昌林

专利摘要：本发明提供了检测与白山羊体尺性状关联的SNP分子标记的试剂、试剂盒和应用，属于山羊分子育种技术领域，所述SNP分子标记为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述SNP分子标记自5’端起的第342bp处存在A/G碱基突变；所述试剂包括引物组，所述引物组包括如SEQ ID NO.2所示的上游引物F和如SEQ ID NO.3所示的下游引物R。所述SNP分子标记存在等位基因A具有更高的胸围指标，杂合基因型AG较纯合型具有更高的胸围指标，可作为优势候选基因标记位点运用到贵州白山羊分子标记遗传育种实践中。

主权利要求：
1.检测与贵州白山羊胸围关联的SNP分子标记的试剂或试剂盒在筛选高胸围的贵州白山羊中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述SNP分子标记自5’端起的第342bp处存在A/G碱基突变；
所述试剂包括引物组，所述引物组包括如SEQIDNO.2所示的上游引物F和如SEQIDNO.3所示的下游引物R；
所述试剂盒包括引物组，所述引物组包括如SEQIDNO.2所示的上游引物F和如SEQIDNO.3所示的下游引物R；
筛选SNP分子标记的基因型为AG的贵州白山羊为高胸围指标的贵州白山羊。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括检测试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包括2×TaqPCRStarMix。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为用所述的试剂、试剂盒对待筛选的贵州白山羊的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物后测序，筛选SNP分子标记的基因型为AG的贵州白山羊为高胸围指标的贵州白山羊。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的扩增体系，以25μL计，包括以下组分2×TaqPCRStarMix12.50μL，ddH2O8.75μL，10pmol/L的上游引物F1.25μL，10pmol/L的下游引物R1.25μL，基因组DNA1.25μL。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的扩增程序如下：94℃预变性
5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，37个循环；72℃终延伸5min；10℃保持。 说明书 : 检测与白山羊体尺性状关联的SNP分子标记的试剂、试剂盒和
应用技术领域[0001] 本发明属于山羊分子育种技术领域，尤其涉及检测与白山羊体尺性状关联的SNP分子标记的试剂、试剂盒和应用。背景技术[0002] PRDM16基因(PR结构域蛋白16)又称MELI，而MELIS为MELI基因表达的另一蛋白产物，但MELIS缺少了PR结构域(PRD)，该结构对于PRDM16功能的发挥具有重要作用。PRDM16基因存在高度同源性，该基因位于人类1号染色体上，是PR结构域家族中第16个成员。人类的PRDM16蛋白由1276个氨基酸组成。许多研究表明，PRDM16是棕色脂肪细胞分化过程中的重要转录调控因子，在维持棕色脂肪细胞的特殊形态(如脂滴和线粒体的形成)、促进关联基因的表达过程中具有重要作用，并最终影响关联基因的产热功能。[0003] 詹芳芳等研究发现PRDM16基因rs2651899位点的等位基因A以及单倍体型AAT可能是超重肥胖发生的危险因素，单倍体型GAC、GCT可能是超重肥胖发生的保护因素，表明PRDM16基因变异与超重肥胖遗传机制具有一定关联性(詹芳芳,刘莉,戚敏杰,卢明,平智广.PRDM16基因rs2651899、rs2236518、rs2282198位点多态性与超重肥胖的关系[J].郑州大学学报(医学版),2015,50(03):354‑358.DOI:10.13705/j.issn.1671‑6825.2015.03.012.)。Harms等研究发现，小鼠体内去甲肾上腺素激活棕色脂肪细胞产热过程中，PRDM16的缺失能影响小鼠耗氧量的降低，导致小鼠瘦肉比率、体重和体长的下降(HarmsMJ，IshibashiJ，WangW，etal.Prdm16isrequiredforthemaintenanceofbrownadipocyteidentityandfunctioninadultmice[J].CellMetabolism，2014，19(4):593‑604.)。Han等研究发现鸡PRDM16基因核苷酸变异与心重、肝重和小腿长等性状显著相关(HanRL，WeiY，KangX，etal.NovelSNPsinthePRDM16geneandtheirassociationswithperformancetraitsinchickens[J].MolecularBiologyReports，2012，39(3):3153‑3160.)。Wang等研究发现，PRDM16基因变异与牛的体重和日增重显著相关，但山羊PRDM16基因相关的研究尚未见报道(WangJ，WangC，TianR，etal.SequencevariantsinthebovinePRDM16geneassociatedwithbodyweightinChinesecattlebreeds[J].Genetics&MolecularResearchGmr，2012，11(1):746‑755)。发明内容[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与白山羊体尺性状关联的SNP分子标记的试剂、试剂盒和应用；所述分子标记自5’端起的第342bp处存在A/G碱基突变，并且存在基因型AG的群体在胸围体尺性状中均显著高于AA和GG型群体，表明等位基因A和等位基因G可能存在互作影响，杂合型具有更高的胸围指标，因此基因型AG可作为白山羊胸围体尺性状的优势基因予以应用。[0005] 本发明提供了一种检测与白山羊体尺性状关联的SNP分子标记的试剂，所述SNP分子标记为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述SNP分子标记自5’端起的第342bp处存在A/G碱基突变。[0006] 优选的，所述试剂包括引物组，所述引物组包括如SEQIDNO.2所示的上游引物F和如SEQIDNO.3所示的下游引物R。[0007] 优选的，所述白山羊为贵州白山羊。[0008] 优选的，所述白山羊体尺性状为胸围。[0009] 本发明提供了一种检测与白山羊体尺性状关联的SNP分子标记的试剂盒，包括所述的引物组和检测试剂。[0010] 优选的，所述检测试剂包括2×TaqPCRStarMix。[0011] 本发明提供了所述的试剂、所述的试剂盒在白山羊遗传育种中的应用。[0012] 优选的，所述应用为用所述的试剂、所述的试剂盒对待筛选的白山羊的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物后测序，筛选SNP分子标记的基因型为AG的白山羊为高胸围指标的白山羊。[0013] 优选的，所述PCR扩增的扩增体系，以25μL计，包括以下组分2×TaqPCRStarMix12.50μL，ddH2O8.75μL，10pmol/L的上游引物F1.25μL，10pmol/L的下游引物R1.25μL，基因组DNA1.25μL。[0014] 优选的，所述PCR扩增的扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，37个循环；72℃终延伸5min；10℃保持。[0015] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的与白山羊体尺性状关联的SNP分子标记自5’端起的第342bp处存在A/G碱基突变，且发现该变异对贵州白山羊胸围体尺性状具有显著影响(P<0.05)，存在等位基因A具有更高的胸围指标，杂合基因型AG较纯合型具有更高的胸围指标，可作为优势候选基因标记位点运用到贵州白山羊分子标记遗传育种实践中。附图说明[0016] 图1为PCR产物琼脂糖检测结果，其中M为Marker，1～4分别为检测山羊基因组目的片段；[0017] 图2为PRDM16基因变异位点检测结果。具体实施方式[0018] 本发明提供了一种检测与白山羊体尺性状关联的SNP分子标记的试剂，所述SNP分子标记为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述SNP分子标记自5’端起的第342bp处存在A/G碱基突变。在本发明中，所述SNP分子标记存在于山羊PRDM16基因，所述SNP分子标记的核苷酸序列具体如下：[0019] cctgggacgctgtttaatcccgtgtctgtgttcaggtgctgcaggtcaatactatacgcagatatggattcacataacaggctcccatctaagttgctctttctcgctgcgtctccgaggggaaggagcaggcatttaaaaatgcttagacattggtgtctgctcagtgggctgtaacggcttttgcagagatgcctggtcacgttggtcttaaaacgtagaaacaaagagcgagaatcaggctcactgggagcccgcatgctgaccgcaggacagccctggggtccgtcctgcctcctgggtgcagccgagcaggggtgcccttgttgctcgctggcaccrttttgccctcaggtgacacttcctctggaaggttcagagtgaggccacatcctcagaattcatattttccccttgcagggtgcttccatcctccatccaggggaagcaggtaaatcaggtcctgactatgttggaatctgtgtcttgggcctgtgccgaactgacagccattcccagcccccaaattcagacgtagctgccttgttccccgtgatgcctgctgtcatcagagttggatcaaggggtcctggtgcctctttctagct；其中r为g或a。[0020] 在本发明中，所述试剂包括引物组，所述引物组包括如SEQIDNO.2所示的上游引物F和如SEQIDNO.3所示的下游引物R；所述引物组的具体信息如表1所示。[0021] 表1PRDM16基因PCR扩增引物序列[0022][0023] 在本发明中，所述白山羊优选的为贵州白山羊；所述白山羊体尺性状优选为胸围。[0024] 本发明提供了一种检测与白山羊体尺性状关联的SNP分子标记的试剂盒，包括所述的引物组和检测试剂。[0025] 在本发明中，所述检测试剂包括2×TaqPCRStarMix；所述检测试剂还包括ddH2O；[0026] 本发明还提供了所述的试剂、所述的试剂盒在白山羊遗传育种中的应用。[0027] 优选的，所述应用为用所述的试剂、所述的试剂盒对待筛选的白山羊的基因组DNA进行PCR扩增，获得扩增产物后测序，筛选SNP分子标记的基因型为AG的白山羊为高胸围指标的白山羊。[0028] 在本发明中，所述PCR扩增的扩增体系，以25μL计，包括以下组分2×TaqPCRStarMix12.50μL，ddH2O8.75μL，10pmol/L的上游引物F1.25μL，10pmol/L的下游引物R1.25μL，基因组DNA1.25μL。[0029] 在本发明中，所述PCR扩增的扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，37个循环，72℃终延伸5min；10℃保持。[0030] 在本发明中，所述基因组DNA优选的以白山羊血液为样品，采用血液基因组DNA速抽提试剂盒提取全基因组DNA；所述基因组DNA的OD260/OD280在1.6～1.8之间，所述基因组DNA的浓度优选为8～12ng/μL，进一步优选为9～11ng/μL，更进一步优选为10ng/μL。[0031] 本发明在PCR扩增结束后，优选的采用琼脂糖电泳检测扩增产物，检测合格的扩增产物送测序公司进行测序。将测序结果与参考序列进行比对，筛选基因型为AG的白山羊为高胸围指标的白山羊。[0032] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0033] 实施例1[0034] 1.样品采集及基因组DNA提取[0035] 以贵州铜仁、遵义不同地区211只成年贵州白山羊为研究对象，收集体尺相关生长数据，对应羊只颈静脉采血5.0mL，采用上海生工有限公司生产的血液基因组DNA速抽提试剂盒提取全基因组DNA。提取的DNA可立即进行下一步实验或‑20℃保存。[0036] 用紫外光分光光度计测定提取获得的全基因组DNA样品在260nm、280nm处的OD值以及其DNA含量。如果OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；如果比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。DNA质量合格后，稀释至10ng/μL备用。[0037] 2.引物设计[0038] 检索NCBI数据库中的山羊PRDM16基因序列(NCBI参考序列号：NC_030823.1，基因ID：102183895)，以该序列为参考序列，选取合适的片段设计引物，具体利用Premier5.0软件设计引物(预测扩增目的片段长度为608bp)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1。[0039] 3.PCR扩增[0040] PCR反应体系25μL：2×TaqPCRStarMix12.50μL，ddH2O8.75μL，上游引物F(10pmol/L)1.25μL，下游引物R(10pmol/L)1.25μL，10ng/μL模板DNA(步骤1中得到的全基因组DNA)1.25μL。[0041] PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，37个循环；72℃终延伸5min，10℃保持。[0042] 4.PCR产物测序验证[0043] 琼脂糖凝胶电泳：制作1.5％的琼脂糖凝胶(已经加入核酸染料)，将PCR产物点样后在150V电压下电泳20min，在BIO‑RADGelDoc2000凝胶成像系统观察实验结果，结果见图1。[0044] 将琼脂糖检测合格的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。对山羊PRDM16基因目的片段测序结果与参考序列进行比对(图2)，发现存在于血样基因组中的山羊PRDM16基因g.342G/A突变(引物扩增目的片段的第342位)。[0045] 5.数据处理[0046] 利用Lasergene中的MegAlign程序分析贵州白山羊PRDM16基因片段的核苷酸变异位点(所有数据均用的是步骤1中211只成年贵州白山羊的数据)；利用PopGene32计算等位基因频率、基因型频率；利用PIC软件计算群体多态信息含量；[0047] 应用MINTAB(Version16，MinitabInc.，Pennsylavania)一般线性混合效应模型(GeneralLinerMixed‑effectModels，GLMMs)评估特定等位基因的存在/缺失、基因型是否对贵州白山羊体尺性状存在影响，体尺性状关联分析方法：[0048] 对某一特定基因性状进行存在(1)缺失(0)分析模型中，等位基因或单体型、性别、年龄为固定因素，遵从下列模型进行最小二乘方差分析：[0049] Yijmn＝μ+Gi+Cj+Fm+Xn+eijmn[0050] 其中，Y为相应性状，μ为群体均值，Gi为年龄效应，Cj为性别效应，Fm基因型、等位基因效应，Xn为因素间互作效应，eijknm为随机误差。[0051] 6.山羊PRDM16基因SNP位点的频率统计及其与生长性状的关联分析[0052] 贵州白山羊PRDM16基因SNP位点中共有两种等位基因(A和G)，其频率分别为36.97％、63.03％；有三种基因型，即AA、AG、GG，其频率分别约为17.06％、39.81％、43.13％，如表2所示。由多态信息含量以及表2可知，贵州白山羊PRDM16基因在群体中属于低度多态(0.5>PIC>0.25)。结果见表2。[0053] 表2贵州白山羊PRDM16基因遗传特征[0054][0055] 在PRDM16基因的目的片段上鉴定出2等位基因A和G，两者频率均大于5％，可用于体尺性状关联分析。等位基因存在与缺失分析结果表明，不同等位基因对白山羊体重、体高、体斜长没有显著影响(P>0.05)，对白山羊胸围均有显著影响(P<0.05)，且存在等位A的群体胸围指标均显著高于缺失群体(表3)，基因型关联分析也发现，存在基因型AG的群体在胸围体尺性状中均显著高于AA和GG型群体(表4)，表明等位基因A和等位基因G可能存在互作影响，杂合型具有更高的指标，因此基因型AG可作为贵州白山羊胸围体尺性状的优势基因予以应用。[0056] 表3PRDM16基因核苷酸变异体对贵州白山羊体尺性状的影响[0057][0058] 表4PRDM16基因基因型对贵州白山羊体尺性状的影响[0059][0060][0061] 注：同一性状同一列中相同不同字母代表差异显著。[0062] 由上述实施例可知，本发明在贵州白山羊PRDM16基因检测片段中发现1处核苷酸突变g.342A/G，且发现该变异对贵州白山羊胸围体尺性状具有显著影响(P<0.05)，存在等位基因A具有更高的胸围指标，杂合基因型AG较纯合型具有更高的胸围指标，可作为优势候选基因标记位点运用到贵州白山羊分子标记遗传育种实践中。[0063] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

专利地区：贵州

专利申请日期：2022-07-01

专利公开日期：2024-09-03

专利公告号：CN115074450B