一种降低多种药用植物土壤病害的单一菌剂及其应用方法

专利名称：一种降低多种药用植物土壤病害的单一菌剂及其应用方法

专利类型：实用新型专利

专利申请号：CN202410203025.5

专利申请（专利权）人：丽江师范高等专科学校,中国科学院昆明植物研究所
权利人地址：云南省丽江市古城区新团片区存信路

专利发明（设计）人：莫新春,刘维暐,王玲,寇灿,余成华

专利摘要：本申请涉及生物技术领域，本申请中的可降低多种药用植物土壤病害的类香味菌(Myroides sp.)WNR22032，通过菌液配置，灌根处理，可以有效降低药用植物滇重楼、滇黄精、滇黄芪、半夏在种植栽培过程中的土壤根际病害发生率，对于药用植物种植盛产有着重要的应用意义和推广价值，且其无需多种营养液配比或多菌种配比，为单一菌剂，制备容易且成本低廉，适用广泛、操作简便，有效填补了该技术空白。

主权利要求：
1.一株可降低药用植物土壤病害的类香味菌(Myroidessp.)WNR22032，其特征在于，该菌株于2024年01月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M
2024138，分类命名为类香味菌。
2.一种降低多种药用植物土壤病害的单一菌剂，其特征在于，由权利要求1所述的类香味菌WNR22032作为活性成分。
3.如权利要求2所述的降低多种药用植物土壤病害的单一菌剂，其特征在于，还包括无
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菌水，且通过无菌水将类香味菌WNR22032配置为初始浓度1×10 cfu/ml。
4.权利要求1所述的类香味菌WNR22032或者是权利要求2中所述的菌剂在降低药用植物土壤病害中的应用；所述药用植物为滇重楼、滇黄精、滇黄芪或者是半夏，土壤病害为根腐病和茎腐病。
5.权利要求1所述的类香味菌WNR22032或者是权利要求2中所述的菌剂在降低多种药用植物土壤病害中的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)选择一年生药用植物幼苗，种植于栽培基质内；
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(2)定植一周内，将类香味菌WNR22032通过无菌水配置为初始浓度1×10 cfu/ml的菌剂母液，接着将菌剂母液稀释为100倍菌液后沿栽培的药用植物根系直接浇灌，灌根后保持土壤基质湿度为50％‑60％；
(3)在药用植物整个生长期，多次施用步骤(2)中的100倍菌液，于药用植物生长至3年后，进行采收；
所述药用植物为滇重楼、滇黄精、滇黄芪或者是半夏；土壤病害为根腐病和茎腐病。
6.如权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述栽培基质的pH值为6.0‑7.0，腐殖质含量为20‑30％。
7.如权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述步骤(3)中分别于每年3‑4月、7‑8月，施用两次步骤(2)中的100倍菌液，并维持栽培区域土壤基质湿度不低于50％，经三年生长后采收。 说明书 : 一种降低多种药用植物土壤病害的单一菌剂及其应用方法技术领域[0001] 本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种降低多种药用植物土壤病害的单一菌剂及其应用方法。背景技术[0002] 我国作为农业种植大国，每年种植的作物种类繁多，如：农作物、药材、盆栽绿植等；种植过程中对病害的预防治理又是重中之重，植物真菌病害是目前最为主流的病害，会引起植物减产、传染、区域死亡甚至绝收等情况。其中，滇重楼、滇黄精、滇黄芪、半夏在我国云南地区广泛种植，因其优良的药用价值和保健价值，被加工成不同规格和作用的产品。[0003] 目前云南省范围，由于药用植物连续种植，部分种植区已产生了连作障碍，大大降低了药材产量，且病害防治工作成本激增。目前针对药用植物种植的治理工作基本上都是通过喷洒农药进行治理，但其效果有限，且治理效果时间容易根据季节和天气影响受到变化。通过外施微生物菌群，除了可以与土壤中原有的有益微生物共同形成优势菌群，促进土壤生态系统中碳、氮、氧等元素的良性循环，还可以修复土壤生态环境，减少有害菌对植株根状茎的侵染和伤害，对药用植物种植栽培过程的病害防治起到积极作用。[0004] 云南是我国生物多样性资源分布大省，药用植物资源亦非常丰富，药材产业的发展和资源利用水平领先全国。但种植栽培技术能力相对落后，多数种植栽培基地土壤带病严重，病害防治形势严峻。现阶段，通过复合菌群进行土壤改良技术已在不断发展，但应用尚少，且因为复合菌群实际施用过程中菌液配置较为复杂，操作繁琐，对病害控制方面尚无报道。通过单一菌剂进行土壤改良及增产以及果蔬病害防治的相关研究已有报道，但其往往需要辅以多种微量元素及有机物的营养液，且其专一性较强，尚无针对多种药用植物降低其土壤病害的单一菌剂报道。[0005] 本发明拟提供一种降低多种药用植物土壤病害的单一菌剂，其获取容易且施用过程操作简便，对土壤基质没有毒副作用，便于推广应用，在国内尚属首创。发明内容[0006] 本发明提供了一株可降低多种药用植物土壤病害的类香味菌(Myroidessp.)WNR22032，利用该菌株作为活性成分制备成的单一菌剂，该菌剂制备容易且施用过程操作简便，对土壤基质没有毒副作用，能有效降低药用植物根际病害发生率。[0007] 本发明还提供了一种降低多种药用植物土壤病害的单一菌剂，由类香味菌WNR22032作为活性成分。[0008] 本发明中提供的降低多种药用植物土壤病害的单一菌剂，还包括无菌水，且通过11无菌水将类香味菌WNR22032配置为初始浓度1×10 cfu/ml，作为菌剂母液使用。[0009] 本发明还提供了一种上述类香味菌WNR22032或者是单一菌剂在降低多种药用植物土壤病害中的应用。[0010] 本发明中的类香味菌WNR22032或者是上述单一菌剂在降低多种药用植物土壤病害中的具体应用方法，包括以下步骤：[0011] (1)选择一年生药用植物幼苗，种植于栽培基质内；[0012] (2)定植一周内，将类香味菌WNR22032通过无菌水配置为初始浓度1×1011cfu/ml的菌剂母液，接着将菌剂母液稀释为100倍菌液后沿栽培的药用植物根系直接浇灌，灌根后保持土壤基质湿度为50％‑60％；[0013] (3)在药用植物整个生长期，多次施用步骤(2)中的100倍菌液，于药用植物生长至3年后，进行采收。[0014] 进一步地，所述药用植物为滇重楼、滇黄精、滇黄芪或者是半夏。[0015] 进一步地，所述栽培基质的pH值为6.0‑7.0，腐殖质含量为20‑30％，排水和涵水能力适中的壤土基质。[0016] 进一步地，所述步骤(3)中分别于每年3‑4月、7‑8月，施用两次步骤(2)中的100倍菌液，并维持栽培区域土壤基质湿度不低于50％，经三年生长后采收。[0017] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：[0018] 本发明通过由类香味菌WNR22032作为活性成分制备成的单一菌剂，针对药用植物一年生幼苗进行灌根处理，能有效降低药用植物根际病害发生率，对于药用植物种植栽培区具有重要的推广应用价值；同时，本发明中的单一菌剂获取容易，且不同于其他技术中需多种营养液配比或多菌种配比，具有制备、操作简便且便于推广。[0019] 应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。[0020] 生物保藏信息：类香味菌WNR22032该菌株于2024年01月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2024138，分类命名为类香味菌。保藏地址：中国.武汉.武汉大学邮编：430072。具体实施方式[0021] 下面将参照实施例更详细地描述本申请的实施方式。虽然实施例中显示了本申请的实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本申请更加透彻和完整，并且能够将本申请的范围完整地传达给本领域的技术人员。[0022] 应当理解，尽管在本申请可能采用术语“第一”、“第二”、“第三”等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。[0023] 菌株的分离筛选：[0024] 从种植基地采集带有泥土的滇黄精根，用自来水洗掉滇黄精根表面的泥土，削除外皮。接着用无菌水冲洗1遍，1％NaClO溶液浸泡2分钟，无菌水冲洗3次，75％乙醇浸泡2分钟，无菌水浸泡3次(2分钟/次)，无菌条件下切取0.1g根，加入1mL无菌水轻柔研磨；适当稀释后，涂布在阿须贝固氮培养基上，28℃培养7天，并根据细菌生长情况，挑取新长出的菌株至新的LB固体培养基，之后，通过划线法纯化最终获得纯菌株并保存，将其命名为WNR22032。[0025] 阿须贝固氮培养基配方为：甘露醇10.0g，磷酸氢二钾0.2g，七水硫酸镁0.2g，氯化钾0.2g，二水硫酸铵0.2g，碳酸钙5.0g，pH7.2。[0026] LB培养基(g/L)配方为：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，pH7.0，灭菌30min。[0027] 菌株分子生物学鉴定：[0028] 提取WNR22032菌株DNA，PCR扩增及扩增产物进行序列分析。[0029] 引物：27F(5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’；[0030] 1492R(5’‑TACGACTTAACCCCAATCGC‑3’。[0031] 反应体系：2×TaqPCRMasterMix12.5μL、上下游引物各1μL、DNA模板1μL、ddH2O10μL；反应程序：95℃10min；93℃30s，50℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。[0032] PCR产物送交北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，测序数据拼接后用NCBI进行比对，鉴定菌株WNR22032种属为类香菌属(Myroidessp.)。[0033] 菌株WNR2203216sDNA测序组装结果如SEQIDNO.1所示:[0034] gatgaacgctagcggcaggcctaacacatgcaagtcgaggggtatagagagcttgctttctagagaccggcggatgggtgagtaacgcgtatgcaacctaccttttacaggggaatagcccggagaaattcggattaatgctccatggtttatatgaatggcatcgtttatataataaagatttatcggtaaaagatgggcatgcgtatcattagctagttggtgtggtaacggcataccaaggctacgatgattaggggtcctgagagggagatcccccacactggtactgagacacggaccagactcctacgggaggcagcagtgaggaatattggtcaatggaggcaactctgaaccagccatgccgcgtgcaggatgacggtcctatggattgtaaactgcttttgtacgggaagaaatgtaattacgagtaattatttgacggtaccgtaagaataaggatcggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggaggatccgagcgttatccggaattattgggtttaaagggttcgtaggcggttgagtaagtcagtggtgaaatcttatagcttaactataaaattgccgttgatactgcttgacttgaatagtatggaagtaattagaatatgtagtgtagcggtgaaatgcttagatattacatggaataccaattgcgaaggcagattactacgtacttattgacgctgatgaacgaaagcgtgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatggatactagctgttcggttttcggactgagtggccaagcgaaagtgataagtatcccacctggggagtacgttcgcaagaatgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgatacgcgaggaaccttaccaaggcttaaatgtagattgacaggtttagagatagacttttcttcggacaatttacaaggtgctgcatggttgtcgtcagctcgtgccgtgaggtgtcgggttaagtcctataacgagcgcaacccctattgttagttgccagcgggtcaagccgggaactctaacaagactgccggtgcaaaccgtgaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcacggcccttacgtcttgggctacacacgtgctacaatggccagtacagaaagcagctaccaggcaactggatgcgaatctcaaaaactggtctcagttcggattggagtctgcaactcgactccatgaagctggaatcgctagtaatcggatatcagccatgatccggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaagccatggaagccgggggtacctgaagtcggtcgccgcaaggagctgcctagggtaaaactggtaactagggct[0035] 实施例1[0036] 通过无菌水将类香味菌WNR22032配置为初始浓度1×1011cfu/ml的菌剂母液，将该菌剂母液用于对药用植物土壤病害进行防治。[0037] 具体包括如下步骤：[0038] (1)在2021年，选择丽江万农生物开发有限公司于云南省丽江市古城区七河镇胜利村小组大寨田种植基地，田间分别种植有一年生滇重楼、滇黄精、滇黄芪、半夏幼苗，其栽培土壤基质为pH值6.0‑7.0、呈微酸性环境，腐殖质含量约为20‑30％，且排水和涵水能力适中的壤土基。[0039] (2)采用由菌剂母液稀释制备的100倍菌液灌根，沿定植的滇重楼根系直接浇灌，保障根区周际土壤基质完全湿润；之后采用土壤湿度测定仪，保持根区土壤湿度为50％‑60％。[0040] (3)之后于当年7‑8月以及2022、2023年3‑4月、7‑8月施用菌剂，并维持栽培区域土壤基质湿度不低于50％，于2023年年底采收。[0041] 测定滇重楼、滇黄精、滇黄芪、半夏根际病害发病情况。[0042] 对照例1[0043] 本对照例1与实施例1中不同的地方在于：本对照例采用由菌剂母液稀释制备的10倍菌液灌根，其余均相同。[0044] 测定滇重楼、滇黄精、滇黄芪、半夏根际病害发病情况。[0045] 对照例2[0046] 本对照例1与实施例1中不同的地方在于：本对照例采用由菌剂母液稀释制备的1000倍菌液灌根，其余均相同。[0047] 测定滇重楼、滇黄精、滇黄芪、半夏根际病害发病情况。[0048] 对照例3[0049] 本对照例3与实施例1的区别在于：本对照例中菌剂选择河北荣恒肥业有限公司11(生产许可号：微生物肥(2018)准字(3219)号)生产的枯草芽胞杆菌(初始浓度2X10 cfu/g)11制备为初始浓度1×10 cfu/ml的菌剂母液，其余均相同。[0050] 对照例4[0051] 本对照例4与实施例1的区别在于：本对照例中菌剂选择潍坊奥丰作物病害防治有限公司(生产许可号：微生物肥(2018)准字(4885)号)生产的哈茨木霉菌(初始浓度10 111X10 cfu/g)制备为初始浓度1×10 cfu/ml的菌剂母液，其余均相同。[0052] 对照例5[0053] 本对照例5与实施例1的区别在于：本对照例中选择实施例1及对照例3中提供的菌11剂，制备成1×10 cfu/ml的两种菌混合母液，混合浓度比例为1：1，其余均相同。[0054] 对照例6[0055] 本对照例6与实施例1的区别在于：本对照例中选择实施例1及对照例4中提供的菌11剂，制备为初始浓度1×10 cfu/ml的两种菌混合母液，混合浓度比例为1：1，其余均相同。[0056] 对照例7[0057] 本对照例7与实施例1的区别在于：本对照例中选择对照例3及对照例4提供的菌11剂，制备为初始浓度1×10 cfu/ml的两种菌混合母液，混合浓度比例为1：1，其余均相同。[0058] 对照例8[0059] 本对照例8与实施例1的区别在于：按照实施例1、对照例3及对照例4提供的菌剂，11制备为初始浓度1×10 cfu/ml的三种菌混合母液，混合浓度比例为1：1：1，其余均相同。[0060] 对照例9[0061] 本对照例9与实施例1的区别在于：施用时间不同。[0062] 具体地，本对照例中选择在2022年度田间种植的第三年滇重楼、滇黄精、滇黄芪、半夏幼苗，其栽培土壤基质为pH值6.0‑7.0左右微酸性环境，腐殖质含量约为20‑30％，排水和涵水能力适中的壤土基质。然后按照实施1中的施用方法进行灌根。[0063] 对照例10[0064] 本对照例10与实施例1的区别在于：施用时间不同。[0065] 具体地，本对照例中选择2023年度田间种植的第四年滇重楼、滇黄精、滇黄芪、半夏幼苗，其栽培土壤基质为pH值6.0‑7.0左右微酸性环境，腐殖质含量约为20‑30％左右，排水和涵水能力适中的壤土基质。然后按照实施1中的施用方法进行灌根。[0066] 对照例11[0067] 本对照例与实施例1的区别在于，不采用菌剂灌根措施，一年生幼苗经种植三年后，测定滇重楼、滇黄精、滇黄芪、半夏根际病害发病情况并进行比较。[0068] 统计实施例1以及所有对照例中的根际病害发病情况，结果如下所示：[0069] 表1不同菌液浓度对药用植物根际病害的防治效果比较[0070][0071] 表2不同菌剂对药用植物根际病害的防治效果比较[0072][0073][0074] 表3不同施用年份对药用植物根际病害的防治效果比较[0075][0076] 由表1可以看出，对比实施例1及对照例11，施用WNR22032菌剂后，从幼苗第二年生长开始，即能有效抑制根际病害发生，经多年生长至采收前，仍可将根际病害控制在一个较低水平，保障了药用植物生产安全。[0077] 对比实施例1及对照例1、对照例2，过高或过低的菌液浓度，其针对根际病害的抑制能力下降，过高浓度会导致菌群密度过高，生长抑制，影响施用效果，过低浓度则因为菌群密度不足，导致施用效果降低。[0078] 由表2可以看出，对比实施例1及对照例3、对照例4，相比于市场上售卖的枯草芽胞杆菌及哈茨木霉菌，WNR22032对根际病害发生的抑制能力更强。[0079] 对比实施例1及对照例5、对照例6、对照例7、对照例8，当采用复合菌群对药用植物幼苗灌根处理的过程中，尽管相比于不施用的条件(对照例11)，根际病害发生率略有下降，但不同菌株间产生拮抗，其病害抑制效果均劣于单独施用WNR22032菌液，因此也说明WNR22032作为一种可以独立施用的单一菌剂，具有显著的优势。[0080] 由表3可以看出，即使在已经染病的药用植物种植基质中施用WNR22032菌液，也可以有效抑制病害发展。[0081] 通过比较实施例1、对照例9、对照例10、对照例11，可以明显看出连续三年、生长后两年、生长最后一年施用菌液对土壤病害发生的抑制效果，即施用越早，连续施用时间越长，越能抑制土壤病害发生，保护药用植物生产及采收。[0082] 综上所述，本发明提供的降低多种药用植物土壤病害的单一菌剂，其菌种来源清晰，获取容易，在实际应用中能有效降低药用植物栽培种植过程中土壤病害发生率。[0083] 本发明不同于其他技术发明中需多种营养液配比或多菌种配比，制备容易且成本低廉，能有效降低药用植物根际病害发生率，对于药用植物种植栽培区具有重要的推广应用价值，且通过单一菌种制备菌液操作简便且便于推广，有效填补了该技术空白。[0084] 以上已经描述了本申请的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

专利地区：云南

专利申请日期：2024-02-23

专利公开日期：2024-09-27

专利公告号：2024-09-27