石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料及其应用、生物传感器

专利名称：石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料及其应用、生物传感器

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202211010003.4

专利申请（专利权）人：信阳师范大学
权利人地址：河南省信阳市浉河区长安路237号

专利发明（设计）人：许婧,黄克靖,刘吟冰,谢宛珍,胡思波,韦正楠

专利摘要：本发明属于复合功能材料及生物传感分析技术领域，具体涉及一种石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料及其应用、生物传感器。本发明的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料，由包括以下步骤的方法制成：1)在惰性气体保护下，将四正丁基氟化铵、六(三甲硅基乙炔基)苯在溶剂中于0～4℃搅拌反应10～20min，然后水洗、除水、过滤得到固相产物；2)将步骤1)得到的固相产物分散于溶剂中，然后与石墨烯、铜盐、吡啶混合，在惰性气体保护下，于20～30℃下反应20～28h，反应后洗涤、干燥，即得。本发明制备所得夹层材料，为石墨炔@石墨烯@石墨炔三层夹心结构材料，具有导电性好、层间距大、形貌均匀的特点，可以作为检测多元miRNAs的生物传感器的电极修饰材料以提高检测灵敏度。

主权利要求：
1.一种石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料在制备检测肿瘤标志物miRNA‑21和/或miRNA‑
141的生物传感器中的应用，其特征在于，所述检测肿瘤标志物miRNA‑21和/或miRNA‑141的生物传感器，包括电极基体、电解质溶液、电极表面的电极修饰材料以及固定在电极修饰材料上的核酸适配体；所述电极修饰材料为石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料，所述电解质溶液由含有葡萄糖、乙醇、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的磷酸盐缓冲液组成；
所述固定是采用末端含有硫醇基的核酸适配体，与金纳米颗粒通过Au‑S键结合，由此固定在石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料上；
所述石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料由包括以下步骤的方法制成：
1)在惰性气体保护下，将四正丁基氟化铵、六(三甲硅基乙炔基)苯在溶剂中于0～4℃搅拌反应10～20min，然后水洗、除水、过滤得到固相产物；
2)将步骤1)得到的固相产物分散于溶剂中，然后与石墨烯、铜盐、吡啶混合，在惰性气体保护下，于20～30℃下反应20～28h，反应后洗涤、干燥，即得；
所述石墨烯、铜盐、吡啶的用量比为(9～11)mg∶(90～110)mg∶(45～55)mL。
2.如权利要求1所述的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料在制备检测肿瘤标志物miRNA‑
21和/或miRNA‑141的生物传感器中的应用，其特征在于，所述核酸适配体与miRNA‑21和/或miRNA‑141特异性结合，所述电极基体为碳布电极。
3.如权利要求1所述的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料在制备检测肿瘤标志物miRNA‑
21和/或miRNA‑141的生物传感器中的应用，其特征在于，步骤1)中，所述四正丁基氟化铵以四正丁基氟化铵溶液的形式加入，四正丁基氟化铵溶液采用的溶剂为四氢呋喃，四正丁基氟化铵溶液的浓度为0.8～1.2mol/L。
4.如权利要求1所述的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料在制备检测肿瘤标志物miRNA‑
21和/或miRNA‑141的生物传感器中的应用，其特征在于，四正丁基氟化铵溶液、六(三甲硅基乙炔基)苯、溶剂的用量比为(2.5～3.5)mL∶(290～310)mg∶(90～110)mL。
5.如权利要求1所述的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料在制备检测肿瘤标志物miRNA‑
21和/或miRNA‑141的生物传感器中的应用，其特征在于，步骤1)中，所述溶剂为二氯甲烷；
所述除水为采用干燥剂除水。
6.如权利要求1所述的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料在制备检测肿瘤标志物miRNA‑
21和/或miRNA‑141的生物传感器中的应用，其特征在于，步骤2)中，所述溶剂为二氯甲烷；
所述铜盐为醋酸铜；分散步骤1)得到的固相产物时，采用的溶剂用量为(90～110)mL。
7.如权利要求1所述的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料在制备检测肿瘤标志物miRNA‑
21和/或miRNA‑141的生物传感器中的应用，其特征在于，步骤2)中，将固相产物分散于溶剂中，然后与石墨烯、铜盐、吡啶混合，具体步骤是：先将石墨烯、铜盐、吡啶三者混合得复合分散液，然后取15～25mL的复合分散液与溶剂分散后的固相产物混合。 说明书 : 石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料及其应用、生物传感器技术领域[0001] 本发明属于复合功能材料及生物传感分析技术领域，具体涉及一种石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料及其应用、生物传感器。背景技术[0002] 核酸(包括DNA和RNA)不仅是新冠病毒目标检测物，同时也是肿瘤、心脑血管等重大疾病的生物学标志物。近年来，恶性肿瘤因其发病机制复杂、高危因素难控等特点，已成为威胁我国居民健康的主要因素之一。因此，探索肿瘤疾病相关的早期诊断方法，从而实现肿瘤疾病早期治疗是当今医学及分析化学领域亟需解决的问题。[0003] 作为一类非编码单链RNA分子，MicroRNA(miRNA)与肿瘤形成、发展、转移等各个环节息息相关，是一种无创型生物学标志物。然而，miRNAs相似度高，在细胞中表达水平低且对体外研究环境要求苛刻，其高灵敏分析仍面临巨大挑战。此外，癌症发生伴随着多种miRNAs标志物含量的变化，对多种miRNAs进行同时检测有利于提高诊断准确性。然而，现有的多数分析平台适用于单一miRNA的检测且依赖贵重仪器对信号进行读取，不利于复杂生物样品的实时检测和诊断。[0004] 目前，miRNA的检测方法主要有比色法、荧光法和电化学传感器。常用的比色法和荧光法虽在灵敏度和选择性方面展现出特有优势，但它们存在分析时间长、样品需求量大、成本高等不足。电化学传感器具有仪器简单、灵敏度高、分析时间短和成本低的多重优点，为miRNA的灵敏准确分析提供了新思路。而采用纳米材料修饰或直接利用纳米材料作为电极有望提升传感器的检测灵敏度。[0005] 石墨炔作为一种新型的二维碳基纳米材料，在高度离域的π共轭体系中同时具有2sp和sp 两种杂化类型的碳原子，具有规则的平面内孔隙、较大的层间距离、比表面积、优异的电子离子传导能力等特性，使其在电化学基础研究和电分析应用中显示巨大潜力。然而，单层石墨炔容易团聚、比表面积不高以及无序的结构，使其难以发挥出最大优势。[0006] 此外，随着社会的发展进步，远程和个性化的医疗保健成为发展趋势。通过实时远程健康监测、数据传输可扩展现有的医疗系统服务能力，可使优质的医疗诊断拓展至偏远地区。智能检测器的广泛普及，对于低成本、可便携、实时诊断传感平台的开发具有重要的推进作用，也为生物传感装置在家庭医疗保健中的应用提供了可能。[0007] 因此，开发一种新型石墨炔材料，使之能够满足可视化、便捷、高灵敏、多元miRNAs分析传感平台的构建要求，对肿瘤早期诊断具有重要意义。发明内容[0008] 为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料，该材料具有石墨炔@石墨烯@石墨炔三层夹心结构，具有导电性好、层间距大、形貌均匀的特点，可以作为检测多元miRNAs的生物传感器的电极修饰材料以提高检测灵敏度。[0009] 本发明的目的还在于提供一种上述石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料在检测肿瘤标志物miRNAs方面的应用。[0010] 本发明的目的还在于提供一种生物传感器，以提高多元miRNAs的检测灵敏度和特异性。[0011] 为实现上述目的，本发明的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料的具体技术方案为：[0012] 一种石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料，由包括以下步骤的方法制成：[0013] 1)在惰性气体保护下，将四正丁基氟化铵、六(三甲硅基乙炔基)苯在溶剂中于0～4℃搅拌反应10～20min，然后水洗、除水、过滤得到固相产物；[0014] 2)将步骤1)得到的固相产物分散于溶剂中，然后与石墨烯、铜盐、吡啶混合，在惰性气体保护下，于20～30℃下反应20～28h，反应后洗涤、干燥，即得。[0015] 本发明提供的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料在制备时，先将四正丁基氟化铵、六(三甲硅基乙炔基)苯反应得到固相产物六乙基苯，然后将其与石墨烯、铜盐、吡啶进行共混反应，得到石墨炔/石墨烯/石墨炔三层夹心结构的复合材料。其中，六乙基苯作为单体，在铜盐存在下发生埃格林顿反应，在上述反应过程中，由于石墨炔和石墨烯之间的范德华相互作用以及与石墨烯之间的晶格匹配，石墨炔在石墨烯薄片的两侧生长。该材料中，石墨炔片层呈现出超薄的层状结构，具有较大的比表面积和层间距，不仅能够提高电化学反应中电极表面的离子、电子的快速转移，还能够为金纳米颗粒以及miRNAs生物探针的负载和固定提供丰富的活性位点，从而为多元miRNAs的检测提供物质基础，提高其特异性识别能力，有效提升miRNAs检测的电化学活性和检测灵敏度。[0016] 石墨炔是一种有序的二维(2D)碳同素异形体，由具有高度共轭的sp和sp2杂化碳原子组成，具有自然的带隙和优越的电化学性能。与传统的碳材料相比，它具有更温和制备环境和优越的电子‑离子导电性，避免了传统碳材料的结构分散，然而，由于传统石墨炔的低比表面积和无序结构，其性能尚未得到充分发挥。而结构调节是改善材料性能的最直接、最有效的方法。本发明通过溶液范德华外延策略成功在石墨烯上合成得到超薄单晶石墨炔薄膜，异质结处的弱分子‑底物相互作用极大地放松了石墨炔和石墨烯之间的大晶格失配。石墨烯的存在不仅具有外延模板的作用，其原子平面有利于平面内耦联，保证了少层石墨炔的合成，而且由于其单原子层和优异的电学性能，提高了石墨炔@石墨烯@石墨炔异质结构的比表面积和电导率。此外，利用石墨烯的低成本，实现了高质量的石墨炔@石墨烯@石墨炔的大规模生产。[0017] 为使反应有效进行，优选地，步骤1)中，所述四正丁基氟化铵以四正丁基氟化铵溶液的形式加入，四正丁基氟化铵溶液采用的溶剂为四氢呋喃，四正丁基氟化铵溶液的浓度为0.8～1.2mol/L，更优选为1.0mol/L。[0018] 优选地，四正丁基氟化铵溶液、六(三甲硅基乙炔基)苯、溶剂的用量依次为(2.5～3.5)mL∶(290～310)mg∶(90～110)mL；更优选的用量为3mL∶300mg∶100mL。[0019] 进一步地，步骤1)中，所述溶剂为二氯甲烷；所述除水为采用干燥剂除水，干燥剂可采用现有技术中常用的干燥剂如无水硫酸镁、无水硫酸钠等。[0020] 作为进一步优选的方案，步骤2)中，所述溶剂为二氯甲烷；所述铜盐为醋酸铜。本发明采用二氯甲烷用于辅助脱保护过程，并提高铜盐的溶解度。[0021] 分散步骤1)得到的固相产物时，采用的溶剂用量为(90～110)mL；优选为100mL。[0022] 由于石墨烯、铜盐等原料均为固体，为使反应过程更为顺利地进行，保证反应的均匀性，优选地，步骤2)中，将固相产物分散于溶剂中，然后与石墨烯、铜盐、吡啶混合，具体步骤是：先将石墨烯、铜盐、吡啶三者混合得复合分散液，然后取15～25mL的复合分散液与溶剂分散后的固相产物混合，优选取20mL复合分散液。[0023] 为了保证石墨烯的外延模板效果，并保证少层石墨炔的合成以及夹心结构的构建，进一步地，所述复合分散液配制时，石墨烯、铜盐、吡啶的用量依次为(9～11)mg∶(90～110)mg∶(45～55)mL，更优选地，石墨烯、铜盐、吡啶的用量依次为10mg∶100mg∶50mL。[0024] 本发明的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料的应用的具体技术方案为：[0025] 一种石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料在检测肿瘤标志物miRNAs方面的应用。[0026] 进一步优选地，所述miRNAs为miRNA‑21、miRNA‑141中的至少一种。[0027] 本发明的用于检测肿瘤标志物miRNAs的生物传感器的技术方案为：[0028] 一种用于检测肿瘤标志物miRNAs的生物传感器，包括电极基体、电解质溶液、电极表面的电极修饰材料以及固定在电极修饰材料上的核酸适配体；所述电极修饰材料为如上所述的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料。[0029] 优选地，所述核酸适配体与miRNAs特异性结合，所述电极基体为碳布电极，所述电解质溶液由含有葡萄糖、乙醇、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的磷酸盐缓冲液组成。更优选地，所述电解质溶液为10mM的磷酸盐缓冲液，其中含有5mM葡萄糖、10mM乙醇和5mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。[0030] 进一步地，所述固定可以是，采用末端含有硫醇基的核酸适配体，与金纳米颗粒通过Au‑S键结合，由此固定在石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料上。[0031] 本发明的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料在用于检测miRNAs时，具有较高的检测灵敏度和特异性，因此在miRNAs检测方面具有广阔的应用前景。附图说明[0032] 图1为本发明实施例1制备的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料的结构图；[0033] 图2为本发明实施例1制备的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料的扫描电镜图；[0034] 图3为本发明实施例1制备的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料的透射电镜图；[0035] 图4为本发明实施例4制备的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料复合金纳米颗粒的高倍透射图；[0036] 图5为本发明实施例4制备的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料复合金纳米颗粒的XPS图；[0037] 图6为本发明实施例4制备的生物阳极在不同底液的循环伏安曲线；[0038] 图7为本发明实施例4制备的生物阴极在不同底液的循环伏安曲线；[0039] 图8为本发明实施例4制备的生物传感器在不同浓度miRNA‑21中开路电压图；[0040] 图9为本发明实施例4制备的生物传感器在不同浓度miRNA‑141开路电压图；[0041] 图10为本发明实施例4制备的生物传感器对miRNA‑21检测选择性图；[0042] 图11为本发明实施例4制备的生物传感器对miRNA‑141检测选择性图。具体实施方式[0043] 以下结合附图以及具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步介绍。以下实施例中，EDC/NHS来自阿拉丁试剂有限公司；适配体miRNA‑21、适配体miRNA‑141来自上海生工生物技术有限公司；探针miRNA‑21、探针miRNA‑141来自上海生工生物技术有限公司。以下实施例中，采用的石墨烯，来自于苏州碳丰石墨烯科技有限公司。[0044] 一、石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料的实施例[0045] 实施例1[0046] 本实施例的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料，采用包括以下步骤的方法制备得到：[0047] 1)在氩气保护下，将3mL四正丁基氟化铵溶液(溶剂为四氢呋喃，浓度为1mol/L)加入到含有300mg六(三甲硅基乙炔基)苯和100mL二氯甲烷的溶液中，于0℃避光搅拌反应15min，然后采用去离子水水洗，再采用无水硫酸镁除水、过滤得到固相产物；[0048] 2)将步骤1)得到的固相产物分散于100mL的二氯甲烷中，然后将其加入到含有20mL石墨烯、铜盐、吡啶混合分散液的三颈烧瓶中，在氩气气体保护下，于25℃下避光反应24h，反应后依次采用吡啶、N,N‑二甲基甲酰胺、1mol/L盐酸、去离子水洗涤，然后真空干燥，得到粉末状的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料。其中，铜盐为醋酸铜；石墨烯、铜盐、吡啶混合分散液是以10mg石墨烯、50mL吡啶和100mg醋酸铜配制得到。[0049] 实施例2[0050] 本实施例的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料，采用包括以下步骤的方法制备得到：[0051] 1)在氩气保护下，将2.5mL四正丁基氟化铵溶液(溶剂为四氢呋喃，1mol/L)加入到290mg六(三甲硅基乙炔基)苯和90mL二氯甲烷的溶液中，于0℃避光搅拌反应10min，然后采用去离子水水洗，再采用无水硫酸镁除水、过滤得到固相产物；[0052] 2)将步骤1)得到的固相产物分散于90mL的二氯甲烷中，然后将其加入到含有15mL石墨烯、铜盐、吡啶混合分散液的三颈烧瓶中，在氩气气体保护下，于25℃下避光反应24h，反应后依次采用吡啶、N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)、1mol/L盐酸、去离子水洗涤，然后真空干燥，得到粉末状的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料。其中，铜盐为醋酸铜，石墨烯、铜盐、吡啶混合分散液是以10mg石墨烯、50mL吡啶和100mg醋酸铜配制得到。[0053] 实施例3[0054] 本实施例的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料，采用包括以下步骤的方法制备得到：[0055] 1)在氩气保护下，将3.5mL四正丁基氟化铵溶液(溶剂为四氢呋喃，1mol/L)加入到310mg六(三甲硅基乙炔基)苯和110mL二氯甲烷的溶液中，于0℃避光搅拌反应20min，然后采用去离子水水洗，再采用无水硫酸镁除水、过滤得到固相产物；[0056] 2)将步骤1)得到的固相产物分散于110mL的二氯甲烷中，然后将其加入到含有25mL石墨烯、铜盐、吡啶混合分散液的三颈烧瓶中，在氩气气体保护下，于25℃下避光反应24h，反应后依次采用吡啶、N,N‑二甲基甲酰胺、1mol/L盐酸、去离子水洗涤，然后真空干燥，得到粉末状的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料。其中，铜盐为醋酸铜，石墨烯、铜盐、吡啶混合分散液是以10mg石墨烯、50mL吡啶和100mg醋酸铜配制得到。[0057] 二、材料应用以及生物传感器的实施例[0058] 实施例4[0059] 本实施例将实施例1的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料用于检测肿瘤标志物miRNAs。[0060] 本实施例的检测肿瘤标志物miRNAs的生物传感器，包括电极基体、电极表面的电极修饰材料、以及固定在电极修饰材料上的核酸适配体；所述电极修饰材料为实施例1的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料。所述核酸适配体与miRNAs特异性结合，所述电极基体为碳布电极。其中，所述电极修饰材料上的核酸适配体末端含有硫醇基，与金纳米颗粒通过Au‑S键结合，并固定在实施例1所述的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料上。[0061] 上述生物传感器的具体构建过程如下：[0062] (1)将0.01g实施例1制得的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料溶于10mL水，然后取5mL，加入100μL质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液和50μL质量浓度为1％的HAuCl4溶液，于70℃搅拌1h，然后于8000rpm转速下离心，离心后产物采用超纯水洗涤3次，然后在10mLDMF中分散，得分散液于4℃保存备用，由此将金纳米颗粒锚定在石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料上。[0063] (2)将50μL、1μM的探针H21和50μL、1mg/mL的EDC/NHS(1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺‑N‑羟基丁二酰亚胺)在室温下混合1h，然后采用焦碳酸二乙酯(DEPC)在超滤离心机中纯化8次，得处理后的探针H21，以便后续与葡萄糖氧化酶(GOD)结合。[0064] 另将500μL、5mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOD)和1mg的sulfo‑SMCC混合，然后用振荡器振荡1h，振荡后在PBS超滤管中离心去除多余的Sulfo‑SMCC，以活化GOD；[0065] 将活化的GOD和处理后的H21混合，4℃保存48h，在超滤离心机中用DEPC纯化8次。GOD通过酶末端羧基与H21探针末端氨基结合形成酰胺键，得到探针H21和葡萄糖氧化酶的混合物(H21‑GOD)；[0066] 参照H21‑GOD的制备方法制备出探针H141和乙醇脱氢酶(ADH)的混合物(H141‑ADH)。[0067] 其中，探针H21、探针H141具有发夹结构，当目标物miRNA‑21和miRNA‑141出现时，可分别打开H21‑GOD与H141‑ADH的发夹结构并与其进行碱基互补配对，从而使探针和酶的混合物附着在阳极上，阳极产生电子，阴极得到电子，产生信号响应。[0068] (3)将50μL步骤(1)得到的分散液滴到碳布电极表面，于真空条件下，37℃干燥2h；然后将电极浸于1mg/mL的EDC/NHS溶液中30min，再采用超纯水冲洗，继续滴加1μM的适配体探针Apt21和是适配体探针Apt141各30μL，室温孵育2h，然后加入牛血清(BSA)和6‑巯基‑1‑己醇(MCH)各30μL，37℃孵育30min，得到生物阳极，4℃保存待用。[0069] 另外，将50μL步骤(1)得到的分散液滴到碳布电极表面(1cm×1cm)。真空条件下，37℃干燥2h，然后将电极浸于1mg/mL的EDC/NHS溶液中30min，再采用超纯水冲洗，然后将30μL、5mg/mL的胆红素氧化酶(BOD)滴入电极表面，得到生物阴极，4℃孵育12h保存待用。[0070] (4)将5mL步骤(1)得到的分散液与0.5mL、1mg/mL的EDC/NHS混合，在上述溶液中同时加入步骤(2)所得400μLH21‑GOD和400μLH141‑ADH，4℃保存12h，然后加入30μL、1mM的6‑巯基‑1‑己醇(MCH)和牛血清(BSA)孵育30min；孵育后将沉淀物加入PBS(含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠pH7.4的缓冲溶液)溶液中进行均匀分散，得到生物共轭物，于4℃下保存。[0071] 其中，生物共轭物探针H21和适配体探针Apt21可与目标物miRNA‑21进行部分碱基互补配对；生物共轭物探针H141和适配体探针Apt141可与目标物miRNA‑141进行部分碱基互补配对。从而捕获目标检测物，使生物传感器产生增强信号响应。[0072] (5)传感器构建时，采用的电解质为10mL、10mM的PBS，其中含有5mM葡萄糖、10mM乙醇和5mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，生物阳极、生物阴极采用步骤(3)制备得到的电极材料。具体测试时加入不同浓度的双miRNAs(miRNA‑21和miRNA‑141)以及步骤(4)制备得到的生物共轭物分散液，生物阳极发生氧化反应产生电子，生物阴极发生还原反应得到电子OCV产生电信号，打开电压值记录为E ，从而实现多元miRNAs的检测。[0073] 三、对比例[0074] 对比例1[0075] 本对比例的材料，采用的制备方法如下：[0076] 1)在氩气保护下，将3mL四正丁基氟化铵溶液(溶剂为四氢呋喃，浓度为1mol/L)加入到含有300mg六(三甲硅基乙炔基)苯和100mL二氯甲烷的溶液中，于0℃避光搅拌反应15min，然后采用去离子水水洗，再采用无水硫酸镁除水、过滤得到固相产物；[0077] 2)将步骤1)得到的固相产物分散于100mL的二氯甲烷中，然后将其加入到含有20mL醋酸铜、吡啶混合分散液(以50mL吡啶和100mg醋酸铜配制得到)的三颈烧瓶中，在氩气气体保护下，于25℃下避光反应24h，反应后依次采用吡啶、N,N‑二甲基甲酰胺、1mol/L盐酸、去离子水洗涤，然后真空干燥，得到石墨炔材料。[0078] 对比例2[0079] 本对比例的材料，采用的制备方法如下：[0080] 1)在氩气保护下，将3mL四正丁基氟化铵溶液(溶剂为四氢呋喃，浓度为1mol/L)加入到含有300mg六(三甲硅基乙炔基)苯和100mL二氯甲烷的溶液中，于0℃避光搅拌反应15min，然后采用去离子水水洗，再采用无水硫酸镁除水、过滤得到固相产物；[0081] 2)将步骤1)得到的固相产物分散于100mL的二氯甲烷中，然后将其加入到含有20mL醋酸铜、吡啶混合分散液(以50mL吡啶和100mg醋酸铜配制得到)的三颈烧瓶中，在氩气气体保护下，于25℃下避光反应24h，反应后依次采用吡啶、N,N‑二甲基甲酰胺、1mol/L盐酸、去离子水洗涤，然后真空干燥，得到石墨炔材料，进一步将石墨炔材料与4mg石墨烯进行物理混合，得到石墨烯/石墨炔复合材料。[0082] 四、试验例[0083] 试验例1形貌和结构表征[0084] 图1为本发明的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料的结构图。由图1可知，本发明的复合材料具有石墨炔@石墨烯@石墨炔的三层夹心结构。[0085] 采用扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、X射线光电能谱仪(XPS)对本发明实施例1、实施例4所涉及材料的表面形貌进行表征。结果如图2～5所示。[0086] 由图2的SEM图可知，本发明的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料中，石墨炔表现为超薄的层状结构，具有优异的电化学性能和比表面积，从而能够为金纳米颗粒材料的负载提供良好的环境，更有利于提高传感器的灵敏度和分析性能。[0087] 图3的TEM图，进一步说明了复合材料中的石墨炔呈现良好的超薄结构。[0088] 图4为本发明实施例4步骤(1)处理后，石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料与金纳米颗粒复合后的高倍透射图。由图4可知，金纳米颗粒在石墨炔表面分布均匀、密集，说明金纳米已成功锚定在石墨炔上，金纳米颗粒和石墨炔具有良好的电导率，能加速电子转移速率，进而提高传感器的性能。其中石墨烯的晶格条纹为0.24nm，石墨炔晶格条纹0.465nm。该数据与文献一致，表明复合材料的制备成功。[0089] 图5为本发明实施例4步骤(1)处理后，石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料与金纳米颗粒复合后材料的XPS图。由图5可知，石墨炔以及石墨炔复合金纳米颗粒样品均含有C和O元素，在石墨炔复合金纳米颗粒材料的XPS谱中可以观察到明显的Au4f。以上研究表明，本发明成功地制备了石墨炔复合金纳米颗粒，并能显著改善电子转移。[0090] 试验例2电化学传感性能实验[0091] 电化学试验采用三电极体系，在法国Bio‑LogicScienceInstruments公司的OCVVMP3多通道电化学工作站上进行循环伏安(CV)、开路电压(E )等电化学测试。在三电极体系中，以铂电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极，工作电极为生物阳极或生物阴极。[0092] 用于电化学CV测试的生物阳极的制备：将本发明步骤(1)得到的分散液滴加50μL到碳布电极表面，于真空条件下，37℃干燥2h；然后将电极浸于1mg/mL的EDC/NHS溶液中30min，再采用超纯水冲洗。然后滴加葡萄糖氧化酶、乙醇脱氢酶各50μL，然后4℃保存12h，制备出仅用于电化学CV测试的生物阳极。[0093] 测试过程时：将准备好的生物阳极在四种不同底液(PBS缓冲溶液、含5mM葡萄糖的PBS缓冲溶液(pH7.4)、含5mM葡萄糖、10mM乙醇的PBS缓冲溶液(pH7.4)、含5mM葡萄糖、10mM乙醇、5mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的PBS缓冲溶液(pH7.4))中进行测试。结果如图6所示。[0094] 图6即为生物阳极在不同底液中的循环伏安曲线。其中曲线a指代PBS缓冲溶液中生物阳极的CV，b指代生物阳极在含5mM葡萄糖的PBS缓冲溶液(pH7.4)中的CV；c指代生物阳极在含5mM葡萄糖、10mM乙醇的PBS缓冲溶液(pH7.4)中的CV；d指代生物阳极在含5mM葡萄糖、10mM乙醇、5mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的PBS缓冲溶液(pH7.4)中的CV。[0095] 由图6可知，在仅是PBS缓冲溶液(pH7.4)的情况下，生物阳极在约‑0.5V处有两个明显的氧化还原峰(曲线a)，这是葡萄糖氧化酶的特征峰。当在底物溶液中加入葡萄糖时，CV的氧化峰明显增加(曲线b)。可能的原因是葡萄糖氧化需要耗氧量，而CV峰的偏差可能与葡萄糖氧化产物有关。当PBS溶液中含有5mM葡萄糖和10mM乙醇时，得到两组还原电流峰和氧化电流峰(曲线c)，结果表明可以同时检测到双通量miRNAs。而当加入5mM葡萄糖、10mM乙醇和5mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸时，观察到两组更明显的氧化还原峰(曲线d)。可见，本发明中采用葡萄糖、乙醇、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的三元组合能够有效放大氧化还原效果，从而方便实现多元miRNAs的检测。[0096] 以下对本发明实施例4步骤(3)得到的生物阴极在三种不同底液(含氮气、空气饱和溶液和氧气饱和溶液的PBS缓冲溶液(pH7.4)中的性能进行测试。测试过程为：采用三电极体系，电化学试验在法国Bio‑LogicScienceInstruments公司的VMP3多通道电化学工作站上进行。结果如图7所示。[0097] 图7中，曲线a指代含氮气的PBS缓冲溶液(pH7.4)中的CV，b指代含空气饱和溶液的PBS缓冲溶液(pH7.4)中的CV；c指代含氧气饱和溶液的PBS缓冲溶液(pH7.4)中的CV。由图7生物阴极在不同底液的循环伏安曲线可知，本发明的生物阴极在氧气饱和条件下表现出更强的氧化还原活性。[0098] 以下对本发明实施例4构建得到的生物传感器的开路电压进行测试，结果如图8、9所示。[0099] 图8为本发明的生物传感器在不同浓度miRNA‑21中的开路电压图。图8A为不同miRNA‑21浓度的(a‑j：0、0.05、0.1、0.5、1、5、10、100、1000、10000fM，单位飞摩尔)的开路电压。由图8A可知，随着miRNA‑21浓度的增加，开路电压逐渐增加，这是由于生物阳极结合葡萄糖氧化酶数量的增加所致。图8B为不同miRNA‑21浓度对应的开路电压的变化。图8C为开路电压与miRNA‑21的对数之间的线性关系。由图8C可知，miRNA‑21在0.05‑10000fM范围内表现出良好的线性关系。[0100] 图9为本发明的生物传感器在不同浓度miRNA‑141中开路电压图。图9A为不同miRNA‑141浓度的(a‑j：0,5,10,50,100,500,1000,5000,10000fM)的开路电压。由图9A可知，随着miRNA‑141浓度的增加，开路电压逐渐增加，这是由于生物阳极结合乙醇脱氢酶数量的增加所致。图9B为不同miRNA‑141浓度对应的开路电压的变化，图9C为开路电压与miRNA‑141的对数之间的线性关系。由图9C可知，miRNA‑141在1‑10000fM线性范围内表现出良好的线性关系。[0101] 以下采用试验例2相同的方法对本发明实施例1和对比例1～2制备所得材料所构建的生物传感器的灵敏度进行检测。其中，检出限计算公式为LOD＝3δ/S。式中，LOD为检出限，δ空白标准偏差，S为标准曲线在低范围浓度内的斜率。结果如表1所示。[0102] 表1本发明实施例和对比例对应的传感器的检测灵敏度[0103][0104] 由表1可知，相较于对比例，本发明的生物传感器能够实现多元miRNAs的高灵敏度检测。[0105] 试验例3特异性检测实验[0106] 本实施例对本发明的生物传感器的检测特异性进行评估。检测方法同试验例2。[0107] 图10为本发明的生物传感器对miRNA‑21检测选择性图。实验过程中选择了三个miRNA(miRNA‑141、miRNA‑155和miRNA‑199a)和具有三个碱基的错配链(smRNA、tmRNA和NC)作为干扰miRNA(浓度均为1μM)。如图10所示，干扰miRNAs的开路电压值远低于miRNA‑21，说明该生物传感器对靶标miRNA‑21具有良好的选择性。[0108] 图11为本发明的生物传感器对miRNA‑141检测选择性图。选择了三个miRNA(miRNA‑21、miRNA‑155和miRNA‑199a)和具有三个碱基的错配链(smRNA、tmRNA和NC)作为干扰miRNA(1μM)。如图11显示，干扰miRNAs的开路电压值远低于miRNA‑141，说明该生物传感器对靶标miRNA‑141具有良好的选择性。[0109] 综上可知，本发明的石墨炔@石墨烯@石墨炔夹层材料在用于检测miRNAs时，具有较高的检测灵敏度和特异性，因此在miRNAs检测方面具有广阔的应用前景。

专利地区：河南

专利申请日期：2022-08-22

专利公开日期：2024-09-27

专利公告号：2024-09-27