含麦角硫因的酵母发酵胞溶物及其制备方法与应用

专利名称：含麦角硫因的酵母发酵胞溶物及其制备方法与应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310787915.0

专利申请（专利权）人：江苏仅三生物科技有限公司
权利人地址：江苏省南京市玄武区徐庄路6号4幢7层东侧

专利发明（设计）人：郭聪,丁威,曹娟,鞠红英,李桂瑶

专利摘要：本发明公开了一种含麦角硫因的酵母发酵胞溶物及其制备方法与应用，所述的制备方法包括如下步骤：(1)用酿酒酵母发酵产麦角硫因得到含麦角硫因的发酵液；(2)将步骤(1)得到的含麦角硫因的发酵液进行高压均质破壁后，进行超滤得到透过液；(3)将步骤(2)得到的超滤透过液经大孔吸附树脂吸附、洗脱，收集洗脱液即为含麦角硫因的酵母发酵滤液。本发明选用酿酒酵母作为麦角硫因发酵菌株，将麦角硫因与酵母菌胞溶物配合，使得最终的提取物含有麦角硫因及酵母胞溶物，可以发挥协同增效作用，进一步提高对DPPH自由基、ABTS+自由基的清除作用，延缓皮肤衰老。

主权利要求：
1.一种含麦角硫因的酵母发酵胞溶物的制备方法，其特种在于，包括如下步骤：（1）用酿酒酵母发酵产麦角硫因得到含麦角硫因的发酵液；
（2）将步骤（1）得到的含麦角硫因的发酵液进行高压均质破壁后，经固液分离，取清液进行超滤得到透过液；
（3）将步骤（2）得到的超滤透过液经大孔吸附树脂吸附、洗脱，收集洗脱液即为含麦角硫因的酵母发酵胞溶物；
步骤（1）中，所述的酿酒酵母为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，保藏号CCTCCNO：M2023893；
步骤（1）中，将具有产麦角硫因能力的酿酒酵母菌株经种子培养，发酵培养后制备得到含麦角硫因的发酵液；
步骤（2）中，所述的高压均质，压力1.0 1.9MPa，温度控制在0 30℃，破壁1 6次；
~ ~ ~
步骤（2）中，所述的超滤，超滤膜截留分子量为1KD 5KD；
~
步骤（3）中，所述的大孔吸附树脂为弱极性树脂，是以苯乙烯为单体，通过二苯乙烯苯2
交联得到的多孔型交联聚合物，树脂交联度为2 10%；比表面积≥500m/g，孔容≥0.5mL/~3
g，体积交换容量≥0.8mmol/L，湿真密度1.02～1.08g/cm；
步骤（3）中，吸附上样pH范围在4 6.5之间，上样浓度2 5g/L，上样体积1 4BV，上样流速~ ~ ~
0.5 2BV/h；洗脱剂为水，洗脱剂流速为0.5 1.5BV/h，洗脱剂用量3 5BV，麦角硫因先被洗脱~ ~ ~出，开始收集，待洗脱剂用量达到3 5BV后，结束收集；继续用水洗杂，洗杂时水的用量为2~ ~
4BV，洗杂结束后，重复上样，循环吸附、洗脱和洗杂的操作。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，破壁2次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，高压均质破壁后得到的发酵液体系中，麦角硫因浓度为0.5 5g/L，氨基酸浓度为0.5 6.5g/L，β‑葡聚糖浓度为0.5 2.5g/~ ~ ~L，甘露聚糖浓度为0.1 1.5g/L。
~
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，循环吸附、洗脱和洗杂的操作3 5个周期~后，进行树脂再生，再生采用先碱后酸工艺，柱子再生终点pH在4 6.5之间。
~
5.权利要求1 4中任意一项所述的方法制备得到的含麦角硫因的酵母发酵胞溶物。
~
6.根据权利要求5所述的含麦角硫因的酵母发酵胞溶物，其特征在于，终产品中麦角硫因含量为1 5g/L，氨基酸0.5 4.5g/L、β‑葡聚糖1 2.5g/L、甘露聚糖为0.1 1.5g/L。
~ ~ ~ ~
7.权利要求5所述的含麦角硫因的酵母发酵胞溶物在制备化妆品添加剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，含麦角硫因的酵母发酵胞溶物不需要进行提纯处理直接添加至化妆品中。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的化妆品具有抗衰和/或保湿和/或美白的功能。 说明书 : 含麦角硫因的酵母发酵胞溶物及其制备方法与应用技术领域[0001] 本发明化妆品技术领域，具体涉及一种含麦角硫因的酵母发酵胞溶物及其制备方法与应用。背景技术[0002] 酿酒酵母因其高发酵速率、安全性及耐用性被广泛用于化妆品原料的制备生产。酿酒酵母代谢产物不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、多肽等，还包含各种生物小分子如β‑葡聚糖、甘露寡糖、几丁质等，可以提供特定的生理功能来改善皮肤健康。[0003] 麦角硫因是于1909年在一种真菌中发现的化合物，是一种稀有的天然手性氨基酸，它具有很强的抗氧化性能，能够清除自由基、螯合二价金属离子、维持DNA的生物合成等。此外，其在生理pH及强碱溶液中不会自身氧化，是生物体内重要的活性物质。由于麦角硫因的这些特性，决定了其在医药、化妆品、食品饮料及生物技术领域都具有广泛的用途。[0004] 目前市面上在售的酵母菌滤液或酵母菌胞溶物，一般只有酵母菌的自身的结构构成的活性物，或者将一些其他的活性物外加至发酵液中，构成复配体系。市面上出售的麦角硫因也大多为纯品，或者一些提取复配物，未发现将含麦角硫因的酵母发酵胞溶物直接用于化妆品的报道。发明内容[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种可以直接用于化妆品中的含麦角硫因的酵母发酵胞溶物。[0006] 本发明还要解决的技术问题是提供上述含麦角硫因的酵母发酵胞溶物的制备方法。[0007] 本发明最后要解决的技术问题是提供上述含麦角硫因的酵母发酵胞溶物的应用。[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：[0009] 一种含麦角硫因的酵母发酵胞溶物的制备方法，包括如下步骤：[0010] (1)用酿酒酵母发酵产麦角硫因得到含麦角硫因的发酵液；[0011] (2)将步骤(1)得到的含麦角硫因的发酵液进行高压均质破壁后，经固液分离，取清夜进行超滤得到透过液；[0012] (3)将步骤(2)得到的超滤透过液经大孔吸附树脂吸附、洗脱，收集洗脱液即为含麦角硫因的酵母发酵胞溶物。[0013] 步骤(1)中，将具有产麦角硫因能力的酿酒酵母菌株经种子培养，发酵培养后制备得到含麦角硫因的发酵液。[0014] 本发明对酿酒酵母菌株没有特别限定，只要具有产麦角硫因能力的酿酒酵母菌株都可以实现本发明，优选酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，分类命名为SaccharomycescerevisiaeG4，保藏号CCTCC NO：M2023893。已于2023年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。[0015] 当所述的酿酒酵母为CCTCCM2023893时，[0016] 种子培养基建议为：蛋白胨5‑10g/L，酵母浸粉5‑10g/L，葡萄糖10‑40g/L，(NH4)2SO41‑10g/L,KH2PO45‑15g/L,MgSO40.1～2g/L，微量元素混合液1‑5mL/L，维生素溶液1‑5mL/L，pH5.0‑7.0。[0017] 发酵培养基配方建议为：葡萄糖15～45g/L，(NH4)2SO45‑20g/L，KH2PO45‑30g/L，MgSO41‑10g/L，微量元素混合液1‑10mL/L，维生素溶液1‑10mL/L。优选为，葡萄糖20～40g/L，(NH4)2SO410‑18g/L，KH2PO410‑15g/L，MgSO41‑5g/L，微量元素混合液1‑5mL/L，维生素溶液1‑5mL/L。[0018] 微量元素混合液配方建议为：CaCl2·2H2O1‑10g/L，ZnSO4·7H2O1‑10g/L，FeSO4·7H2O1‑10g/L，H3BO31‑5g/L，MnCl2·4H2O1‑5g/L，Na2MoO4·2H2O0.1‑1g/L，CoCl2·6H2O0.1‑1g/L，CuSO4·5H2O0.1‑1g/L，KI0.1‑1g/L，EDTA二钠10‑30g/L。[0019] 维生素溶液配方建议为：维生素20‑70mg/L，对氨基苯甲酸50‑400mg/L，维生素B30.3‑2.5g/L，泛酸钙0.5‑4g/L，盐酸吡哆醇0.5‑3g/L，肌醇10‑50g/L。[0020] 底物配方建议为：5‑25g/LL‑Arg，5‑25g/LL‑His，5‑25g/LL‑Met，5‑25g/LL‑Cys。[0021] 酿酒酵母菌株CCTCCM2023893在种子培养基中25‑30℃培养18‑36h。再转入发酵培养基中25‑30℃、通气量0.5‑2vvm,进行发酵，底物缓慢流加至发酵罐，通过液相色谱法在线检测氨基酸含量，若缺少氨基酸，则进行继续流加底物，底物流加量和流加速度保证罐体内总的氨基酸(Arg，His，Met和Cys)的终浓度0.1～5g/L范围，维持发酵罐过程pH在5.0‑7.0，发酵90～110h得发酵液。[0022] 步骤(2)中，所述的高压均质，压力1.2～1.4MPa，温度控制在0～10℃(优选2～8℃)，低温以防麦角硫因氧化，破壁1～6次(优选2次)。[0023] 步骤(2)中，高压均质破壁后得到的发酵液体系中，麦角硫因浓度为0.5～5g/L，氨基酸浓度为0.5～6.5g/L，β‑葡聚糖浓度为0.5～2.5g/L，甘露聚糖浓度为0.1～1.5g/L。[0024] 步骤(2)中，所述的固液分离为常规固液分离手段，包括但不限于板框过滤、离心、膜分离。优选膜分离，例如可以选择20‑50nm的陶瓷膜分离。固液分离的目的主要去除一些菌泥、大的杂质蛋白、多糖等大分子物质。[0025] 步骤(2)中，所述的超滤，超滤膜截留分子量为1KD～5KD。通过超滤可以去除大部分1KD以上的色素、及超过1KD以上的大分子蛋白、多糖等物质。[0026] 步骤(3)中，所述的大孔吸附树脂为弱极性树脂，是以苯乙烯为单体，通过二苯乙烯苯交联得到的具有特殊孔结构的多孔型交联聚合物，具有较高的比表面积及特定的孔结构，来满足分离及吸附需求。树脂上含有酸性或碱性基团以满足氨基酸吸附需求，其中，碱性基团为叔胺基团，酸性基团为磺酸根基团，基团数量控制在10wt％以内。树脂交联度为22～10％；比表面积≥500m/g，孔容≥0.5mL/g，体积交换容量≥0.8mmol/L，湿真密度1.02～31.08g/cm 。树脂选用大孔吸附树脂，且为弱极性。大孔吸附树脂可以满足高盐电导的流穿，弱极性可以满足对麦角硫因、氨基酸、多肽等活性物的弱吸附，从而与高盐杂质进行分离。此外，弱极性还可以实现洗脱过程的简易化，即水即可满足洗脱要求。[0027] 步骤(3)中，树脂的分离过程见图2。吸附上样pH范围在4～6.5之间，这个pH范围内麦角硫因比较稳定，上样浓度2～5g/L，上样体积1～4BV，上样流速0.5～2BV/h；洗脱剂为水，洗脱剂流速为0.5～1.5BV/h，洗脱剂用量3～5BV，麦角硫因先被洗脱出，开始收集，待洗脱剂用量达到3～5BV后，结束收集；继续用水杂质，洗杂时水的用量为2～4BV，洗杂结束后，重复上样，循环吸附、洗脱和洗杂的操作。[0028] 优选地，循环吸附、洗脱和洗杂的操作3～5个周期后，待麦角硫因纯度开始下降时进行树脂再生，再生采用先碱后酸工艺，柱子再生终点pH在4～6.5之间。一般情况下，首轮上柱吸附洗脱后，麦角硫因纯度为40wt％以上，当麦角硫因纯度下降至20wt％时，停止上柱吸附，进行树脂再生，再生后的树脂可以用于循环吸附、洗脱和洗杂的操作。[0029] 本发明中，麦角硫因纯度的检测方法为：测试溶液中麦角硫因的浓度，测试结果为a％；使用水分从测试仪将麦角硫因溶液烘干，测试其中固体的含量，测试结果为b％；麦角硫因在整个溶液中固体的占比，即为其纯度为：纯度(％)＝a％/b％*100％。[0030] 通过树脂分离主要去除大部分的盐类、残余的色素、大分子杂质等。[0031] 上述方法制备得到的含麦角硫因的酵母发酵胞溶物也在本发明的保护范围之内。[0032] 终产品中麦角硫因含量为1～5g/L，氨基酸1.5～6.5g/L、β‑葡聚糖1～2.5g/L、甘露聚糖为0.1～1.5g/L。终产品中麦角硫因纯度大约为20～65wt％。[0033] 上述含麦角硫因的酵母发酵胞溶物作为化妆品添加剂中的应用在本发明的保护范围之内。[0034] 其中，含麦角硫因的酵母发酵胞溶物不需要进行提纯处理直接添加至化妆品中。[0035] 其中，所述的化妆品具有抗衰和/或保湿和/或美白的功能。[0036] 有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优势：[0037] (1)本发明采用酿酒酵母作为麦角硫因发酵菌株，酿酒酵母胞溶物自身富含很多活性成分。[0038] (2)本发明对酵母采用高压均质的方法破壁，而非高温煮沸等方法，既可以保留活性物麦角硫因的活性，又可以将酵母菌的活性物释放到上清液中。[0039] (3)超滤膜选型选用1KD～5KD的孔径范围，既可以对发酵液有脱色效果，又可将麦角硫因及酵母菌中的多肽、小分子葡聚糖、甘露寡糖、氨基酸等有益成分保留，实现很好的分离。[0040] (4)现有技术活性物的提取一般会用到多柱串联、并使用有机溶剂的方式洗脱。本发明通过树脂选型、发酵液pH调整，通过大孔吸附树脂提取的方式，实现了单个树脂同步实现脱盐除味(流穿液)、水洗脱获取目标活性物(麦角硫因、小分子葡聚糖、寡糖、多肽及氨基酸等)。[0041] (5)本发明将麦角硫因与酵母菌发酵产物结合，对产麦角硫因的酵母发酵液进行靶向提取，保留麦角硫因及酵母发酵液中的有益成分，提升其抗氧化、抑制酪氨酸酶等性能，是一种非常好的化妆品原料。[0042] (6)本发明选用酿酒酵母作为麦角硫因发酵菌株，将麦角硫因与酵母菌胞溶物配合，使得最终的提取物含有麦角硫因及酵母胞溶物，可以发挥协同增效作用，进一步提高对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用，延缓皮肤衰老。[0043] (7)本发明制备过程中，无有机溶剂使用，作为化妆品添加剂对肌肤友好。附图说明[0044] 下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。[0045] 图1为本发明制备过程工艺流图。[0046] 图2为树脂的分离过程示意图。[0047] 图3为发酵液上柱洗脱曲线。[0048] 图4为DPPH清除率对比实验。[0049] 图5为ABTS清除率测试对比实验。[0050] 图6为非极性树脂D的测试结果。[0051] 图7为树脂柱3次上柱分离结果。[0052] 图8提取前后发酵液对比图。[0053] 图9提纯前后产品的透光率。具体实施方式[0054] 以下实施例的检测方法如下：[0055] (1)酵母菌体量测量方法：菌液稀释适当倍数后，使用分光光度计测定在OD600的吸收值，以去离子水作为空白。[0056] (2)葡萄糖浓度测定：将发酵液在8000rpm离心1min后，取上清，根据需求稀释适当倍数，采用生物传感分析仪/葡萄糖检测试剂盒测定发酵液中葡萄糖浓度。[0057] (3)麦角硫因检测方法：HPLC法。[0058] 采用HYPURITYC18(250*4.6mm,5um)色谱柱，甲酸调节水的pH至5.0，流动相为甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，流速为0.7mL/min，检测时间为20min，梯度洗脱：0‑10min，A:B＝95:5；10‑15min，A:B＝70:30；15‑20min，A:B＝95:5；柱温为室温，检测波长254nm。[0059] (4)麦角硫因胞内含量测定：将发酵液在8000rpm离心1min后，弃上清，加纯水混匀后，煮沸15min破壁，再将破壁后样品8000rpm离心1min后，弃上清，稀释一定倍数，于HPLC中测定含量。[0060] 以下实施例(除实施例6外)所用的大孔吸附树脂为弱极性树脂，是以苯乙烯为单体，通过二苯乙烯苯交联得到的具有特殊孔结构的多孔型交联聚合物，具有较高的比表面积及特定的孔结构，来满足分离及吸附需求。树脂上含有极少量10％以内的极性酸性或碱2性基团，满足氨基酸吸附需求。树脂交联度为2～10％；比表面积≥500m/g，孔容≥0.5mL/3g，体积交换容量≥0.8mmol/L，湿真密度1.02～1.08g/cm，由争光树脂公司提供。[0061] 实施例1：[0062] 1、发酵菌株：酿酒酵母菌株(CCTCCM2023893)[0063] 2、配方：[0064] 种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖30g/L，(NH4)2SO42.5g/L,KH2PO414.4g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L，微量元素混合液2mL/L，维生素溶液1mL/L，pH6.0。[0065] 发酵培养基：葡萄糖30g/L，(NH4)2SO416g/L，KH2PO414.4g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，微量元素混合液4mL/L，维生素溶液2mL/L。[0066] 微量元素混合液配方：CaCl2·2H2O4.5g/L，ZnSO4·7H2O4.5g/L，FeSO4·7H2O3g/L，H3BO31g/L，MnCl2·4H2O1g/L，Na2MoO4·2H2O0.4g/L，CoCl2·6H2O0.3g/L，CuSO4·5H2O0.1g/L，KI0.1g/L，EDTA二钠19.1g/L。[0067] 维生素溶液：维生素50mg/L，对氨基苯甲酸200mg/L，维生素B31g/L，泛酸钙1g/L，盐酸吡哆醇1g/L，肌醇25g/L。[0068] 底物配方：15g/LL‑Arg，15g/LL‑His，15g/LL‑Met，15g/LL‑Cys。[0069] 3、发酵工艺[0070] 酿酒酵母菌株在种子培养基中25‑30℃培养18‑36h。再转入发酵培养基中25‑30℃、通气量0.5‑2vvm,进行发酵，底物缓慢流加至发酵罐，通过液相色谱法在线检测氨基酸含量，若缺少氨基酸，则进行继续流加底物，底物流加量和流加速度保证罐体内总的氨基酸(Arg，His，Met和Cys)的终浓度0.1～5g/L范围，维持发酵罐过程pH在5.0‑7.0，发酵90～110h得发酵液。[0071] 实施例2：[0072] 将实施例1得到的含麦角硫因的发酵液进行高压均质破壁(1.2MPa，10℃)2次，此时，麦角硫因浓度为3.5g/L，氨基酸浓度为3.5g/L，β‑葡聚糖浓度为1.5g/L，甘露聚糖浓度为0.8g/L。[0073] 通过陶瓷膜过滤去除固体部分，清液经超滤，超滤选型为1KD截留分子量，得到透过液。[0074] 超滤透过液经大孔吸附树脂吸附，吸附上样pH调至5，上样浓度4.5g/L，上样体积2BV，上样流速1BV/h；洗脱剂为水，洗脱剂流速为1BV/h，洗脱剂用量3.5BV，麦角硫因先被洗脱出，开始收集，待洗脱剂用量达到3.5BV后，结束收集；继续用水杂质，洗杂时水的用量为3BV，洗杂结束后，重复上样，循环吸附、洗脱和洗杂的操作3次。收集的洗脱液即为含麦角硫因的酵母发酵胞溶物。经检测，终产品中麦角硫因含量为2.5g/L，氨基酸1.7g/L、β‑葡聚糖0.8g/L、甘露聚糖为0.39g/L,终产品中麦角硫因纯度45.5wt％。[0075] 提取前后发酵液对比图见图8，左边是终产品的照片，右边是超滤后的透过液。图9是提纯前后产品的透光率。透光率检测方法如下：将样品按照麦角硫因1g/L的浓度，采用分光光度计，调节至550nm波长，调为T％模式，测试其在550nm下的透光率。提纯前后的溶液采用相同的麦角硫因浓度进行测试，测试结果即为其透光率。由图8和图9可知，色素基本被去除。[0076] 实施例3：[0077] 将实施例1得到的含麦角硫因的发酵液进行高压均质破壁(1.4MPa，10℃)6次，此时，麦角硫因浓度为3.5g/L，氨基酸浓度为5.0g/L，β‑葡聚糖浓度为2.5g/L，甘露聚糖浓度为1.5g/L。[0078] 通过陶瓷膜过滤去除固体部分，清液经超滤，超滤选型为1KD截留分子量，得到透过液。[0079] 超滤透过液经大孔吸附树脂吸附，吸附上样pH调为6.5，上样浓度3.3g/L，上样体积3BV，上样流速0.5BV/h；洗脱剂为水，洗脱剂流速为0.5BV/h，洗脱剂用量3BV，麦角硫因先被洗脱出，开始收集，待洗脱剂用量达到3BV后，结束收集；继续用水杂质，洗杂时水的用量为3BV，洗杂结束后，重复上样，循环吸附、洗脱和洗杂的操作3次。收集的洗脱液即为含麦角硫因的酵母发酵胞溶物。经检测，终产品中麦角硫因含量为3.1g/L，氨基酸2.5g/L、β‑葡聚糖1.7g/L、甘露聚糖为0.8g/L,终产品中麦角硫因纯度36.7wt％。[0080] 实施例4：[0081] 将实施例1得到的含麦角硫因的发酵液进行高压均质破壁(1.1MPa，5℃)2次，此时，麦角硫因浓度为2.5g/L，氨基酸浓度为1.8g/L，β‑葡聚糖浓度为1g/L，甘露聚糖浓度为0.6g/L。[0082] 通过陶瓷膜过滤去除固体部分，清液经超滤，超滤选型为1KD截留分子量，得到透过液。[0083] 超滤透过液经大孔吸附树脂吸附，吸附上样pH5.5，上样浓度2.5g/L，上样体积3BV，上样流速0.5BV/h；洗脱剂为水，洗脱剂流速为0.5BV/h，洗脱剂用量4BV，麦角硫因先被洗脱出，开始收集，待洗脱剂用量达到4BV后，结束收集；继续用水杂质，洗杂时水的用量为2BV，洗杂结束后，重复上样，循环吸附、洗脱和洗杂的操作3次。收集的洗脱液即为含麦角硫因的酵母发酵胞溶物。经检测，终产品中麦角硫因含量为1.8g/L，氨基酸1.3g/L、β‑葡聚糖0.7g/L、甘露聚糖为0.4g/L,终产品中麦角硫因纯度40.1wt％。[0084] 实施例5：[0085] 将树脂装柱，树脂柱体积0.2L，先碱后酸进行树脂在线再生。再生后水洗pH满足4以上即可上柱。上柱样品即为过滤完1KD的超滤膜滤液。上柱体积0.4L，上样浓度5g/L，流速0.2L/h。电导率会先流穿，麦角硫因被吸附在树脂柱上。发酵液中的味道主要来源于发酵副产物，主要为醇类、醛类等物质。(测试方法是用的顶空气相色谱法)。上样完成后开始将纯水上柱进行洗脱过程，电导率降至约300us/cm附近，麦角硫因开始洗脱出来，开始进行水样收集。并使用液相色谱对其进行浓度检测。直至出水中麦角硫因浓度低于0.1g/L，则停止接样，出水转至废水收集桶。进一步用水继续洗柱子约2～4BV后，基本杂质被洗脱，柱子可进行下一次上柱。[0086] 由图3可知，在挂柱时，电导及发酵液味道先流穿，麦角硫因及活性物挂柱。待上样完成后，开始用水洗脱，初步的杂质被水进一步洗脱，待电导率进一步降低后，麦角硫因及活性物开始被洗脱下来，目标物收集，色素进一步挂柱。[0087] 实施例6：对比例[0088] 以非极性树脂D(苯乙烯骨架非极性大孔吸附树脂，从争光树脂采购，SDN系列牌号)通过其外表面和内表面的疏水性基团吸附非极性及弱极性有机分子，比表面积550～2650m /g，平均孔径3～6nm，孔容0.6～1.0ml/g)的测试过程(图6)。将树脂D装柱，树脂柱体积0.2L，先碱后酸进行树脂在线再生。再生后水洗pH满足4以上即可上柱。上柱样品即为过滤完1KD的超滤膜滤液。上柱体积0.4L，上样浓度5g/L，流速0.2L/h。通过洗脱曲线可以看出，在电导流穿的过程中，麦角硫因也同步流穿出来，无法很好的分离。[0089] 实施例7：[0090] 本发明树脂的优点在于可以多次上柱后再生。将本发明树脂装柱，树脂柱体积0.2L，先碱后酸进行树脂在线再生。再生后水洗pH满足4以上即可上柱。上柱样品即为过滤完1KD的超滤膜滤液。上柱体积0.4L，上样浓度5g/L，流速0.2L/h。经过洗脱、洗杂后再次上柱，从图7可以看出，未经过再生三次上柱，仍可满足分离需求。可以看出第三次上柱时，电导和麦角硫因的分离度开始变小，则需要进行再次再生。[0091] 实施例8：斑贴安全性测试。[0092] 测试产品：实施例2提纯后的麦角硫因酵母胞溶物溶液加防腐剂)作为受试物，对照为纯水。[0093] 受试者：35人，符合受试者志愿入选标准。[0094] 测试方法：选用合适的斑贴器材，以封闭性斑贴试验方法，将受试物约0.02～0.025,ml分别置于斑贴器内(斑贴器为10孔，每种受试物分别加2孔)，贴于受试者前臂弯曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，24h后去除受试物，分别于去除后0.5h、24h和48h观察皮肤反应，按照《化妆品安全技术规范》(2015年版)中皮肤反应粉剂标准记录结果，见表1。结果显示本发明的麦角硫因酵母胞溶物无任何皮肤不良反应，安全无刺激。[0095] 表1人体斑贴试验结果[0096][0097][0098] 备注：0为阴性反应，表示无任何皮肤不良反应，1‑4为皮肤出现不同程度不良反应，具体皮肤反应临床表现详见《化妆品安全技术规范》(2015年版)。[0099] 实施例9：DPPH自由基清除能力[0100] 皮肤是保护体内组织器官免受机械、物理、化学和生物侵袭的屏障。随着年龄增长，皮肤的保护性功能会发生一系列变化。由于自由基对皮肤细胸造成不能修复的损伤，是导致皮肤提早老化的原因之一。抗氧化剂可以防止自由基对皮肤的破坏，而人体自身产生的抗氧化剂不足以阻止自由基对皮肤的伤害，使用具有清除自由基能力的护肤原料，可以有效延缓皮肤的衰老。本申请通过检测发酵胞溶物的总抗氧化能力来评价其抗衰功效。DPPH可以评估其自由基清除能力。[0101] 测试方法：按照“TSHRH0060化妆品‑自由基(DPPH)清除”实验方法测试样品的自由基清除能力，测试浓度分别为10、20、30、40、50、60ppm，两组对比，一组采用胞溶物配置，一组采用麦角硫因纯品配置。根据TSHRH0060团体标准，1，1‑二苯基‑2‑三硝基苯肼(简称DPPH)为一种稳定的长寿面自由基，在乙醇溶液中呈现紫色，在517nm处有长吸收。当有自由基清除剂(如麦角硫因存在时)，可将DPPH褪色，吸光能力减弱。且褪色程度与其被清除的电子数呈线性关系，因此可以评价其抗氧化能力，进而可以评价其抗衰能力。[0102] 将实施例2得到的麦角硫因胞溶物与纯品的麦角硫因配置溶液，其中麦角硫因的浓度为进行DPPH清除率测试，图4对比显示麦角硫因胞溶提取物明显优于麦角硫因纯品。[0103] 实施例10：ABTS清除率测试[0104] 评估其抗衰能力，除使用DPPH清除法以外，还可以使用ABTS清除法。[0105] 测试方法:按照GB/T39100“ABTS+自由基清除法”检测不同浓度的胞溶物样品(实施例2制备得到)及纯的麦角硫因纯品的自由基清除能力(分别稀释成40、60、80、100、120ppm样品液后检测)，结果如图5所示，对比显示麦角硫因胞溶提取物明显优于麦角硫因纯品。[0106] 实施例11：[0107] 美白方面，在皮肤黑色素生物合成中，酪氨酸酶是关键酶，作用于多巴，形成多巴醌，后者自发进行一系列反应最后形成黑色素。酪氨酸酶在pH6.8的磷酸溶液中，可催化多巴转化成多巴醌，在分光光度计475nm处可测定吸光值。具有酪氨酸酶活性抑制作用的原料可以减少多巴转化成多巴醌，从而降低吸光值，根据吸光值的变化，评估原料对酪氨酸酶活性的抑制作用。[0108] 测试方法参考团体标准T/SHRH015‑2018化妆品‑酪氨酸酶活性抑制实验方法，配置麦角硫因25、100、250、500及1000ppm的溶液，测试其酪氨酸酶抑制率，结果如表2所示，可以看出麦角硫因酵母胞溶物的抑制率高于纯的麦角硫因。[0109] 表2[0110][0111] 本发明提供了一种含麦角硫因的酵母发酵胞溶物及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

专利地区：江苏

专利申请日期：2023-06-29

专利公开日期：2024-09-24

专利公告号：2024-09-24