一种基于TRIZOL裂解液的无氯仿无相分快速提取RNA的方法及其应用

专利名称：一种基于TRIZOL裂解液的无氯仿无相分快速提取RNA的方法及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410961585.7

专利申请（专利权）人：中山大学
权利人地址：广东省广州市海珠区新港西路135号

专利发明（设计）人：纪静芸

专利摘要：本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及一种基于TRIZOL裂解液的无氯仿无相分快速提取RNA的方法及其应用。针对传统TRIZOL提取RNA法操作繁琐、周期长等不足以及硅胶核酸提取法裂解能力有限的问题，本发明开发了一种以TRIZOL试剂作为硅胶核酸提取裂解液的方法（或试剂盒），该方法综合了传统TRIZOL提取和硅胶核酸提取的技术优点，简化操作流程，无需操作技巧，环保安全，既拥有TRIZOL试剂广阔的适用范围，又综合了硅胶核酸提取技术方便快捷、样品处理标准化一致性高的特点，使其适应高通量发展的需求。此外，还初步实现了RNA大小片段的分离，为RNA大小片段特别是小RNA的分离纯化提供了新的方法。

主权利要求：
1.一种基于TRIZOL的硅胶核酸提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由TRIZOL试剂、RNA漂洗液1、RNA漂洗液2和TRIZOL结合液组成；所述RNA漂洗液1由80%乙醇和0‑8M盐酸胍组成，所述RNA漂洗液2为70%‑80%乙醇，所述TRIZOL结合液由8M硫氰酸胍和0‑300mMNaAcPH5.2组成。
2.根据权利要求1所述的一种基于TRIZOL的硅胶核酸提取试剂盒，其特征在于，所述RNA漂洗液1由80%乙醇和0‑1M盐酸胍组成，所述RNA漂洗液2为80%乙醇，所述TRIZOL结合液由8M硫氰酸胍和300mMNaAcPH5.2组成。
3.一种基于TRIZOL和硅胶的无氯仿无相分快速提取RNA的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的试剂盒进行RNA提取，提取流程包括以下步骤：S1、将样品的TRIZOL匀浆与1‑3倍体积的TRIZOL结合液混匀，再加入混合液1/2‑1倍体积的无水乙醇混匀；
S2、将S1的混合液与硅胶柱孵育，使RNA和硅胶柱的结合；
S3、往硅胶柱中添加RNA漂洗液1进行漂洗；
S4、往硅胶柱中添加RNA漂洗液2进行漂洗，之后空甩、纯水洗脱，即得。
4.一种基于TRIZOL和硅胶实现RNA大小片段选择性分离的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的试剂盒进行RNA提取分离，提取流程包括以下步骤：S1、将样品的TRIZOL匀浆与1‑2倍体积的TRIZOL结合液混匀，再加入混合液1/4‑1/3倍体积的无水乙醇混匀；
S2、将S1的混合液与硅胶柱孵育，使RNA和硅胶柱的结合；
S3、往硅胶柱中添加RNA漂洗液1进行漂洗；
S4、往硅胶柱中添加RNA漂洗液2进行漂洗，之后空甩、纯水洗脱，即得大于250bp的RNA大片段组分；
S5、收集S2的流穿液，加入一倍体积的乙醇后与新的硅胶柱孵育，再经S3和S4的漂洗步骤后即得小于250bp的RNA小片段组分。
5.根据权利要求3所述的基于TRIZOL和硅胶的无氯仿无相分快速提取RNA的方法或权利要求4所述的基于TRIZOL和硅胶实现RNA大小片段选择性分离的方法，其特征在于，S2中，孵育的时间为1‑3min，孵育后10000‑20000g离心30s‑1min。
6.根据权利要求3所述的基于TRIZOL和硅胶的无氯仿无相分快速提取RNA的方法或权利要求4所述的基于TRIZOL和硅胶实现RNA大小片段选择性分离的方法，其特征在于，S3中，添加300‑600μLRNA漂洗液1，10000‑20000g离心漂洗30s‑1min。
7.根据权利要求3所述的基于TRIZOL和硅胶的无氯仿无相分快速提取RNA的方法或权利要求4所述的基于TRIZOL和硅胶实现RNA大小片段选择性分离的方法，其特征在于，S4中，添加600‑800μLRNA漂洗液2，10000‑20000g离心漂洗30s‑1min，共漂洗2‑4遍。
8.根据权利要求3所述的基于TRIZOL和硅胶的无氯仿无相分快速提取RNA的方法或权利要求4所述的基于TRIZOL和硅胶实现RNA大小片段选择性分离的方法，其特征在于，S4中，空甩1‑2min，纯水10000‑20000g洗脱1‑3min。
9.根据权利要求4所述的基于TRIZOL和硅胶实现RNA大小片段选择性分离的方法，其特征在于，S1中，当采用1倍体积的TRIZOL结合液时，再加入混合液1/4倍体积的乙醇；当采用2倍体积的TRIZOL结合液时，再加入混合液1/3倍体积的乙醇。 说明书 : 一种基于TRIZOL裂解液的无氯仿无相分快速提取RNA的方法
及其应用技术领域[0001] 本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及一种基于TRIZOL裂解液的无氯仿无相分快速提取RNA的方法及其应用。背景技术[0002] RNA提取在生物学研究和医学中至关重要，是研究基因表达和转录组分析的基础，有助于揭示基因功能和疾病机制。在临床医学上，RNA提取可以用于疾病诊断、预后评估和个性化治疗，是推动精准医学发展以及提高其治疗效果和研究深度的基础。[0003] 利用TRIZOL法提取RNA长久以来被认为是获取RNA的“黄金标准”。其中，TRIZOL溶液是由苯酚、异硫氰酸胍和其他专有成分组成的单相溶液，具有卓越的裂解多种复杂样本的能力，裂解能力强且适用范围广，可以轻松扩展以适应非常大的输入量，进而能够回收充足的RNA产量（应该是当前提取RNA产率最高的方法），同时还能有效灭活RNases，防止样本在纯化过程中降解。总体而言，TRIZOL能够保持RNA的质量、完整性和产量，使其既可以作为储存介质，又可以作为提取/纯化溶液，是目前高效提取RNA的主流经典方法。TRIZOL法提取RNA的基本步骤为：在TRIZOL溶液中溶解和均质化样本后，通过添加氯仿等溶剂促进溶液相分离，此时RNA主要存在于上层水相中，而DNA和蛋白质脂质则分别存在于中间层和下层有机相中，之后提取上层水相并通过异丙醇沉淀和乙醇漂洗等步骤进而实现RNA的分离纯化。然而，虽然TRIZOL具有高效裂解多种复杂样本、高RNA产量、有效灭活RNase防止RNA降解、可同时提取RNA，DNA和蛋白质等优点，但是其操作繁琐、周期长，需要使用有毒试剂氯仿，且需要长时间离心和多步沉淀步骤，另外吸取上层RNA水相时，还要求具备较高的操作技巧以确保RNA的回收率和质量，防止操作不当而出现酚、蛋白质和DNA的交叉污染。这些缺点使得传统的TRIZOLRNA提取法在处理多个样本时可能会显得繁琐，不适用于高通量自动化处理平台的发展。[0004] 硅胶核酸提取技术是分子生物学领域的一项开创性发现，由Boom等人在1990年发现，他们发现硅胶膜在特定条件下（如高盐和特定pH值）能够选择性地结合核酸，进而通过调控盐浓度和PH值能够实现核酸的高效分离纯化。该技术最初首先是应用于DNA提取，后来才发展出适用于RNA提取的方法，其基本步骤包括细胞裂解、硅胶结合、漂洗和核酸洗脱等过程。由于其具有操作简便，易于掌握，纯化时间短，不使用酚和氯仿等有毒试剂，不需要分层纯化，可实现自动化高通量处理等明显优势，进而成为了生物学研究中广泛应用的核酸提取方法。目前，市面上的RNeasyKits(Qiagen)和PureLinkRNAMiniKit(Invitrogen)等试剂盒都是应用该原理实现RNA高效分离纯化的代表。总体而言，这类不需要氯仿和分层的RNA提取方法，简化了操作步骤，并提高了安全性，为RNA提取/纯化提供了一种高效且可靠的手段，适用于多数实验室的日常使用，尤其是在需要处理大量样本或高通量实验时优势明显。然而，由于此类方法使用新的裂解溶液替代TRIZOL试剂（而TRIZOL试剂是目前最高效的裂解溶液，且具有广阔的适用范围），导致其在面临难以裂解的复杂样品或者容易降解的复杂样品时，仍表现出一定的局限性。目前，TRIZOL法仍然是许多实验室的首选，但这些改进的技术为研究人员提供了更多选择。[0005] 考虑到TRIZOL使用的普遍性及其强大的裂解能力和广泛的适应性，如果能以TRIZOL试剂作为硅胶核酸提取的裂解液，兼容硅胶核酸提取的流程，即无氯仿无相分离，仅需要细胞裂解、硅胶结合、漂洗和核酸洗脱等过程，则有望在降低操作繁琐性的同时，提高RNA提取/纯化的裂解能力和适用范围，以适应高通量自动化平台的发展。因此，有必要基于TRIZOL裂解液开发一种无氯仿无相分的RNA提取方法。发明内容[0006] 为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于TRIZOL裂解液无氯仿无相分的硅胶核酸提取方法，该方法综合了传统TRIZOL提取和硅胶核酸提取的技术优点，简化操作流程，无需操作技巧，环保安全，既拥有TRIZOL试剂广阔的适用范围，又综合了硅胶核酸提取技术方便快捷、样品处理标准化一致性高的特点，使其适应高通量发展的需求。[0007] 为了实现上述目的，针对传统TRIZOL提取方法需要加入氯仿，需要长时间离心制造相分离水相，吸取水相有技术要求，同时容易引入苯酚，DNA和蛋白质等其它杂质造成污染，实验耗时长，不兼容高通量自动化平台的发展。同时，传统硅胶核酸提取试剂盒采用非TRIZOL裂解液，虽然避免了氯仿和分层的步骤，但是由于裂解能力的问题，可能在一些难以裂解的复杂样品上处理有限。本发明提出了一种以TRIZOL试剂作为硅胶核酸提取裂解液的构思。首先以TRIZOL溶液为裂解液，测试了TRIZOL试剂与市面购买的硅胶柱的兼容性，判断在TRIZOL溶液背景下，RNA能否与硅胶柱结合，同时摸索优化RNA漂洗液1和RNA漂洗液2的组分，使漂洗纯化后的纯度高【OD260/280（大于1.8）和OD260/230（大于1.8）】，能兼容核酸质谱及高通量测序的最高标准。再者，摸索了硅胶与RNA结合的最适乙醇体积比（样品:乙醇=1：1），使硅胶在结合核酸时能提供最大结合能力。[0008] 另外，本发明还发现，若直接简单的将TRIZOL试剂与硅胶核酸提取法相结合，即直接将TRIZOL试剂加乙醇与硅胶柱进行结合的方法，其提取的RNA总量只能达到传统氯仿相分提取的60%左右，猜测该抑制作用可能来自于TRIZOL溶液当中的苯酚成分对RNA和硅胶柱结合的影响。因而本发明进一步开发了一种TRIZOL结合液来减缓苯酚的抑制作用，最终的RNA产量与传统氯仿相分的方式相当甚至超越，同时整个提取纯化流程最快时仅需为5min（传统TRIZOLRNA提取法大于1h甚至过夜），操作简便、一致性高，可以适应样品高通量自动化平台的处理需求。再有，在实验中本发明还意外发现当TRIZOL样品与TRIZOL结合液结合使用时，在一定的乙醇浓度下，硅胶柱对于RNA大片段（大于250bp）和小片段RNA(小于250bp)具有不同的结合偏好性，基于此，本发明开发了相应的流程，初步实现了RNA大小片段的选择性分离。当前，领域内一直认为DNA片段大小可以通过beads纯化的方式进行初步分离（AMPureXPBeads技术），而RNA片段由于具有结构而无法通过结合时的筛选实现大小分离。目前，RNA片段大小分离主要依赖于凝胶系统割胶回收，其操作复杂、流程长、RNA容易降解。而本发明为RNA大小片段的分离特别是小RNA的分离纯化提供了实验流程和补充，有利于进一步促进RNA核酸提取领域的发展。[0009] 进一步地，本发明所采用的技术方案是：[0010] 本发明第一方面提供了一种基于TRIZOL的硅胶核酸提取试剂盒，所述试剂盒包括TRIZOL试剂、RNA漂洗液1、RNA漂洗液2和TRIZOL结合液；所述RNA漂洗液1包括80%乙醇和0‑8M盐酸胍，所述RNA漂洗液2为70%‑80%乙醇，所述TRIZOL结合液包括8M异硫氰酸和0‑300mMNaAcPH5.2。[0011] 优选地，所述RNA漂洗液1包括80%乙醇和0‑1M盐酸胍，所述RNA漂洗液2为80%乙醇，所述TRIZOL结合液包括8M异硫氰酸和300mMNaAcPH5.2。针对RNA漂洗液1，对于常规组织细胞样品，不加盐酸胍仍能保持合适的核酸纯度，但是如若组织细胞样品蛋白含量高，需要添加盐酸胍成分，该组分有利于蛋白污染的去除。[0012] 优选地，所述试剂盒还包括无水乙醇。[0013] 本发明第二方面提供了一种基于TRIZOL和硅胶的无氯仿无相分快速提取RNA的方法，该方法利用第一方面所述的试剂盒进行RNA提取，提取流程包括以下步骤：[0014] S1、将样品的TRIZOL匀浆与1‑3倍体积的TRIZOL结合液混匀，再加入混合液1/2‑1倍体积的无水乙醇混匀；[0015] S2、将S1的混合液与硅胶柱孵育，使RNA和硅胶柱的结合；[0016] S3、往硅胶柱中添加RNA漂洗液1进行漂洗；[0017] S4、往硅胶柱中添加RNA漂洗液2进行漂洗，之后空甩、纯水洗脱，即得。[0018] 本发明第三方面提供了一种基于TRIZOL和硅胶实现RNA大小片段选择性分离的方法，该方法利用第一方面所述的试剂盒进行RNA提取分离，提取流程包括以下步骤：[0019] S1、将样品的TRIZOL匀浆与1‑2倍体积的TRIZOL结合液混匀，再加入混合液1/4‑1/3倍体积的无水乙醇混匀；[0020] S2、将S1的混合液与硅胶柱孵育，使RNA和硅胶柱的结合；[0021] S3、往硅胶柱中添加RNA漂洗液1进行漂洗；[0022] S4、往硅胶柱中添加RNA漂洗液2进行漂洗，之后空甩、纯水洗脱，即得大于250bp的RNA大片段组分；[0023] S5、收集S2的流穿液，加入一倍体积的乙醇后与新的硅胶柱孵育，再经S3和S4的漂洗步骤后即得小于250bp的RNA小片段组分。[0024] 优选地，针对上述的两种方法，S2中，孵育的时间为1‑3min，孵育后10000‑20000g离心30s‑1min。[0025] 优选地，针对上述的两种方法，S3中，添加300‑600μLRNA漂洗液1，10000‑20000g离心漂洗30s‑1min。[0026] 优选地，针对上述的两种方法，S4中，添加600‑800μLRNA漂洗液2，10000‑20000g离心漂洗30s‑1min，共漂洗2‑4遍。[0027] 优选地，针对上述的两种方法，S4中，空甩1‑2min，纯水10000‑20000g洗脱1‑3min。[0028] 优选地，针对所述的基于TRIZOL和硅胶实现RNA大小片段选择性分离的方法，S1中，当采用1倍体积的TRIZOL结合液时，再加入混合液1/4倍体积的乙醇；当采用2倍体积的TRIZOL结合液时，再加入混合液1/3倍体积的乙醇。[0029] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：[0030] 本发明公开了一种基于TRIZOL裂解液无氯仿无相分的硅胶核酸提取方法，该方法综合了传统TRIZOL提取和硅胶核酸提取的技术优点，简化操作流程，环保安全，使其适应高通量发展的需求。同时，本发明开发了一种TRIZOL结合液（8M异硫氰酸和0‑300mMNaAcPH5.2），通过该溶液能抵消苯酚对RNA和硅胶柱结合的抑制作用，使其达到甚至超越使用氯仿分层所获得的产量。而且，还开发了与此兼容的RNA漂洗液1（80%乙醇和0‑8M盐酸胍）和RNA漂洗液2（70%‑80%乙醇），使其纯化后的纯度（OD260/280和OD260/230）达到兼容核酸质谱及高通量测序的最高标准。此外，还意外发现利用本发明开发的TRIZOL结合液与硅胶处理样品相结合，在一定乙醇浓度下可以初步实现RNA大小片段的分离，为RNA大小片段的分离特别是小RNA的分离纯化提供了新的方法。附图说明[0031] 图1为RNA提取产物的电泳图谱（泳道1‑7为表1中7种RNA漂洗液1所获得的RNA）；[0032] 图2为RNA提取产物的电泳图谱（泳道1‑4为表2中4种RNA漂洗液2所获得的RNA）；[0033] 图3为RNA提取产物的电泳图谱（泳道1‑9为表3中不同样品体积与乙醇体积之比）；[0034] 图4为RNA提取产物的电泳图谱（泳道1‑6为表4中不同样品体积与乙醇体积之比）；[0035] 图5为RNA提取产物的电泳图谱（泳道1‑6为表5中不同TRIZOL结合液）；[0036] 图6为RNA提取产物的电泳图谱（A、B代表A、B两组实验；泳道1‑8为表6中不同TRIZOL结合液和不同乙醇体积比；[0037] 图1‑6中，M为Marker，从大到小为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。具体实施方式[0038] 下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。[0039] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。其中，下述实施例所用的硅胶纯化柱来源于Zymoresearch ,型号为C1004‑50，市面上任何聚丙烯材质（该材质可以抵抗苯酚的腐蚀作用）的硅胶柱均符合要求。[0040] 本发明立足于传统TRIZOL氯仿相分层提取RNA方法的不足，即其操作繁琐，周期长，需要使用有毒试剂氯仿，需要长时间离心分层和多步沉淀，同时实验操作对于操作者有技巧要求，容易引入苯酚等污染物，不适用于自动化高通量处理平台的搭建。同时，现有基于硅胶核酸RNA的提取技术虽然高效无氯仿无相分离步骤，且适用于高通量发展平台，但是由于使用的新型裂解液裂解能力不如TRIZOL试剂，导致其在对一些困难裂解的样品处理上有局限性。因此，本发明尝试以TRIZOL试剂作为硅胶核酸提取的裂解液，建立一种无氯仿无相分高效提取RNA的方法，使其适应高通量发展的需求。[0041] 本发明首先探索TRIZOL试剂是否与硅胶柱兼容，同时在TRIZOL背景下，探究RNA能否与硅胶柱结合，并摸索了合适的RNA漂洗液1（80%，0‑8M盐酸胍）和RNA漂洗液2（50%‑80%，最佳80%）能否除去TRIZOL试剂中的苯酚以及离液盐和去垢剂等杂质污染，使提取纯度OD260/280大于1.8，OD260/230大于1.8，该纯度将兼容高通量测序的需求。事实上，本发明的这两个漂洗液组合漂洗的结果均为OD260/280大于2.0，OD260/230大于2.0，显示出极佳的RNA纯化效果（实施例1和实施例2）。[0042] 实验中还发现虽然在TRIZOL试剂背景下RNA能与硅胶柱结合，但是其RNA提取的结果与常规总RNA提取的条带分布不同，猜测可能在这种极端的条件下RNA与硅胶柱结合时出现了偏好性。为此，进一步摸索了TRIZOL试剂与乙醇的体积比。发现当添加1/4、1/2、1的乙醇体积比时，RNA提取结果能重现经典总RNA提取的条带分布表型，其中当添加1体积的乙醇时，RNA提取呈现出最大的产量（实施例3）。同时，进一步将优化的TRIZOL试剂添加乙醇方案直接按常规的硅胶核酸提取原理和实验流程进行硅胶核酸提取，并将其与经典TRIZOL氯仿相分层的提取方法相比，发现这种TRIZOL结合乙醇的硅胶纯化方式只能获得经典TRIZOL法约60%的RNA产量（实施例4），猜测苯酚可能对RNA和硅胶柱的结合存在抑制作用。因此，进一步创造性地开发了TRIZOL结合液（8M异硫氰酸，0‑300mMNaAcPH5.2）试剂，发现加入1体积的TRIZOL结合液能达到经典氯仿相分离提取产量的95%以上，而添加2体积或者3体积的TRIZOL结合液能将产量提升约5%以上（实施例5）。至此，本发明构建了一种基于TRIZOL裂解液的无氯仿无相分硅胶核酸提取方法（试剂盒），实验流程简单便捷，最快仅需5min，同时操作可标准化高，能保证样品处理的一致性，使其适合高通量自动化平台的发展。[0043] 此外，实验中还发现，在使用本发明开发的TRIZOL结合液的基础上，再加入1/4‑1/3体积比的乙醇时，通过硅胶过柱能把总RNA中的大片段（大于250bp）进行提取，同时收集流穿液加入1体积比的乙醇溶液，再过新的硅胶柱，能把RNA小片段回收回来，因而可初步实现RNA大小片段的分离，该方法将为小RNA的高效分离纯化提供借鉴，同时也是最为快速高效且兼容高通量自动化平台的技术方案（实施例6）。[0044] 为了进一步清楚地呈现本发明基于TRIZOL裂解液建立的无氯仿无相分的硅胶核酸提取方法，下面对实施例1‑6展开详细的说明。[0045] 实施例1TRIZOL试剂与硅胶柱兼容性检测及提取过程RNA漂洗液1的摸索[0046] 实验操作如下：[0047] （1）按1×105–1×107细胞溶于1mLTRIZOL这个标准，往人293T细胞中加入700μLTRIZOL，吹打混匀后得到TRIZOL匀浆，将裂解细胞的TRIZOL匀浆分成7等份；[0048] （2）直接将TRIZOL匀浆100μL与硅胶柱孵育1min，再12000g离心30s，观察柱子有无变形，没有变形即说明该材质能抵御苯酚的腐蚀作用，通常市面上购买的柱子大多为聚丙烯材质，能兼容苯酚溶液；[0049] （3）配制表1所示的RNA漂洗液1（80%乙醇，0‑8M盐酸胍），然后往硅胶柱中添加400μL对应的RNA漂洗液1，12000g离心30s进行漂洗；[0050] （4）RNA漂洗液2则采用80%（体积比）乙醇溶液，往硅胶柱中添加700μLRNA漂洗液2后，12000g离心漂洗30s，共漂洗两遍；之后空甩1min，纯水12000g洗脱1min，留样质检。[0051] （5）实验结果：[0052] TRIZOL匀浆能直接与硅胶柱孵育结合，同时硅胶柱在TRIZOL试剂的背景中，仍然具有结合RNA的能力（如图1所示）。同时，如表1所示，这7种RNA漂洗液1都能实现很好的纯化作用，能够很好的去除TRIZOL试剂里的酚及其它离液盐和去垢剂等杂质，OD260/280大于2.0，OD260/230大于2.0，均能满足高通量测序的纯度要求。而且，这7种RNA漂洗液1处理所获得的RNA总量差不多，考虑到有时候会处理蛋白含量高的组织样品，因而保留盐酸胍组分，该组分有利于在此步骤进行去蛋白污染的处理，后续实验采用的RNA漂洗液1的组分为1M盐酸胍，80%乙醇组分。[0053] 表17种RNA漂洗液1所获得的RNA的产量和纯度[0054][0055] 实施例2基于TRIZOL的硅胶核酸提取过程RNA漂洗液2的摸索[0056] 实验操作如下：[0057] （1）将裂解293T细胞的TRIZOL匀浆分成4等份；[0058] （2）将TRIZOL匀浆100μL与硅胶柱孵育1min，再12000g离心30s；[0059] （3）往硅胶柱中添加RNA漂洗液1（80%乙醇，1M盐酸胍）400μL，12000g离心30s进行漂洗；[0060] （4）按表2配制RNA漂洗液2（50‑80%乙醇），再往硅胶柱中添加700μL，12000g离心漂洗30s，共两遍；之后空甩1min，纯水12000g洗脱1min，留样质检。[0061] （5）实验结果：[0062] 如图2所示，与实施例1结果一致，在TRIZOL背景中硅胶柱与RNA确实具有结合能力，同时从4种RNA漂洗液2的漂洗结果和产量来看，随着乙醇浓度的提高，RNA产量也随之升高，70%‑80%的乙醇产量较为合适，其中80%乙醇产量最高，同时这4种RNA漂洗液2组分都能获得高纯度，OD260/280大于2.0，OD260/230大于2.0，均满足高通量测序的纯度要求，如表2所示。后续实验中，采用80%乙醇作为RNA漂洗液2的成分。[0063] 表24种RNA漂洗液2所获得的RNA的产量和纯度[0064][0065] 实施例3基于TRIZOL的硅胶核酸提取过程最适样品体积与乙醇体积比的摸索[0066] 实验操作如下：[0067] （1）将裂解293T细胞的TRIZOL匀浆分成9等份，然后按表3添加不同体积比的无水乙醇（如1体积乙醇表示当样品为200μL时，添加200μL无水乙醇）；[0068] （2）将TRIZOL匀浆混合液与硅胶柱孵育1min（硅胶柱的容量为700μL，每次过柱上样量一般控制在700μL以下，如若过量请多次过柱直至全部匀浆混合液过柱完毕），再12000g离心30s；[0069] （3）往硅胶柱中添加RNA漂洗液1（80%乙醇，1M盐酸胍）400μL，12000g离心30s进行漂洗；[0070] （4）往硅胶柱中添加RNA漂洗液2（80%乙醇）700μL，12000g离心漂洗30s，共两遍；之后空甩1min，纯水12000g洗脱1min，留样质检。[0071] （5）实验结果：[0072] 从实施例1和2中可知，在TRIZOL溶液下，RNA和硅胶柱能结合，但是其提取的RNA具有偏好性，如图3泳道1。推测可能是以TRIZOL试剂为裂解液时，没有优化RNA与硅胶柱的结合条件导致，由于乙醇具有促进核酸与硅胶柱结合的作用，因而通过添加不同体积比的乙醇发现，优化乙醇的添加量能重现totalRNA提取时经典的条带分布表型（图3，泳道2、3、4）。同时如表3所示，当添加1体积比的乙醇时，RNA提取总量最高，尔后随着乙醇体积比的增加，RNA与硅胶柱的结合能力逐步丧失，可知添加1体积比的乙醇时，展示出最好的提取结果。[0073] 表3不同样品体积与乙醇体积之比所获得的RNA的产量和纯度[0074][0075] 实施例4基于TRIZOL的硅胶核酸提取法初步优化后的RNA产量[0076] 考察在TRIZOL裂解液中添加乙醇后直接进行硅胶提取的效果，实验操作如下：[0077] （1）将裂解293T细胞的TRIZOL匀浆分成6等份，如表4所示，第1等份按传统氯仿相分提取法【Zymo公司的RNAClean&Concentrator‑5（R1015）】进行提取，以此作为对照标准；第2‑6等份则添加不同体积比的无水乙醇（之后继续进行后续的步骤）；[0078] （2）将TRIZOL匀浆混合液与硅胶柱孵育1min，再12000g离心30s；[0079] （3）往硅胶柱中添加RNA漂洗液1（80%乙醇，1M盐酸胍）400μL，12000g离心30s进行漂洗；[0080] （4）往硅胶柱中添加RNA漂洗液2（80%乙醇）700μL，12000g离心漂洗30s，共两遍；之后空甩1min，纯水12000g洗脱1min，留样质检。[0081] （5）实验结果：[0082] 如图4和表4所示，与传统氯仿相分提取方法相比，直接在TRIZOL裂解液中添加乙醇后进行硅胶柱吸附提取的方式仅能获得小于60%的RNA产量。这可能与苯酚对RNA和硅胶柱结合的抑制作用有关（即TRIZOL组分中的苯酚成分可能抑制RNA与硅胶的结合），因而后续需要进一步优化提取流程以改善结果。[0083] 注意到，当1/4，1/2，1倍3倍体积的乙醇时，与实施例3在产量上有一定差别，推测由于两个独立实验之间采取了不同的TRIZOL匀浆，即TRIZOL溶解的起始细胞数不同导致，属于正常现象。同时由实例3和实例4结果可知，添加不同乙醇体积比获得的产量趋势是一致的，在1倍乙醇体积时达到最高产量，尔后随着乙醇增加，产量随之下降。两个独立实验都取得了较一致的纯度（OD260/280和OD260/230都为2左右），说明该核酸提取策略是比较稳定的。[0084] 表4不同样品体积与乙醇体积之比所获得的RNA的产量、纯度和回收率[0085][0086] 实施例5在基于TRIZOL的硅胶核酸提取法的基础上进一步开发TRIZOL结合液，并与常规TRIZOL氯仿相分离法比较提取效果[0087] 实验操作如下：[0088] （1）将裂解293T细胞的TRIZOL匀浆分成4等份，并进行两组实验，1‑4为一组，5‑8为一组。如表5所示，1和5为采用传统氯仿相分法按Zymo公司的RNAClean&Concentrator‑5（R1015）提取RNA，以此作为对照标准；其余处理组则添加相应的TRIZOL结合液（8M硫氰酸胍，0‑300mMNaAcPH5.2），并加入1体积比的无水乙醇，混匀（如1体积TRIZOL结合液表示当样品为200μL时，添加200μLTRIZOL结合液，并加入400μL的无水乙醇）；[0089] （2）将TRIZOL混合液与硅胶柱孵育1min，再12000g离心30s；[0090] （3）往硅胶柱中添加RNA漂洗液1（80%乙醇，1M盐酸胍）400μL，12000g离心30s进行漂洗；[0091] （4）往硅胶柱中添加RNA漂洗液2（80%乙醇）700μL，12000g离心漂洗30s，共漂洗两遍；之后空甩1min，纯水12000g洗脱1min，留样质检。[0092] （5）实验结果：[0093] 如图5所示，不同TRIZOL结合液（8M硫氰酸胍，0‑300mMNaAcPH5.2）均能很好地缓解苯酚对RNA和硅胶结合的抑制作用，其中1体积TRIZOL结合液时已达传统TRIZOL氯仿分层提取效果的95%以上，如表5所示。而2体积TRIZOL结合液和3体积TRIZOL结合液，已逐渐达到甚至超越传统TRIZOL氯仿分层提取的效果，提升效果在5%以上，同时OD260/280大于2.0，OD260/230大于2.0，均满足高通量测序的纯度要求。[0094] 表5不同TRIZOL结合液所获得的RNA的产量、纯度和回收率[0095][0096] 实施例6利用基于TRIZOL的硅胶核酸提取法实现RNA大片段（＞250bp）小片段（＜250bp）分离[0097] 实验操作如下：[0098] （1）将裂解293T细胞的TRIZOL匀浆分成4等份，共进行A、B两组实验。如表6所示，其中A组为使用1体积TRIZOL结合液（8M硫氰酸胍，300mMNaAcPH5.2）+不同体积比的无水乙醇；B组为使用2体积TRIZOL结合液（8M硫氰酸胍，300mMNaAcPH5.2）+不同体积比的无水乙醇；混匀；[0099] （2）将TRIZOL混合液与硅胶柱孵育1min，再12000g离心30s；[0100] （3）往硅胶柱中添加RNA漂洗液1（80%乙醇，1M盐酸胍）400μL，12000g离心30s进行漂洗；[0101] （4）往硅胶柱中添加RNA漂洗液2（80%乙醇）700μL，12000g离心漂洗30s，共漂洗两遍；之后空甩1min，纯水12000g洗脱1min，留样质检（此为A5‑A8，B5‑B8RNA大片段结合样）。[0102] （5）收集步骤（2）对应处理的流穿液A1‑4，B1‑4，分别添加1体积乙醇混匀，并将混合液添加到另一个新的硅胶柱进行孵育1min，12000g离心30s，再重复步骤（3）和（4）的操作进行留样质检（此为RNA小片段结合样）。注意：大小片段漂洗过程【即步骤（3）和（4）】可同时进行。[0103] （6）实验结果：[0104] 添加TRIZOL结合液后发现，不同体积比的乙醇具有能区分RNA大小片段的偏好性，因此进一步摸索了添加1体积比和2体积比TRIZOL结合液后，再添加0，1/4，1/3，1/2体积比的乙醇后的提取效果，同时回收流穿液再添加1体积乙醇进行再回收，各实验处理及其结果如表6和图6所示。[0105] 从表6和图6可以发现，添加1体积TRIZOL结合液中的A6、A7处理组和添加2体积TRIZOL结合液中的B7处理组（其中最佳组为A6），这三个处理能实现RNA大片段（大于250bp）和RNA小片段（小于250bp）的分离。[0106] 当前，领域内通常认为很难通过RNA与硅胶柱的吸附在结合阶段将大小片段进行有效分离，通常采用割胶回收的方式实现大小片段的分离。然而本发明的实验结果显示，本发明通过优化提取条件和流程，利用TRIZOL试剂和硅胶核酸提取实现了RNA大小片段的分离，这将为相关领域特别是小RNA的高效分离提供新的方法，同时该方法应该是目前最简洁高效实现RNA大小片段初步分离的方式，最快时间仅需6.5min。[0107] 表6根据不同TRIZOL结合液和不同乙醇体积比所设置的实验条件[0108][0109] 综上可见，本发明开发了一种以TRIZOL试剂作为硅胶核酸提取裂解液的方法（或试剂盒），与传统TRIZOL提取方法相比，无需氯仿无需相分层，操作简单，耗时短，最快仅需5min即可完成，同时产量与传统TRIZOL提取效果相当甚至超越，且改进了传统TRIZOL提取流程，使其兼容高通量自动化平台的发展需求。此外，还初步开发了实现RNA大小片段分离的方法流程，为相关领域特别是小RNA的高效分离提供新的方法。[0110] 以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

专利地区：广东

专利申请日期：2024-07-18

专利公开日期：2024-09-27

专利公告号：2024-09-27