具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物及其制备方法和应用

专利名称：具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物及其制备方法和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202311737350.1

专利申请（专利权）人：广州元基细胞生物科技有限公司
权利人地址：广东省广州市增城区荔新十路22号第9栋7楼

专利发明（设计）人：林殷瑜,梁小媚

专利摘要：本发明公开了一种具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物及其制备方法和应用。本发明的具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物由自主分离的阿萨希丝孢酵母和长双歧杆菌婴儿亚种依次发酵得到。本发明的二裂酵母发酵产物可以促进水通道蛋白3基因的表达、促进细胞内透明质酸和I型胶原蛋白的合成、以及表现出抗糖基化效果。本发明的二裂酵母发酵产物可以多维度、多通路对抗皮肤的皱纹问题，适合应用在制备化妆品中。

主权利要求：
1.一种阿萨希丝孢酵母，其特征在于，所述阿萨希丝孢酵母其于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO:M20222022。
2.一种具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物，其特征在于，所述具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物由阿萨希丝孢酵母和长双歧杆菌婴儿亚种发酵制得；所述阿萨希丝孢酵母的保藏编号为CCTCCNO:M20222022，所述长双歧杆菌婴儿亚种的保藏编号为CCTCCNO:M
20222021；
所述具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物的制备方法包括：(1)将所述阿萨希丝孢酵母种子液接种至发酵原料中一次发酵，高压均质处理和灭菌处理后，得到发酵基质；
(2)将所述长双歧杆菌婴儿亚种种子液接种至步骤(1)所述发酵基质中二次发酵，得到粗发酵产物；
(3)对步骤(2)所述粗发酵产物进行高压均质处理、过滤处理和灭菌处理，得到所述具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物；
步骤(1)中，所述发酵原料包括青稞米、豆渣和水；所述青稞米在所述发酵原料的质量百分比为3‑6％，所述豆渣在所述发酵原料的质量百分比为1‑4％，水补足至所述发酵原料总质量的100％。
3.一种具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物的制备方法，其特征在于，包括：(1)将阿萨希丝孢酵母种子液接种至发酵原料中一次发酵，高压均质处理和灭菌处理后，得到发酵基质；
(2)将长双歧杆菌婴儿亚种种子液接种至步骤(1)所述发酵基质中二次发酵，得到粗发酵产物；
(3)对步骤(2)所述粗发酵产物进行高压均质处理、过滤处理和灭菌处理，得到具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物；其中，所述阿萨希丝孢酵母的保藏编号为CCTCCNO:M20222022，所述长双歧杆菌婴儿亚种的保藏编号为CCTCCNO:M20222021；
步骤(1)中，所述发酵原料包括青稞米、豆渣和水；所述青稞米在所述发酵原料的质量百分比为3‑6％，所述豆渣在所述发酵原料的质量百分比为1‑4％，水补足至所述发酵原料总质量的100％。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括(Ⅰ)‑(Ⅲ)中的至少一种：
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(Ⅰ)、所述阿萨希丝孢酵母种子液的菌浓为10‑10CFU/mL；
(Ⅱ)、所述阿萨希丝孢酵母种子液的接种量为1‑3％(v/v)；
(Ⅲ)、所述一次发酵的温度为28‑33℃，所述一次发酵的时间为36‑60h，所述一次发酵无菌空气的通入量为0.5‑1.0vvm。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述阿萨希丝孢酵母种子液的制备方法包括：A1、从阿萨希丝孢酵母斜面挑取一环菌落接种至液体培养基A中活化，得到阿萨希丝孢酵母活化液；
A2、将步骤A1中所述阿萨希丝孢酵母活化液接种至所述液体培养基A中扩培，得到阿萨希丝孢酵母种子液；其中，所述液体培养基A包括YM培养基、PDB培养基中至少一种；
步骤A1中所述活化的温度为28‑33℃，所述活化的时间为24‑48h；
所述阿萨希丝孢酵母活化液的接种量为步骤A2中所述液体培养基A体积分数1‑3％。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括(Ⅳ)～(Ⅶ)中的至少一种：
7 9
(Ⅳ)、步骤(2)中，所述长双歧杆菌婴儿亚种种子液的菌浓为10‑10CFU/mL；
(Ⅴ)、所述长双歧杆菌婴儿亚种种子液的接种量为1‑3％(v/v)；
(Ⅵ)、所述二次发酵为厌氧发酵；
(Ⅶ)、所述二次发酵的温度为34‑40℃，所述二次发酵的时间为50‑70h。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述长双歧杆菌婴儿亚种种子液的制备方法包括：B1、从长双歧杆菌婴儿亚种斜面挑取一环菌落接种至液体培养基B中活化，得到长双歧杆菌婴儿亚种活化液；
B2、将步骤B1中所述长双歧杆菌婴儿亚种活化液接种至所述液体培养基B中扩培，得到长双歧杆菌婴儿亚种种子液；其中，所述液体培养基B包括MRS培养基、改良MRS培养基中至少一种；
步骤B1中所述活化的温度为34‑40℃，所述活化的时间为48‑72h；
所述长双歧杆菌婴儿亚种活化液的接种量为步骤B2中所述液体培养基B体积分数1‑
3％；
步骤B2中所述扩培的温度为34‑40℃，所述扩培的时间为48‑72h。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(3)所述灭菌处理的温度为80‑95℃，所述灭菌处理的时间为15min以上；
步骤(1)中所述高压均质处理的压力为5‑10MPa，所述高压均质处理的时间为10‑
30min；
步骤(3)中所述高压均质处理的压力为8‑12Mpa，所述高压均质处理的时间为10‑
30min；
步骤(3)中所述过滤为过滤膜过滤。
9.根据权利要求2所述的具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物在制备化妆品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，以质量百分比计，所述具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物在化妆品中的添加量为0.1‑30％。 说明书 : 具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明属于化妆品原料技术领域，特别涉及一种具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物及其制备方法和应用。背景技术[0002] 二裂酵母发酵产物是指双歧杆菌发酵后得到的代谢产物。二裂酵母发酵产物中含有多种营养成分，如有机酸、氨基酸，多糖，维生素，微量矿物质等，在改善皮肤条件上起到重要作用。[0003] 双歧杆菌同时是人和动物肠道中一类重要的益生菌，在维持人体肠道健康上起到至关重要的作用。现有的研究表明，在一些健康长寿的老人的肠道中，经常能筛选得到双歧杆菌。因此，双歧杆菌在维持人体健康有显著的效果。双歧杆菌作为一种益生菌，在肠道和肠道免疫方面已有很多研究。然而，在皮肤应用方面，双歧杆菌或长双歧杆菌的发酵产物(二裂酵母发酵产物)是否具有抗皱作用，以及实现抗皱的机理如何，现有技术中鲜有探究。发明内容[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物及其制备方法和应用。[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：[0006] 第一方面，本发明提供一种阿萨希丝孢酵母，所述阿萨希丝孢酵母命名为阿萨希丝孢酵母(Trichosporonasahii)YJXB‑04‑13，所述阿萨希丝孢酵母于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO:M20222022。[0007] 第二方面，本发明提供一种具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物，所述二裂酵母发酵产物由阿萨希丝孢酵母和长双歧杆菌婴儿亚种发酵制得；所述阿萨希丝孢酵母的保藏编号为CCTCCNO:M20222022，所述长双歧杆菌婴儿亚种的保藏编号为CCTCCNO:M20222021。[0008] 第三方面，本发明提供一种具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物的制备方法，包括以下步骤：[0009] (1)将阿萨希丝孢酵母种子液接种至发酵原料中一次发酵，高压均质处理和灭菌处理后，得到发酵基质；[0010] (2)将长双歧杆菌婴儿亚种种子液接种至步骤(1)所述发酵基质中二次发酵，得到粗发酵产物；[0011] (3)对步骤(2)所述粗发酵产物进行高压均质处理、过滤处理和灭菌处理，得到具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物；其中，[0012] 所述阿萨希丝孢酵母的保藏编号为CCTCCNO:M20222022，所述长双歧杆菌婴儿亚种的保藏编号为CCTCCNO:M20222021。[0013] 在一些实施方式中，步骤(1)中所述发酵原料包括青稞米、豆渣和水。[0014] 本发明先以阿萨希丝孢酵母对青稞米和豆渣进行发酵，阿萨希丝孢酵母细胞中的酶可以将青稞米中蛋白质、纤维素和淀粉物质分解成小分子肽、氨基酸、糖类物质，制备得到的发酵基质富含营养物质，有利于后续长双歧杆菌婴儿亚种的生长和代谢，最终制备得到的二裂酵母发酵产物滤液具有很好的抗皱功效。[0015] 在一些实施方式中，所述青稞米在所述发酵原料的质量百分比为3‑6％；优选的，所述青稞米在所述发酵原料的质量百分比为4％。[0016] 在一些实施方式中，所述豆渣在所述发酵原料的质量百分比为1‑4％；优选的，所述豆渣在所述发酵原料的质量百分比为2％。[0017] 在一些实施方式中，水补足至所述发酵原料总质量的100％。[0018] 在一些实施方式中，所述阿萨希丝孢酵母种子液的菌浓为107‑109CFU/mL。[0019] 在一些实施方式中，所述阿萨希丝孢酵母种子液的接种量为1‑3％(v/v)。[0020] 在一些实施方式中，所述阿萨希丝孢酵母种子液的制备方法包括：[0021] A1、从阿萨希丝孢酵母斜面挑取一环菌落接种至液体培养基A中活化，得到阿萨希丝孢酵母活化液；[0022] A2、将步骤A1中所述阿萨希丝孢酵母活化液接种至所述液体培养基A中扩培，得到阿萨希丝孢酵母种子液。[0023] 在一些实施方式中，所述液体培养基A包括YM培养基、PDB培养基中至少一种。[0024] 在一些实施方式中，步骤A1中所述活化的温度为28‑33℃，所述活化的时间为24‑48h。[0025] 在一些实施方式中，所述阿萨希丝孢酵母活化液的接种量为步骤A2中所述液体培养基A体积分数1‑3％。[0026] 在一些实施方式中，步骤A2中所述扩培的温度为28‑33℃，所述扩培的时间为24‑48h。[0027] 在一些实施方式中，步骤(1)中所述一次发酵的温度为28‑33℃，所述一次发酵的时间为36‑60h，所述一次发酵无菌空气的通入量为0.5‑1.0vvm。[0028] 在一些实施方式中，步骤(1)中所述高压均质处理的压力为5‑10MPa，所述高压均质处理的时间为10‑30min。[0029] 在本发明中，步骤(1)中的高压均质处理一方面可以将发酵完成后的部分阿萨希丝孢酵母灭活，降低阿萨希丝孢酵母的存活率；另一方面，高压均质处理可以将阿萨希丝孢酵母裂解，有利于阿萨希丝孢酵母的胞内物溶出，使得发酵基质中的营养物质更容易被长双歧杆菌婴儿亚种利用，制备得到的二裂酵母发酵产物功效更好。[0030] 在一些实施方式中，步骤(1)中所述灭菌处理的温度为80‑95℃，所述灭菌处理的时间为15min以上。[0031] 在本发明中，灭菌可以将大部分的阿萨希丝孢酵母杀死，避免阿萨希丝孢酵母在后续的发酵过程中对长双歧杆菌婴儿亚种的生长造成影响。[0032] 在一些实施方式中，所述长双歧杆菌婴儿亚种种子液的菌浓为107‑109CFU/mL。[0033] 在一些实施方式中，所述长双歧杆菌婴儿亚种种子液的接种量为1‑3％(v/v)。[0034] 菌浓和种子液的接种量影响长双歧杆菌婴儿亚种的初始生长密度，密度不同，微生物的群感效应不同。群体效应参与调节群体的行为和生理生化，从而影响菌体的生长速度和代谢产物的生成量，影响到最终二裂酵母发酵产物的抗皱性能。[0035] 在一些实施方式中，所述长双歧杆菌婴儿亚种种子液的制备方法包括：[0036] B1、从长双歧杆菌婴儿亚种斜面挑取一环菌落接种至液体培养基B中活化，得到长双歧杆菌婴儿亚种活化液；[0037] B2、将步骤B1中所述长双歧杆菌婴儿亚种活化液接种至所述液体培养基B中扩培，得到长双歧杆菌婴儿亚种种子液。[0038] 在一些实施方式中，所述液体培养基B包括MRS培养基、改良MRS培养基中至少一种。[0039] 在一些实施方式中，步骤B1中所述活化的温度为34‑40℃，所述活化的时间为48‑72h。[0040] 在一些实施方式中，所述长双歧杆菌婴儿亚种活化液的接种量为步骤B2中所述液体培养基B体积分数1‑3％。[0041] 在一些实施方式中，步骤B2中所述扩培的温度为34‑40℃，所述扩培的时间为48‑72h。[0042] 在一些实施方式中，步骤(2)中所述二次发酵为厌氧发酵。[0043] 在一些实施方式中，步骤(2)中所述二次发酵的温度为34‑40℃，所述二次发酵的时间为50‑70h。[0044] 在一些实施方式中，步骤(3)中所述高压均质处理的压力为8‑12Mpa，所述高压均质处理的时间为10‑30min。[0045] 在一些实施方式中，步骤(3)中所述过滤为过滤膜过滤。[0046] 在一些实施方式中，所述灭菌处理的温度为80‑95℃，所述灭菌处理的时间为15min以上。[0047] 第四方面，本发明还提供上述具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物在制备化妆品中的应用。[0048] 在一些实施方式中，以质量百分比计，所述具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物在化妆品中的添加量为0.1‑30％。[0049] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：[0050] (1)本发明采用多菌复合发酵的方式，制备得到二裂酵母发酵产物，通过多菌复合发酵的方式解决仅双歧杆菌发酵得到的产物抗皱效果差的弊端，增添了益生菌发酵物在抗皱类护肤品原料中的应用新局面。[0051] (2)长双歧杆菌无法直接利用青稞米和豆渣内的营养物质。本发明采用自主分离的阿萨希丝孢酵母发酵青稞米和豆渣，阿萨希丝孢酵母菌体内的多种酶可以将青稞米和豆渣中的淀粉、蛋白质等生物大分子分解成小分子。在阿萨希丝孢酵母发酵完成后，将阿萨希丝孢酵母裂解，阿萨希丝孢酵母的胞内物流出。上述胞内物与青稞米和豆渣中发酵得到的小分子物质共同作为后续长双歧杆菌婴儿亚种的培养基，促进长双歧杆菌婴儿亚种的生长和代谢，使得最终得到的二裂酵母发酵产物具有很好的抗皱功效。[0052] (3)本发明在制备二裂酵母发酵产物后，对二裂酵母发酵产物抗皱功效的机理进行了深入探究。功效测试的结果表明，本发明制备的二裂酵母发酵产物可以促进水通道蛋白3基因的表达、可以促进细胞内透明质酸的合成、可以促进细胞胶原蛋白的合同以及表现出抗糖基化效果。综合来看，本发明的二裂酵母发酵产物可以促进水分从真皮扩散到表皮，增加表皮含水量，增加皮肤组织中的透明质酸和胶原蛋白，从而起到增加皮肤弹性和减少皱纹的作用。同时，二裂酵母发酵产物的抗糖化效果可以避免肤的蛋白质发生糖基化反应，减缓皮肤的皱纹问题。本发明的二裂酵母发酵产物可以多维度、多通路对抗皮肤的皱纹问题，具有很好的抗皱效果。附图说明[0053] 图1为本发明分离得到的阿萨希丝孢酵母的菌落形态图。[0054] 图2为本发明分离得到的阿萨希丝孢酵母的光学镜检图。具体实施方式[0055] 为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。[0056] 本发明所用术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，还可包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。[0057] 本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。[0058] 在以下实施例和对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例及对比例中所提及的百分比，如无特殊说明，均为质量百分比。[0059] 本发明实施例所用的阿萨希丝孢酵母的保藏编号为CCTCCNO:M20222022；本发明所用长双歧杆菌婴儿亚种的保藏编号为CCTCCNO:M20222021，上述阿萨希丝孢酵母和长双歧杆菌婴儿亚种均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。[0060] 本发明实施例所用的长双歧杆菌婴儿亚种(CCTCCNO:M20222021)分离方法参考专利申请202310217321.6。[0061] 本发明对比例所用阿萨希丝孢酵母为阿萨希丝孢酵母(BNCC195846)，购于北京北纳创联生物技术研究院。[0062] 本发明对比例所用长双歧杆菌婴儿亚种为长双歧杆菌婴儿亚种(BNCC362826)，购于北京北纳创联生物技术研究院。[0063] 本发明所用YM培养、PDB培养基、MRS培养基和改良MRS培养基可通过商业途径获得，也可以通过以下方法制得：[0064] PDB培养基(以制备1L为例)：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，马铃薯切成小块，放入锅中，加水1L，煮沸20‑30min。用纱布滤去马铃薯残渣，用水补足至1L，加入称量好的葡萄糖，在121℃下灭菌15min后贮存备用。[0065] YM培养基(以制备1L为例)：酵母浸粉3.0g，麦芽提取物3.0g，葡萄糖10.0g，酪蛋白胨蛋5.0g，琼脂20.0g(固体培养基加入，液体培养基不加入)，蒸馏水定容1.0L，pH6.2±0.2，在121℃下灭菌15min后贮存备用。[0066] MRS培养基(以制备1L为例)：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0g，磷酸氢二钾2.0g，醋酸钠5.0g，柠檬酸铵2.0g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，蒸馏水定容1.0L，混合均匀，在121℃下灭菌15min后贮存备用。[0067] 改良MRS培养基(以制备1L为例)：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.2g，醋酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.05g，吐温801.0g，L‑半胱氨酸0.5g，蒸馏水定容1.0L，混合均匀，在121℃下灭菌15min后贮存备用。[0068] 本发明的青稞米为青稞米粉末，青稞米粉末的制备方法如下：[0069] 青稞米粉末：取干燥青稞米用粉碎机粉碎，过筛后取下层粉末备用。[0070] 本发明所用的粉碎机为BJ‑400T多功能粉碎机，其他商业途径获得的粉碎机也适用于本发明。[0071] 本发明所用豆渣为市售干燥黄豆豆渣。[0072] 实施例1阿萨希丝孢酵母的分离和鉴定[0073] 1、阿萨希丝孢酵母的分离[0074] 本发明利用YM培养基从发酵的黄酒酒糟中分离微生物。具体的分离步骤为：用无菌封口袋取5g黄酒酒糟保存。从封口袋中称取样品1g黄酒酒糟，加入盛有99mL无菌生理盐‑2水并装有玻璃珠的三角瓶中摇晃均匀，得到10 的菌源悬液。再用无菌生理盐水进一步稀‑4 ‑5 ‑6释，得到10 、10 、10 三个稀释度的菌源稀释液。用无菌移液管分别吸取上述已经制好的‑4 ‑5 ‑610 、10 、10 三个稀释度菌源稀释液各0.1mL，均匀涂布至YM固体培养基中(每个菌源稀释液做3个平行样品)，在30℃下培养48h，得到具有典型丝孢酵母形态的菌落。用显微镜观察，挑取典型酵母菌落，接种环划线纯化3代，将分离纯化得到的丝孢酵母接种于YM斜面培养基中，置于4℃保藏。[0075] 2、阿萨希丝孢酵母的生物学特性[0076] 菌落形态：菌株分离纯化后，在YM固体培养基中形成单菌落，其形态如图1所示，分离得到的单菌落形态几乎一致，菌落呈圆形，白色，单菌落从圆心到边缘呈发射状。[0077] 生理学特性：分离纯化的菌株在28‑33℃的环境下均能生长。菌株的染色结果如图2所示。[0078] 3、阿萨希丝孢酵母的分子生物学鉴定[0079] 对分离纯化的菌株进行DNA提取。使用ITS通用引物进行扩增测序，利用测序结果在NCBI数据库中进行比对，从而对样品进行初步鉴定。真菌的ITS序列(内部转录间隔区，internaltranscribedspacerofRNAPol1，ITS)在不同的物种间是高度保守的，不同的物种间序列是不一样的，因而对此序列通过PCR扩增、测序，与GenBank中的已知序列进行比对后，则可判定真菌种类，将其划分到属或种。[0080] (1)DNA提取：将SpinColumn置于CollectionTube中，加入250μLBufferBL，12000rpm离心1min活化硅胶膜；取样本干燥组织(15mg)，加入液氮充分研磨；研磨后置于1.5mL离心管中，加入400μLBuffergP1，涡旋振荡1min，65℃水浴20min，期间可取出颠倒混匀以充分裂解；加入150μLBuffergP2，涡旋振荡1min，冰浴5min；12000rpm离心5min，将上清转移至新的离心管中；加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入SpinColumn中，12000rpm离心30s，弃废液；向SpinColumn中加入500μLBufferPw(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；向SpinColumn中加入500μLWashBuffer(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液；将SpinColumn放回CollectionTube中，12000rpm离心2min，开盖晾干1min；取出SpinColumn，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加100μLTEBuffer(65℃预热TEBuffer)，25℃放置2min，12000rpm离心2min，提取得到DNA。[0081] (2)PCR扩增[0082] 表1为真菌菌种鉴定通用引物[0083] 表1[0084][0085] 提取的DNA样品适量稀释后作为PCR模板，以S×TSE246进行扩增，扩增体系各组分如表2[0086] 表2[0087][0088][0089] 表2的扩增体系按表3中的扩增程序进行扩增：[0090] 表3[0091][0092] (3)电泳检测：将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(2uL样品+6uL溴酚蓝)，300V电压下15分钟，获取鉴定胶图。将准备好PCR产物进行一代测序并对比。[0093] 比对结果：用ContigExpress拼接测序结果，并去除两端不准的部分；将拼接好的序列在NCBI数据库(blast.ncbi.nlm.nih.gov)中进行比对，分离出一株阿萨希丝孢酵母(Trichosporonasahii)YJXB‑04‑13。[0094] 根据菌株的菌落形态、生理学特性、基因测序等实验数据综合分析，上述菌株鉴定为阿萨希丝孢酵母，拉丁文名为Trichosporonasahii，菌种代号为YJXB‑04‑13；本发明分离得到的阿萨希丝孢酵母其于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO:M20222022，保藏日期为2022年12月23日，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。[0095] 实施例2具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物[0096] 本实施例提供的具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物通过以下方法制备得到：[0097] (1)将菌浓为107CFU/mL的阿萨希丝孢酵母种子液以3％的接种量(v/v)接种至发酵原料中，在33℃、无菌空气的通入量为1.0vvm下一次发酵36h，发酵完成后于10MPa下高压均质处理10min，再于80℃下灭菌处理30min，得到发酵基质。[0098] (2)将菌浓为107CFU/mL的长双歧杆菌婴儿亚种种子液以3％的接种量(v/v)接种至步骤(1)的发酵基质中，在40℃下二次发酵50h(二次发酵为密闭发酵，即厌氧发酵)，得到粗发酵产物。[0099] (3)将粗发酵产物在12MPa下高压均质处理10min，经过滤膜过滤，所得滤液于80℃下灭菌处理30min，得到具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物。[0100] 在本实施例中，以质量百分比计，步骤(1)中发酵原料包括3％青稞米、4％豆渣和93％去离子水；发酵原料的制备方法为：将青稞米、豆渣和去离子水混合均匀，121℃下灭菌15min后贮存备用。[0101] 本实施例的阿萨希丝孢酵母种子液的制备方法为：[0102] A1、从实施例1的阿萨希丝孢酵母斜面挑取一环阿萨希丝孢酵母菌落接种至PDB培养基中，于33℃下活化24h，得到阿萨希丝孢酵母活化液。[0103] A2、将步骤A1的阿萨希丝孢酵母活化液以体积分数为3％的量接种至PDB培养基中，于33℃下扩培24h，得到阿萨希丝孢酵母种子液。阿萨希丝孢酵母种子液的菌浓为710CFU/mL。[0104] 本实施例的长双歧杆菌婴儿亚种种子液的制备方法为：[0105] B1、从长双歧杆菌婴儿亚种斜面挑取一环长双歧杆菌婴儿亚种菌落至改良MRS培养基中，于40℃下活化48h，得到长双歧杆菌婴儿亚种活化液。[0106] B2、将步骤B1中的长双歧杆菌婴儿亚种活化液以体积分数为3％的量接种至改良MRS培养基中，于40℃下扩培48h，得到长双歧杆菌婴儿亚种种子液。长双歧杆菌婴儿亚种种7子液的菌浓为10CFU/mL。[0107] 实施例3具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物[0108] 本实施例提供的具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物通过以下方法制备得到：[0109] (1)将菌浓为109CFU/mL的阿萨希丝孢酵母种子液以1％的接种量(v/v)接种至发酵原料中，在28℃、无菌空气的通入量为0.5vvm下一次发酵60h，发酵完成后于5MPa下高压均质处理30min，再于95℃下灭菌处理15min，得到发酵基质。[0110] (2)将菌浓为109CFU/mL的长双歧杆菌婴儿亚种种子液以1％的接种量(v/v)接种至步骤(1)的发酵基质中，在34℃下二次发酵70h(二次发酵为密闭发酵，即厌氧发酵)，得到粗发酵产物。[0111] (3)将粗发酵产物在8MPa下高压均质处理30min，经过滤膜过滤，所得滤液于95℃下灭菌处理15min，得到具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物。[0112] 在本实施例中，以质量百分比计，步骤(1)中发酵原料包括6％青稞米、1％豆渣和93％去离子水；发酵原料的制备方法为：将青稞米、豆渣和去离子水混合均匀，121℃下灭菌15min后贮存备用。[0113] 本实施例的阿萨希丝孢酵母种子液的制备方法为：[0114] A1、从实施例1的阿萨希丝孢酵母斜面挑取一环阿萨希丝孢酵母菌落接种至YM培养基中，于28℃下活化48h，得到阿萨希丝孢酵母活化液。[0115] A2、将步骤A1的阿萨希丝孢酵母活化液以体积分数为1％的量接种至YM培养基中，9于28℃下扩培48h，得到阿萨希丝孢酵母种子液。阿萨希丝孢酵母种子液的菌浓为10 CFU/mL。[0116] 本实施例的长双歧杆菌婴儿亚种种子液的制备方法为：[0117] B1、从长双歧杆菌婴儿亚种斜面挑取一环长双歧杆菌婴儿亚种菌落至MRS培养基中，于34℃下活化72h，得到长双歧杆菌婴儿亚种活化液。[0118] B2、将步骤B1中的长双歧杆菌婴儿亚种活化液以体积分数为1％的量接种至MRS培养基中，于34℃下扩培72h，得到长双歧杆菌婴儿亚种种子液。长双歧杆菌婴儿亚种种子液9的菌浓为10CFU/mL。[0119] 实施例4具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物[0120] 本实施例提供的具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物通过以下方法制备得到：[0121] (1)将菌浓为108CFU/mL的阿萨希丝孢酵母种子液以2％的接种量(v/v)接种至发酵原料中，在30℃、无菌空气的通入量为0.8vvm下一次发酵48h，发酵完成后于8MPa下高压均质处理20min，再于90℃下灭菌处理20min，得到发酵基质。[0122] (2)将菌浓为108CFU/mL的长双歧杆菌婴儿亚种种子液以2％的接种量(v/v)接种至步骤(1)的发酵基质中，37℃下二次发酵60h(二次发酵为密闭发酵，即厌氧发酵)，得到粗发酵产物。[0123] (3)将粗发酵产物在10MPa下高压均质处理20min，经过滤膜过滤，所得滤液于90℃下灭菌处理20min，得到具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物。[0124] 在本实施例中，以质量百分比计，步骤(1)中发酵原料包括4％青稞米、2％豆渣和94％去离子水；发酵原料的制备方法为：将青稞米、豆渣和去离子水混合均匀，121℃下灭菌15min后贮存备用。[0125] 本实施例的阿萨希丝孢酵母种子液的制备方法为：[0126] A1、从实施例1的阿萨希丝孢酵母斜面挑取一环阿萨希丝孢酵母菌落接种至YM培养基中，于30℃下活化36h，得到阿萨希丝孢酵母活化液。[0127] A2、将步骤A1的阿萨希丝孢酵母活化液以体积分数为2％的量接种至YM培养基中，8于30℃下扩培36h，得到阿萨希丝孢酵母种子液。阿萨希丝孢酵母种子液的菌浓为10 CFU/mL。[0128] 本实施例的长双歧杆菌婴儿亚种种子液的制备方法为：[0129] B1、从长双歧杆菌婴儿亚种斜面挑取一环长双歧杆菌婴儿亚种菌落至MRS培养基中，于37℃下活化60h，得到长双歧杆菌婴儿亚种活化液。[0130] B2、将步骤B1中的长双歧杆菌婴儿亚种活化液以体积分数为2％的量接种至MRS培养基中，于37℃下扩培60h，得到长双歧杆菌婴儿亚种种子液。长双歧杆菌婴儿亚种种子液8的菌浓为10CFU/mL。[0131] 实施例5具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物[0132] 实施例5的具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物的制备方法、阿萨希丝孢酵母种子液和长双歧杆菌婴儿亚种种子液的制备方法同实施例4。[0133] 其中，步骤(1)中发酵原料包括3％青稞米和3％豆渣和94％去离子水；发酵原料的制备方法同实施例4。[0134] 实施例6具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物[0135] 实施例6的具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物的制备方法、阿萨希丝孢酵母种子液和长双歧杆菌婴儿亚种种子液的制备方法同实施例4。[0136] 其中，步骤(1)中发酵原料包括5％青稞米和1％豆渣和94％去离子水；发酵原料的制备方法同实施例4。[0137] 实施例7具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物[0138] 实施例7与实施例4的区别在于，实施例7将长双歧杆菌婴儿亚种种子液的菌浓从8 710CFU/mL改为10CFU/mL，其余的步骤和参数同实施例4。[0139] 其中，长双歧杆菌婴儿亚种种子液的制备方法同实施例2。[0140] 实施例8具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物[0141] 实施例8与实施例4的区别在于，实施例8将长双歧杆菌婴儿亚种种子液的菌浓从8 910CFU/mL改为10CFU/mL，其余的步骤和参数同实施例4。[0142] 其中，长双歧杆菌婴儿亚种种子液的制备方法同实施例3。[0143] 实施例9具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物[0144] 实施例9与实施例4的的区别在于，实施例9将长双歧杆菌婴儿亚种种子液的接种量从2％改为1％(v/v)，其余的步骤和参数同实施例4。[0145] 实施例10具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物[0146] 实施例10与实施例4的区别在于，实施例10将长双歧杆菌婴儿亚种种子液的接种量从2％改为3％(v/v)，其余的步骤和参数同实施例4。[0147] 对比例1二裂酵母发酵产物[0148] 对比例1与实施例4的区别在于，对比例1将实施例4中的阿萨希丝孢酵母(CCTCCNO:M20222022)改为市售的阿萨希丝孢酵母(BNCC195846)，其余的步骤和参数同实施例4。市售的阿萨希丝孢酵母种子液的制备方法参考实施例4。[0149] 对比例2二裂酵母发酵产物[0150] 对比例2与实施例4的区别在于，对比例2将实施例4中的长双歧杆菌婴儿亚种(CCTCCNO:M20222021)改为市售的长双歧杆菌婴儿亚种(BNCC362826)，其余的步骤和参数同实施例4。市售的长双歧杆菌婴儿亚种种子液的制备方法参考实施例4。[0151] 对比例3阿萨希丝孢酵母发酵产物[0152] 本对比例的阿萨希丝孢酵母发酵产物通过以下方法制备得到：[0153] 将菌浓为108CFU/mL的阿萨希丝孢酵母种子液以2％的接种量(v/v)接种至发酵原料中，在30℃、无菌空气的通入量为0.8vvm下一次发酵48h，发酵完成后于8MPa下高压均质处理20min，再于90℃下灭菌处理20min。[0154] 阿萨希丝孢酵母种子液的制备方法同实施例4，所用的阿萨希丝孢酵母为阿萨希丝孢酵母(CCTCCNO:M20222022)。[0155] 本对比例阿萨希丝孢酵母发酵产物的制备方法同实施例4的发酵基质的制备方法。[0156] 对比例4二裂酵母发酵产物[0157] 本对比例的二裂酵母发酵产物通过以下方法制备得到：[0158] (1)将菌浓为108CFU/mL的长双歧杆菌婴儿亚种种子液以2％的接种量(v/v)接种至发酵原料中，37℃下发酵60h(发酵为密闭发酵，即厌氧发酵)，得到粗发酵产物。[0159] (2)将粗发酵产物在10MPa下高压均质处理20min，经过滤膜过滤，所得滤液于90℃下灭菌处理20min，得到具有抗皱功效的二裂酵母发酵产物。[0160] 本对比例的发酵原料、长双歧杆菌婴儿亚种种子液同实施例4，所用的长双歧杆菌婴儿亚种为长双歧杆菌婴儿亚种(CCTCCNO:M20222021)。[0161] 对比例5二裂酵母发酵产物[0162] 对比例5的二裂酵母发酵产物的制备方法同实施例4，区别在于发酵原料不同。[0163] 对比例5的发酵原料包括6％青稞米和94％去离子水；发酵原料的制备方法为：将青稞米和去离子水混合均匀，121℃下灭菌15min后贮存备用。[0164] 对比例6二裂酵母发酵产物[0165] 对比例6的二裂酵母发酵产物的制备方法同实施例4，区别在于发酵原料不同。[0166] 对比例6的发酵原料包括6％豆渣和94％去离子水；发酵原料的制备方法为：将青稞米和去离子水混合均匀，121℃下灭菌15min后贮存备用。[0167] 对比例7二裂酵母发酵产物[0168] 对比例7的二裂酵母发酵产物的制备方法同实施例4，区别在于发酵原料不同。[0169] 对比例7的发酵原料包括4％燕麦粉末、2％豆渣和94％去离子水；发酵原料的制备方法为：将燕麦粉末、豆渣和去离子水混合均匀，121℃下灭菌15min后贮存备用。[0170] 对比例8二裂酵母发酵产物[0171] 对比例8的二裂酵母发酵产物的制备方法同实施例4，区别在于发酵原料不同。[0172] 对比例8的发酵原料包括4％青稞米、2％大豆蛋白胨和94％去离子水；发酵原料的制备方法为：将青稞米、大豆蛋白胨和去离子水混合均匀，121℃下灭菌15min后贮存备用。[0173] 对比例9二裂酵母发酵产物[0174] 对比例9的二裂酵母发酵产物的制备方法同实施例4，区别在于发酵原料不同。[0175] 对比例9的发酵原料包括4％葡萄糖、2％豆渣和94％去离子水；发酵原料的制备方法为：将葡萄糖、豆渣和去离子水混合均匀，121℃下灭菌15min后贮存备用。[0176] 应用例一种护肤美容产品[0177] 本应用例所述护肤美容产品包括冻干粉和溶媒。[0178] 以质量百分比计，冻干粉包括：5％甘露糖醇、84.37％水、10％实施例4的二裂酵母发酵产物、0.3％磷酸氢二钠、0.03％磷酸二氢钠和0.3％甘氨酸。[0179] 以质量百分比计，溶媒包括：93.43％水、4％甘油、0.12％透明质酸钠、0.05％EDTA二钠、2％葡聚糖和0.4％对羟基苯乙酮。[0180] 冻干粉的制备方法为：将甘露糖醇、水、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和甘氨酸混合均匀，过滤后于121℃下灭菌15min，加入实施例4的二裂酵母发酵产物，混合均匀，得到混合物；将混合物预冻至‑40℃保温3h，升温至‑10℃保温6h，升温至10℃保温6h，升温至30℃保温9h，得到冻干粉。[0181] 溶媒的制备方法为：将水于90℃保温20min，降温至80℃加对羟基苯乙酮，混合均匀；再降温至45℃，加入甘油、透明质酸钠、EDTA二钠和葡聚糖，混合均匀，得到溶媒。[0182] 效果例1水通道蛋白表达实验[0183] 测试原理：水通道蛋白3(Aquaporin3，AQP3)是位于细胞膜上的蛋白质，又名水孔蛋白，可以在细胞膜上形成孔道，控制水分子在细胞中的进出。AQP3负责水、甘油及尿素等物质的运输，在保持表皮水合作用方面发挥重要作用。增强AQP3的表达可以促进水分从真皮扩散到表皮,增加表皮含水量，保持皮肤细胞间质和细胞内水合水平，维持皮肤屏障和增加皮肤弹性。[0184] 测试样品：实施例2‑10，对比例1‑9的发酵产物，以细胞培养液作为溶剂，制备成质量分数为3％的溶液；其中，细胞培养液为含10％FBS的H‑DMEM培养基。[0185] 测试步骤：将角质形成细胞HaCaT接种至6孔板中(每孔2mL，含5×105个细胞)，37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养24h至细胞贴壁。加入测试样品，37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养24h后，用Trizol法提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测GBA基因的表达。以等体积细胞培养液处理空白对照组(空‑ΔΔCT白对照组的基因相对表达倍数F＝1)，利用2 法计算各测试样品的F值，每个测试样品重复3次，测试结果取平均值。测试结果如表4所示。[0186] 表4[0187][0188] 测试结果表明，本发明实施例和对比例制备的发酵产物均可以增强AQP3的基因表达量，表明本发明的发酵产物可以通过增加表皮含水量来实现抗皱效果。其中，相比于对比例1‑9，实施例2‑10的二裂酵母发酵产物的对AQP3基因表达的作用更强。实施例2‑10的增强效果优于对比例1、2，说明采用本发明自主分离的阿萨希丝孢酵母和长双歧杆菌婴儿亚种进行发酵，制备得到的二裂酵母发酵产物更有利于增加皮肤细胞的AQP3，更有利于增加表皮水分含量。实施例2‑10的增强效果优于对比例3、4，说明将步骤(1)的发酵基质直接作为最终产物或者直接用长双歧杆菌婴儿亚种发酵青稞米和豆渣，其对AQP3基因表达的增强效果较差。实施例2‑10的增强效果优于对比例5‑10、实施例5和6，说明发酵的原料影响到阿萨希丝孢酵母的生长和代谢，最终影响到二裂酵母发酵产物对AQP3基因表达作用，本发明中，发酵原料优选为青稞米和豆渣，青稞米和豆渣的质量比优选为(3‑6)：(1‑4)。实施例4的增强效果优于实施例7‑10，说明菌浓和种子液的接种量影响长双歧杆菌婴儿亚种的初始生长密度，从而影响菌体的生长速度和代谢产物的生成量，导致最终二裂酵母发酵产物的对AQP3的表达的促进作用不同，本发明中，长双歧杆菌婴儿亚种种子液的菌浓最优选为810CFU/mL，长双歧杆菌婴儿亚种种子液的接种量最优选为2％(v/v)。[0189] 效果例2透明质酸合成实验[0190] 测试原理：透明质酸(HyaluronicAcid，HA)，又名玻尿酸，是D‑葡萄糖醛酸及N‑乙酰葡糖胺组成的双糖单位糖胺聚糖。透明质酸与胶原蛋白、弹性蛋白等蛋白质一起构成细胞外基质。透明质酸的保水力优异，因此认为其有助于皮肤的保湿和维持皮肤弹性，有助于减少皮肤皱纹。透明质酸主由成纤维细胞内的透明质酸合成酶(HyaluronicAcidsynthase，HAS)合成，并被透明质酸酶等分解酶分解。随着年龄的增长，成纤维细胞的增殖能力下降或透明质酸合成能力下降，则皮肤组织中的透明质酸量会降低，皮肤的保湿性和弹性受到影响，导致随着年龄增长而出现皱纹和皮肤粗糙。因此，透明质酸合成酶的表达能力可以评估样品是否具有促进皮肤弹性、减少皱纹的功效。[0191] 测试样品：实施例2‑10，对比例1‑9的发酵产物，以细胞培养液作为溶剂，制备成质量分数为1％的溶液；其中，细胞培养液为含10％FBS的H‑DMEM培养基。[0192] 测试基因：透明质酸合成酶1(HylauronicacidsynthaseI，HAS1)基因表达量。[0193] 测试方法：将人皮肤成纤维细胞接种至6孔板中(每孔2mL，含5×105个细胞)，37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养过夜。加入测试样品(以细胞培养液处理空白对照组)，37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养24h后，用ELISA法进行检测(HyaluronanQuantikineELISAKit)。用RNAisoPlus裂解细胞，收样。依据透明质酸合成酶1(Hylauronicacid‑ΔΔCTsynthaseI，HAS1)试剂盒说明书，开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR检测，利用2 法计算各测试样品的F值(空白对照组的基因相对表达倍数F＝1)，每个测试样品重复3次，测试结果取平均值。测试结果如表5所示。[0194] 表5[0195][0196][0197] 测试结果表明，本发明实施例和对比例制备的发酵产物均可以增强透明质酸合成酶1的基因表达量，表明本发明的发酵产物可以通过增加皮肤内生透明质酸的含量实现抗皱效果。其中，相比于对比例1‑9，实施例2‑10的二裂酵母发酵产物的对透明质酸合成酶1合成的促进作用更强。实施例2‑10的促进效果优于对比例1、2，说明采用本发明自主分离的阿萨希丝孢酵母和长双歧杆菌婴儿亚种进行发酵，制备得到的二裂酵母发酵产物更有利于皮肤透明质酸合成酶的生成。实施例2‑10的促进效果优于对比例3、4，说明将步骤(1)的发酵基质直接作为最终产物或者直接用长双歧杆菌婴儿亚种发酵青稞米和豆渣，制备得到的发酵产物对透明质酸合成的促进效果较差。实施例2‑10的促进效果优于对比例5‑10、实施例5和6，说明发酵的原料影响到阿萨希丝孢酵母的生长和代谢，影响到发酵基质中的营养成分，最终影响到二裂酵母发酵产物对透明质酸合成酶的生成，本发明中，发酵原料优选为青稞米和豆渣，青稞米和豆渣的质量比优选为(3‑6)：(1‑4)。实施例4的促进效果优于实施例7‑10，说明菌浓和种子液的接种量影响长双歧杆菌婴儿亚种的初始生长密度，从而影响菌体的生长速度和代谢产物的生成量，导致最终二裂酵母发酵产物的功效不同，本发明中，长8双歧杆菌婴儿亚种种子液的菌浓最优选为10CFU/mL，长双歧杆菌婴儿亚种种子液的接种量最优选为2％(v/v)。[0198] 效果例3胶原蛋白合成实验[0199] 测试原理：I型胶原蛋白(CollagenI)是真皮细胞外基质的主要成分之一，是皮肤中含量最多的胶原蛋白，由真皮成纤维细胞在胞内合成I型前胶原，分泌至胞外，在末端前胶原胁酶的作用下，端肤分离后，聚合形成胶原纤维。通过检测样品刺激成纤维细胞合成I型胶原蛋白是抗皱的重要指标。[0200] 测试样品：实施例2‑10，对比例1‑9的发酵产物，以细胞培养液作为溶剂，制备成质量分数为3％的溶液；其中，细胞培养液为含10％FBS的H‑DMEM培养基。[0201] 测试步骤：参考《T/SHRH031‑2020化妆品紧致、抗皱功效测试‑体外成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白含量测定》中的测试方法，计算I型胶原蛋白的含量；其中，空白对照为细胞培养液。每个测试样品重复3次，测试结果取平均值。测试结果如表6所示。[0202] 表6[0203] 测试样品 CollagenI相对含量/％ 测试样品 CollagenI相对含量/％空白对照 100 / /实施例2 358 对比例1 316实施例3 371 对比例2 290实施例4 410 对比例3 265实施例5 392 对比例4 282实施例6 400 对比例5 325实施例7 386 对比例6 312实施例8 405 对比例7 306实施例9 373 对比例8 333实施例10 397 对比例9 298[0204] 如表6所示，本发明实施例和对比例制备的发酵产物均可以促进I型胶原蛋白的合成，表明本发明的发酵产物可以通过增加皮肤胶原蛋白的含量来实现抗皱效果。实施例2‑10的二裂酵母发酵产物对胶原蛋白合成的促进作用优于对比例1‑9。实施例2‑10的促进效果优于对比例1、2，说明采用本发明自主分离的阿萨希丝孢酵母和长双歧杆菌婴儿亚种进行发酵，制备得到的二裂酵母发酵产物更有利于增加皮肤胶原蛋白含量。实施例2‑10的促进效果优于对比例3、4，说明将步骤(1)的发酵基质直接作为最终产物或者直接用长双歧杆菌婴儿亚种发酵青稞米和豆渣，其I型胶原蛋白合成的促进效果较差。实施例2‑10的促进效果优于对比例5‑10、实施例5和6，说明发酵的原料影响到阿萨希丝孢酵母的生长和代谢，最终影响到二裂酵母发酵产物促进I型胶原蛋白的合成效果，本发明中，发酵原料优选为青稞米和豆渣，青稞米和豆渣的质量比优选为(3‑6)：(1‑4)。实施例4的促进效果优于实施例7‑10，说明菌浓和种子液的接种量影响长双歧杆菌婴儿亚种的初始生长密度，从而影响菌体的生长速度和代谢产物的生成量，导致最终二裂酵母发酵产物的功效不同，本发明中，长双8歧杆菌婴儿亚种种子液的菌浓最优选为10 CFU/mL，长双歧杆菌婴儿亚种种子液的接种量最优选为2％(v/v)。[0205] 效果例4抗糖化实验[0206] 测试原理：糖基化反应是发生在皮肤内部的还原糖与基质蛋白之间。非酶糖基化是一系列复杂的非酶促反应，蛋白质和葡萄糖在体内发生非酶促反应形成Schiff碱和Amadori产物等早期糖基化产物，进而经过氧化、重排、交联等过程，形成不可逆的非酶糖基化终产物(AGEs)，其储存在组织中与其受体(RAGE)连接，损伤皮肤的形态和生理活动。皮肤的蛋白质一旦发生糖基化反应，就会失去柔软、弹性，导致皱纹、松弛、老化等问题。通过测试样品的抗糖基化效果可以间接反映样品的抗皱能力。[0207] 测试样品：实施例2‑10，对比例1‑9的发酵产物，用超纯水配制成质量分数为1％的溶液。[0208] 测试步骤：将PBS缓冲液(pH＝7.4，混合后浓度为0.05mol/L)，牛血清白蛋白溶液(BSA，混合后浓度为8mg/mL)及的葡萄糖溶液(混合后浓度为0.2mol/L)在60℃下避光反应40h，得到BSA‑葡萄糖糖化模型溶液。将200μL的测试样品与300μLBSA‑葡萄糖糖化模型溶液混合均匀，避光反应1h。在370nm激发波长和440nm发射波长条件下通过酶标仪检测AGEs衍生的荧光强度，计算AGEs的抑制率。每个测试样品重复三次，测试结果取平均值。[0209] AGEs抑制率(％)＝[1‑(A‑B)/(C‑D)]×100％[0210] 其中，A指加入测试样品的BSA‑葡萄糖糖化模型溶液的荧光强度；B指加入测试样品的超纯水溶液的荧光强度，即把300μLBSA‑葡萄糖糖化模型溶液替换为300μL的超纯水；C指不加入测试样品的BSA‑葡萄糖糖化模型溶液的荧光强度；D指超纯水的荧光强度。[0211] 测试结果如表7所示：[0212] 表7[0213]测试样品 抑制率/％ 测试样品 抑制率/％实施例2 91.4 对比例1 71.3实施例3 95.0 对比例2 53.6实施例4 98.3 对比例3 48.4实施例5 94.8 对比例4 58.8实施例6 96.2 对比例5 73.5实施例7 95.5 对比例6 65.1实施例8 98.1 对比例7 55.6实施例9 96.0 对比例8 75.1实施例10 97.5 对比例9 80.4[0214] 如表7所示，本发明实施例和对比例制备的发酵产物均具有抗糖化的效果，表明本发明的发酵产物可以通过抗糖基化的作用实现减缓皮肤皱纹的产生。实施例2‑10的抗糖基化效果优于对比例1‑9。实施例2‑10的抗糖基化效果优于对比例1、2，说明采用本发明自主分离的阿萨希丝孢酵母和长双歧杆菌婴儿亚种进行发酵，制备得到的二裂酵母发酵产物抗糖基化效果更佳。实施例2‑10的抗糖基化效果优于对比例3、4，说明将步骤(1)的发酵基质直接作为最终产物或者直接用长双歧杆菌婴儿亚种发酵青稞米和豆渣，抗糖基化效果较差。实施例2‑10的抗糖基化效果优于对比例5‑10、实施例5和6，说明发酵的原料影响到阿萨希丝孢酵母的生长和代谢，影响到发酵基质的营养成分，最终影响到二裂酵母发酵产物的抗糖基化效果；本发明中，发酵原料优选为青稞米和豆渣，青稞米和豆渣的质量比优选为(3‑6)：(1‑4)。实施例4的抗糖基化效果优于实施例7‑10，说明菌浓和种子液的接种量影响长双歧杆菌婴儿亚种的初始生长密度，从而影响菌体的生长速度和代谢产物的生成量，导致最终二裂酵母发酵产物的功效不同，本发明中，长双歧杆菌婴儿亚种种子液的菌浓最优8选为10CFU/mL，长双歧杆菌婴儿亚种种子液的接种量最优选为2％(v/v)。[0215] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

专利地区：广东

专利申请日期：2023-12-15

专利公开日期：2024-09-06

专利公告号：CN118207104B