一种司美格鲁肽的制备方法发明专利

专利名称：一种司美格鲁肽的制备方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410329732.9

专利申请（专利权）人：福建基诺厚普生物科技有限公司
权利人地址：福建省莆田市秀屿区笏石镇丙仑村仁洋288号

专利发明（设计）人：田茂奎,何志泉,黄伟铭,叶智铭,傅东明,陈程云,许金行,王睿睿,范琳琳,张格维,何政霖,陈立涵,林煌雄

专利摘要：本发明提供了一种司美格鲁肽的制备方法，以树脂为固相载体，按照司美格鲁肽的一级序列，通过固相合成方法，从C端到N端依次偶联氨基酸和二肽片段，得到司美格鲁肽全保护树脂，经裂解、纯化得到司美格鲁肽；所述二肽片段包括7~8二肽片段、9~10二肽片段、12~13二肽片段、17~18二肽片段、21~22二肽片段、24~25二肽片段以及34~35二肽片段，其中7~8二肽片段为Boc‑His(Trt)‑Aib‑OH、9~10二肽片段为Fmoc‑Glu(OtBu)‑G1y‑OH、12~13二肽片段为Fmoc‑Phe‑Thr(tBu)‑OH、17~18二肽片段为Fmoc‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑OH、21~22二肽片段为Fmoc‑Glu(OtBu)‑G1y‑OH、24~25二肽片段为Fmoc‑Ala‑Ala‑OH、34~35二肽片段为Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑OH。通过本发明方法制备的司美格鲁肽收率高、纯度高。

主权利要求：
7 8 9
1.一种司美格鲁肽的制备方法，所述司美格鲁肽的氨基酸序列为H‑His‑Aib ‑Glu ‑10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23Gly ‑Thr ‑Phe ‑Thr ‑Ser ‑Asp ‑Val ‑Ser ‑Ser ‑Tyr ‑Leu ‑Glu ‑Gly ‑Gln ‑24 25 26 27 28 29 30 31
Ala ‑Ala ‑Lys (AEEA‑AEEA‑G1u(α‑Octadecanedioic))‑Glu ‑Phe ‑Ile ‑Ala ‑Trp ‑32 33 34 35 36 37
Leu ‑Val ‑Arg ‑Gly ‑Arg ‑Gly ‑OH，其特征在于，所述制备方法包括：以树脂为固相载体，按照司美格鲁肽的一级序列，通过固相合成方法，从C端到N端依次偶联氨基酸和二肽片段，得到司美格鲁肽全保护树脂，经裂解、纯化得到司美格鲁肽；
其中，所述二肽片段包括7 8二肽片段、9 10二肽片段、12 13二肽片段、17 18二肽片~ ~ ~ ~段、21 22二肽片段、24 25二肽片段以及34 35二肽片段；
~ ~ ~
所述7 8二肽片段为Boc‑His(Trt)‑Aib‑OH、所述9 10二肽片段为Fmoc‑Glu(OtBu)‑~ ~G1y‑OH、所述12 13二肽片段为Fmoc‑Phe‑Thr(tBu)‑OH、所述17 18二肽片段为Fmoc‑Ser~ ~(tBu)‑Ser(tBu)‑OH、所述21 22二肽片段为Fmoc‑Glu(OtBu)‑G1y‑OH、所述24 25二肽片段~ ~为Fmoc‑Ala‑Ala‑OH、所述34 35二肽片段为Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑OH；
~
所述树脂为DEG‑Wang树脂，所述DEG‑Wang树脂的取代度为0.2 0.6mmol/g；
~
所述制备方法包括：
（1）将Fmoc‑Gly‑OH与树脂进行偶联，得到Fmoc‑Gly‑树脂；
（2）脱除步骤（1）制得的所述Fmoc‑Gly‑树脂上的Fmoc，再依次偶联Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH、Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Trp(Boc)‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Phe‑OH、Fmoc‑G1u(OtBu)‑OH和Fmoc‑Lys(Mmt)‑OH，得到Fmoc‑Lys(Mmt)‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑树脂；
（3）脱除步骤（2）制得的所述Fmoc‑Lys(Mmt)‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑树脂上Lys侧链的Mmt保护基，在Lys上偶联侧链Dde‑AEEA‑AEEA‑OH，脱除保护基Dde后，在AEEA上偶联侧链Octa(OtBu)‑Glu‑OtBu得到Fmoc‑Lys[AEEA‑AEEA‑G1u(α‑Octa(OtBu)]‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑树脂；
（4）在步骤（3）制得的Fmoc‑Lys[AEEA‑AEEA‑G1u(α‑Octa(OtBu)]‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑树脂上偶联氨基酸Fmoc‑Ala‑Ala‑OH、Fmoc‑Gln(Trt)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑Gly‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Phe‑Thr(tBu)‑OH、Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑Gly‑OH、Boc‑His(Trt)‑Aib‑OH，得到司美格鲁肽全保护树脂Boc‑His(Trt)‑Aib‑Glu(OtBu)‑Gly‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Asp(OtBu)‑Val‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑Leu‑Glu(OtBu)‑Gly‑Gln(Trt)‑Ala‑Ala‑Lys[AEEA‑AEEA‑G1u(α‑Octa(OtBu）]‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑树脂；
（5）将步骤（4）制备的所述司美格鲁肽全保护树脂裂解、析晶、抽滤和干燥，得到司美格鲁肽粗品；
（6）将步骤（5）制得的所述司美格鲁肽粗品纯化、冻干得到司美格鲁肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述裂解包括使用TFA/EDT/TIS/UPW/苯酚裂解液，所述裂解液通过如下方法制备：配制体积比例为TFA/EDT/TIS/UPW=90/5/2.5/2.5的第一溶液，然后向所述第一溶液加入苯酚，所述苯酚的重量为所述第一溶液重量的2.5%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化包括采用RP‑HPLC，其中，色谱柱为反相C18柱，流动相为0.1%三氟醋酸/乙腈。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述DEG‑Wang树脂的取代度为0.4~0.6mmol/g。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述Fmoc的脱保护剂为PIP/DMF溶液，PIP的体积浓度为20% 50%。
~
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，脱除所述Fmoc‑Arg（Pbf）‑Gly‑Wang树脂的Fmoc时，脱保护剂进一步含有HOBt。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，用于所述Mmt保护基的脱保护剂为DCM/TFA/TIS，所述DCM/TFA/TIS的体积浓度比为95/4/1。 说明书 : 一种司美格鲁肽的制备方法技术领域[0001] 本发明属于多肽药物技术领域，具体涉及一种司美格鲁肽的制备方法。背景技术[0002] 司美格鲁肽英文名称为Semaglutide，司美格鲁肽为GLP‑1类似物，与人GLP‑1有94%同源性。其是由丹麦诺和诺德制药公司开发生产的一款长效胰高血糖素样‑1（GLP‑1）类似物，用于治疗II型糖尿病。2017年12月，司美格鲁肽注射液在美国批准上市，2021年4月，中国国家药品监督管理局（NMPA）批准上市，同年12月3日纳入国家医保乙类药品。2019年9月，司美格鲁肽的口服制剂获FDA批准，用于II型糖尿病血糖控制。2021年6月，注射制剂获FDA批准用于超重成年人降重减肥管理。此外研究发现，司美格鲁肽有潜力治疗癌症、阿尔茨海默症和帕金森病，并能降低心血管疾病风险等。[0003] 从结构上看，Semaglutide是GLP‑1（7‑37）链上8位Aib取代了Ala，34位Arg取代了Lys，26位上Lys接上了十八烷二酸脂肪链、谷氨酸和短链的PEG修饰。PEG修饰后不但可以与白蛋白紧密结合，掩盖DPP‑4酶水解位点，还能降低肾排泄，可延长生物半衰期，达到长效的目的。司美格鲁肽的结构如下：[0004] 。[0005] 目前多肽药物最有效的化学合成方法是固相合成法。也就是从多肽的羧基端开始，将第一个氨基酸连接到树脂上后，脱去氨基酸氨基的保护基，按照肽序，偶联下一个氨基酸，脱去氨基保护基，再偶联，重复循环的操作直到完成氨基酸组装。将多肽从树脂上裂解下来同时去除所有的保护基就可以得到多肽粗品，再经过纯化、冻干得到多肽原料药（API）。[0006] 司美格鲁肽采用常规的固相合成方法具有很大的挑战性，体现在主链上有大量疏水性氨基酸使得肽链之间氢键稳固，产生严重的折叠；肽链与肽链之间的作用力增强，引起树脂收缩，增加了氨基酸偶联的难度，降低了偶联的反应活性和效率，反应收率下降，成本上升。产业化化学制备司美格鲁肽难度不小。[0007] 因此，迫切需要建立一种低成本、高品质、操作简单的产业化制备司美格鲁肽方法。发明内容[0008] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种高收率、适用于工业化生产的司美格鲁肽合成方案，且合成的司美格鲁肽的纯度高。[0009] 本发明提供一种司美格鲁肽的合成方法，所述司美格鲁肽的氨基酸序列为H‑7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20His ‑Aib ‑Glu ‑Gly ‑Thr ‑Phe ‑Thr ‑Ser ‑Asp ‑Val ‑Ser ‑Ser ‑Tyr ‑Leu ‑21 22 23 24 25 26 27 28Glu ‑Gly ‑Gln ‑Ala ‑Ala ‑Lys （AEEA‑AEEA‑G1u（α‑Octadecanedioic））‑Glu ‑Phe ‑29 30 31 32 33 34 35 36 37Ile ‑Ala ‑Trp ‑Leu ‑Val ‑Arg ‑Gly ‑Arg ‑Gly ‑OH，其特征在于，所述制备方法包括：[0010] 以树脂为固相载体，按照司美格鲁肽的一级序列，通过固相合成方法，从C端到N端依次偶联氨基酸和二肽片段，得到司美格鲁肽全保护树脂，经裂解、纯化得到司美格鲁肽；[0011] 其中，所述二肽片段包括7 8二肽片段、9 10二肽片段、12 13二肽片段、17 18二肽~ ~ ~ ~片段、21 22二肽片段、24 25二肽片段、34 35二肽片段；~ ~ ~[0012] 所述7 8二肽片段为Boc‑His（Trt）‑Aib‑OH、所述9 10二肽片段为Fmoc‑Glu~ ~（OtBu）‑G1y‑OH、所述12 13二肽片段为Fmoc‑Phe‑Thr（tBu）‑OH、所述17 18二肽片段为~ ~Fmoc‑Ser（tBu）‑Ser（tBu）‑OH、所述21 22二肽片段为Fmoc‑Glu（OtBu）‑G1y‑OH、所述24 25~ ~二肽片段为Fmoc‑Ala‑Ala‑OH、所述34 35二肽片段为Fmoc‑Arg（Pbf）‑Gly‑OH。~[0013] 优选地，本发明提供的司美格鲁肽的合成方法包括：[0014] （1）将Fmoc‑Gly‑OH与树脂进行偶联，得到Fmoc‑Gly‑树脂；[0015] （2）脱除步骤（1）制得的所述Fmoc‑Gly‑树脂上的Fmoc，再依次偶联Fmoc‑Arg（Pbf）‑OH、Fmoc‑Arg（Pbf）‑Gly‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Trp（Boc）‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Phe‑OH、Fmoc‑G1u（OtBu）‑OH和Fmoc‑Lys（Mmt）‑OH，得到Fmoc‑Lys（Mmt）‑Glu（OtBu）‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp（Boc）‑Leu‑Val‑Arg（Pbf）‑Gly‑Arg（Pbf）‑Gly‑树脂；[0016] （3）脱除步骤（2）制得的所述Fmoc‑Lys（Mmt）‑Glu（OtBu）‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp（Boc）‑Leu‑Val‑Arg（Pbf）‑Gly‑Arg（Pbf）‑Gly‑树脂上Lys侧链的Mmt保护基，在Lys上偶联侧链Dde‑AEEA‑AEEA‑OH，脱去保护基Dde后，在AEEA上偶联侧链Octa（OtBu）‑Glu‑OtBu得到Fmoc‑Lys[AEEA‑AEEA‑G1u（α‑Octa（OtBu）]‑Glu（OtBu）‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp（Boc）‑Leu‑Val‑Arg（Pbf）‑Gly‑Arg（Pbf）‑Gly‑树脂；[0017] （4）在步骤（3）制得的所述Fmoc‑Lys[AEEA‑AEEA‑G1u（α‑Octa（OtBu）]‑Glu（OtBu）‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp（Boc）‑Leu‑Val‑Arg（Pbf）‑Gly‑Arg（Pbf）‑Gly‑树脂上再偶联氨基酸Fmoc‑Ala‑Ala‑OH、Fmoc‑Gln（Trt）‑OH、Fmoc‑Glu（OtBu）‑Gly‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Tyr（tBu）‑OH、Fmoc‑Ser（tBu）‑Ser（tBu）‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Asp（OtBu）‑OH、Fmoc‑Ser（tBu）‑OH、Fmoc‑Phe‑Thr（tBu）‑OH、Fmoc‑Thr（tBu）‑OH、Fmoc‑Glu（OtBu）‑Gly‑OH、Boc‑His（Trt）‑Aib‑OH，得到司美格鲁肽全保护树脂Boc‑His（Trt）‑Aib‑Glu（OtBu）‑Gly‑Thr（tBu）‑Phe‑Thr（tBu）‑Ser（tBu）‑Asp（OtBu）‑Val‑Ser（tBu）‑Ser（tBu）‑Tyr（tBu）‑Leu‑Glu（OtBu）‑Gly‑Gln（Trt）‑Ala‑Ala‑Lys[AEEA‑AEEA‑G1u（α‑Octa（OtBu）]‑Glu（OtBu）‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp（Boc）‑Leu‑Val‑Arg（Pbf）‑Gly‑Arg（Pbf）‑Gly‑树脂；[0018] （5）将步骤（4）制备的所述司美格鲁肽全保护树脂裂解、析晶、抽滤和干燥，得到司美格鲁肽粗品；[0019] （6）将步骤（5）制得的所述司美格鲁肽粗品纯化、冻干得到司美格鲁肽。[0020] 优选地，所述裂解包括使用TFA/EDT/TIS/UPW/苯酚裂解液，所述裂解液通过如下方法制备：配制体积比例为TFA/EDT/TIS/UPW=90/5/2.5/2.5的第一溶液，然后向所述第一溶液加入苯酚，所述苯酚的重量为所述第一溶液重量的2.5%。[0021] 进一步优选地，所述纯化包括采用RP‑HPLC，其中，色谱柱为反相C18柱，流动相为0.1%三氟醋酸/乙腈。[0022] 优选地，所述树脂为DEG‑Wang树脂，所述DEG‑Wang树脂的取代度为0.2 0.6mmol/~g。[0023] 进一步优选地，所述DEG‑Wang树脂的取代度为0.4 0.6mmol/g。~[0024] 优选地，所述偶联采用的缩合试剂选自DIC、DEPBT和DIEA、或OXYMA/DIC。[0025] 优选地，所述步骤（2）中，所述Fmoc的脱保护剂为PIP/DMF溶液，PIP的体积浓度为20% 50%。~[0026] 进一步优选地，所述步骤（2）中，脱除Fmoc‑Arg（Pbf）‑Gly‑Wang树脂的Fmoc时，脱保护剂进一步含有HOBt。[0027] 优选地，所述步骤（3）中，用于所述Mmt保护基的脱保护剂为DCM/TFA/TIS，所述DCM/TFA/TIS的体积浓度比为95/4/1。[0028] 本发明中司美格鲁肽全保护树脂序列为：Boc‑His（Trt）‑Aib‑Glu（OtBu）‑Gly‑Thr（tBu）‑Phe‑Thr（tBu）‑Ser（tBu）‑Asp（OtBu）‑Val‑Ser（tBu）‑Ser（tBu）‑Tyr（tBu）‑Leu‑Glu（OtBu）‑Gly‑Gln（Trt）‑Ala‑Ala‑Lys[AEEA‑AEEA‑G1u（α‑Octa（OtBu）]‑Glu（OtBu）‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp（Boc）‑Leu‑Val‑Arg（Pbf）‑Gly‑Arg（Pbf）‑Gly‑DEG‑Wang树脂。[0029] 本发明中司美格鲁肽的一级序列是指多肽链中氨基酸的排列顺序，本发明中司美7 8 9 10 11 12 13 14 15格鲁肽的氨基酸序列具体为：H‑His ‑Aib ‑Glu‑Gly ‑Thr ‑Phe ‑Thr ‑Ser ‑Asp ‑16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26Val ‑Ser ‑Ser ‑Tyr ‑Leu ‑Glu ‑Gly ‑Gln ‑Ala ‑Ala ‑Lys （AEEA‑AEEA‑G1u（α‑27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37Octadecanedioic））‑Glu ‑Phe ‑Ile ‑Ala ‑Trp ‑Leu ‑Val ‑Arg ‑Gly ‑Arg ‑Gly ‑OH。各氨基酸右上角的数字代表了其在GLP‑1中的位置，本发明沿用了上述氨基酸在GLP‑1中的位置编号，未对其进行重新编号。例如本发明中的7 8二肽片段指的是包含上述编号7~ 37的His、编号8的Aib、以及保护基的二肽片段。在上述司美格鲁肽序列中，GLy ‑OH为C端，H‑7His为N端。[0030] 固相合成反应不同于液相合成反应，固相合成反应的每一步不可能100%偶联完全，缩合的次数越多，产生杂质就越多，收率就下降的越多。在本发明提供的制备方法中，按照司美格鲁肽的氨基酸序列，通过固相合成方法，从C段到N段依次偶联氨基酸或二肽片段，通过适用二肽片段的偶联，大大减少了固相合成方法中缩合反应的次数，明显提高反应的收率。[0031] 通过本发明方法制备司美格鲁肽，反应效率高，大大提高了司美格鲁肽的反应收率，更适用于工业化生产，且制备得到的司美格鲁肽的纯度高。附图说明[0032] 图1为本发明司美格鲁肽的合成示意图；[0033] 图2a为实施例1制备的司美格鲁肽粗品的HPLC图谱；[0034] 图2b为实施例1制备的司美格鲁肽纯化品的HPLC图谱；[0035] 图3a为比较例1制备的司美格鲁肽粗品的HPLC图谱；[0036] 图3b为比较例1制备的司美格鲁肽纯化品的HPLC图谱。具体实施方式[0037] 下面结合附图及实施例对本发明中的技术方案进一步说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。本发明中所使用的方法如无特殊规定，均为常规的生产方法；所使用的原料，如无特殊规定，均为常规的市售产品。例如本发明使用的7 8二肽片段Boc‑His（Trt）‑Aib‑OH购自成都郑源生物科技有限~公司，ZYB11122052502，9 10二肽片段Fmoc‑Glu（OtBu）‑G1y‑OH购自成都郑源生物科技有限~公司，ZYF18122091401，12 13二肽片段Fmoc‑Phe‑Thr（tBu）‑OH购自成都郑源生物科技有限~公司，ZYF13922121201，17 18二肽片段Fmoc‑Ser（tBu）‑Ser（tBu）‑OH购自成都郑源生物科~技有限公司，ZYF20722041201，21 22二肽片段Fmoc‑Glu（OtBu）‑G1y‑OH购自成都郑源生物~科技有限公司，ZYF09522080101，24 25二肽片段Fmoc‑Ala‑Ala‑OH购自成都郑源生物科技~有限公司，ZYF11422110401，34 35二肽片段Fmoc‑Arg（Pbf）‑Gly‑OH购自成都郑源生物科技~有限公司，ZYF18122091401。[0038] 本发明中所用试剂的英文缩写以及中文含义如表1所示：[0039] 表1[0040][0041][0042] 。[0043] 本发明采用DEG‑Wang树脂为固相合成载体，在DMF中的膨胀系数为10 11ml/g，氨~基酸偶联效率高、组装多个氨基酸的杂质少、纯度高，与普通的Wang树脂相比，DEG‑Wang树脂成本基本不相上下、但更容易膨胀、更适合困难序列的多肽组装、制备产品的纯度更高、有更高的偶联效率，进而有效降低生产成本。并且，在脱除Fmoc‑Arg（Pbf）‑Gly‑Wang树脂中的Fmoc的溶液里进一步添加HOBt，可以显著抑制二酮派嗪副反应的发生，提高生产效率。[0044] 本发明采取了固液相结合的合成方法，主肽链的合成以及上述侧链与主肽链的偶联通过固相合成技术合成，侧链Dde‑AEEA‑AEEA‑OH和侧链Octa（OtBu）‑Glu‑OtBu通过液相合成技术合成，产生的杂质很少，在萃取中能够进一步除去易溶于水的杂质NH2‑AEEA‑AEEA‑OH，后处理过程反复使用酸化和碱化处理，能够起到纯化产品的作用。本发明先合成Fmoc‑Lys（Mmt）‑Glu（OtBu）‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp（Boc）‑Leu‑Val‑Arg（Pbf）‑Gly‑Arg（Pbf）‑Gly‑Wang树脂，然后再将侧链Dde‑AEEA‑AEEA‑OH和侧链Octa（OtBu）‑Glu‑OtBu与上述树脂中的Lys偶联，与直接在Lys上依次偶联AEEA‑AEEA以及剩余的基团相比，本发明的制备方法不但减少了反应次数，也大大降低了后处理的难度，降低了提纯成本。[0045] 此外，在本发明的一个优选实施方式中，在合成司美格鲁肽的反应过程中，每一步合成步骤所用到的缩合试剂都不相同。缩合试剂的选择和氨基酸位点相关。根据羧基组分以及氨基组分的不同，缩合反应有难易、快慢之分。例如，位阻较大的Val、溶剂化过强的Arg以及具有仲胺基的Pro都是较难缩合的氨基酸。对此需要强化的条件，如高倍数过量的羧基组分的投入、高活性缩合剂及延长反应时间或适当提高反应温度等。除了参与反应的氨基酸自身结构的影响外，已经组装的肽链长度及肽链的疏水性程度等因素对缩合反应也有重要影响。[0046] 本发明实施例中每一步合成步骤中所用到的缩合试剂如以下表2所示：[0047] 表2[0048][0049] 。[0050] 在本发明的一个优选实施方式中，本发明所用到的裂解液为TFA/EDT/TIS/UPW/苯酚裂解液，裂解液通过如下方法制备：配制体积比例为TFA/EDT/TIS/UPW=90/5/2.5/2.5的第一溶液，然后向所述第一溶液加入苯酚，所述苯酚的重量为所述第一溶液重量的2.5%。如：按照TFA/EDT/TIS/UPW=90/5/2.5/2.5体积比配置了90mL，假如称重是100克，则添加2.5+克苯酚。苯酚在弱酸型（TFA）裂解肽树脂中充当离子清除剂，对TFA‑tBu酯、tBuCO 特别有效。添加苯酚对于提高粗品的纯度和收率有益。[0051] 图1是本发明司美格鲁肽制备方法的示意图，如图1所示，通过本发明方法制备司美格鲁肽的制备流程包括将Fmoc‑Gly‑OH与DEG‑Wang树脂进行偶联，得到Fmoc‑Gly‑DEG‑Wang树脂；再依次偶联Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH、Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Trp(Boc)‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Phe‑OH、Fmoc‑G1u(OtBu)‑OH和Fmoc‑Lys(Mmt)‑OH，得到Fmoc‑Lys(Mmt)‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑DEGWang树脂；脱除Lys侧链的Mmt保护基后，依次偶联Dde‑AEEA‑AEEA‑OH、Octa(OtBu)‑Glu‑OtBu得到Fmoc‑Lys[AEEA‑AEEA‑G1u(α‑Octa(OtBu)]‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑DEGWang树脂；再偶联余下氨基酸Fmoc‑Ala‑Ala‑OH、Fmoc‑Gln(Trt)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑Gly‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Phe‑Thr(tBu)‑OH、Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑Gly‑OH、Boc‑His(Trt)‑Aib‑OH，得到Boc‑His(Trt)‑Aib‑Glu(OtBu)‑Gly‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Asp(OtBu)‑Val‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑Leu‑Glu(OtBu)‑Gly‑Gln(Trt)‑Ala‑Ala‑Lys[AEEA‑AEEA‑G1u(α‑Octa(OtBu)]‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑DEGWang树脂；最后将司美格鲁肽从DEG‑Wang树脂上裂解下来。[0052] 图2表示实施例1制备的司美格鲁肽的HPLC图谱，图2a为实施例1制备的司美格鲁肽粗品的HPLC图谱，图2b为实施例1制备的司美格鲁肽纯化品的HPLC图谱。[0053] 图3为比较例1制备的司美格鲁肽的HPLC图谱，图3a为比较例1制备的司美格鲁肽粗品的HPLC图谱，图3b为比较例1制备的司美格鲁肽纯化品HPLC图谱。[0054] 侧链1Dde‑AEEA‑AEEA‑OH的合成[0055] 称取Dde（10.0g），加入甲醇（200mL）、AEEA‑AEEA（13.75g），搅拌，加热到回流2小时。[0056] IPC监测：取样品50ul加入到5mL乙腈中，进行HPLC分析，Dde残留<12%停止反应，否则继续加热反应。其中HPLC分析参数如下表3所示：[0057] 表3[0058] 。[0059] Dde残留<12%后，停止反应，降温，浓缩（40℃）移除甲醇至20mL 30mL，加入5%碳~酸氢钠水溶液（200mL），转入分液漏斗中，乙酸乙酯（EA）（100mL）洗涤反应容器瓶子后倒入到分液漏斗中，摇晃震荡1min，分液。薄层色谱法（TLC）（展开剂为EA/MeOH=1/1）监测第一次水相及有机相，此时产品在水相中，有机相为杂质。分析有机相中产品的损失情况，如产品点明显小于杂质点，则舍弃，如较多，将有机相中加入5%碳酸氢钠水溶液（50mL），摇晃震荡1min，分液。收集水相，用EA进行萃取（100mL）至少5次，进一步除去易溶于水的杂质NH2‑AEEA‑AEEA‑OH，直至最后一次TLC（2）监测（展开剂为EA/MeOH=1/1）有机相中无杂质出现。有机相舍弃，水相中加入2NHCl（40mL）调酸，体系会由澄清变浑浊，DCM萃取水相（100mL）至少5次，直至水相及最后一次有机相中TLC（3）（展开剂为EA/MeOH=1/1）显示几乎没有产品。合并有机相，加入饱和食盐水（100mL），摇晃震荡1min，分液。收集有机相进行浓缩，室温下，负压0.09Pa以下浓缩DCM至干，待用。[0060] 侧链2Octa(OtBu)‑Glu‑OtBu的合成[0061] 将起始物料十八烷二酸‑叔丁酯‑OSu（5.0g）用DCM溶解（50mL），搅拌，加入DIEA（5mL），H‑Glu‑OtBu（2.6g），室温下反应1h。TLC监测反应进程，以乙酸乙酯为展开剂，在薄层板上展开，后用高锰酸钾显色，观察反应物和生成物情况，判断反应进程。室温下，负压0.09Pa以下浓缩移除DCM至干，残渣中加入EA（100mL），加入5%H3PO4（100mL），摇晃，分液。水相用EA萃取（TLC显示萃取相几乎无产品，丢弃，后续不萃取）。[0062] 分液得到的有机相用饱和食盐水洗涤（50mL）一次。室温下，负压0.09Pa以下浓缩移除EA至干，残渣为油状物，加入EA（100mL）搅拌1h。大部分固体析出，静置30min，抽滤。MBTE淋洗固体（50mL）两次。35℃真空干燥1h，得到6.0g，收率90%，待用。[0063] Fmoc‑Gly‑DEG‑Wang树脂的合成[0064] 将DEG‑Wang树脂加入到SPPS反应釜中，加入DCM，搅拌膨胀，抽滤；将抽滤后的树脂重新加入反应釜中。将Fmoc‑Gly‑OH、DMAP（催化剂）溶于DCM/DMF=1/1（体积比）混合液中，加入DIC，搅拌，倒入到反应釜中，室温下搅拌2h，抽滤；向抽滤后的树脂中加入DMF/Ac2O/DIEA（90/5/5，体积比），搅拌30min，抽滤；用DMF洗涤抽滤后的树脂，重复3次，每次2min；之后用MeOH收缩洗涤，重复3次，每次2min；取洗涤后的树脂小样干燥测氨基酸树脂的取代度（DS），DS=0.2 0.5mmol/g。~[0065] Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑Wang树脂的合成[0066] SPPS反应釜中加入浓度为20%的PIP/DMF（PIP：DMF的体积比为20%：80%）及上述合成的Fmoc‑Gly‑DEG‑Wang树脂，搅拌10min，（IPC：TNBS:橙红色），抽滤；DMF洗涤抽滤后的树脂，重复6次，每次2min；将洗涤后的树脂重新加入SPPS反应釜中。将Fmoc‑Arg（Pbf）‑OH、DEPBT，溶于DMF中，冰浴降温至5℃以下，加入冰DIEA，冰浴下搅拌5min，倒入到SPPS反应釜中，室温下搅拌1h；（IPC：茚三酮：无色），抽滤；DMF洗涤抽滤后的树脂，重复2次，每次2min。其中以下物质的摩尔比为Fmoc‑Gly‑DEG‑Wang树脂：Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH：缩合试剂=1/3/3.6。[0067] Fmoc‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑Wang树脂的合成[0068] SPPS反应釜中加入含有0.1MHOBt的20%的PIP/DMF（PIP：DMF的体积比为20%：80%）及上述合成的Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑Wang树脂，搅拌10min，（IPC：TNBS:橙红色），抽滤；DMF洗涤抽滤后的树脂，重复6次，每次2min；将洗涤后的树脂重新加入SPPS反应釜中。将Fmoc‑Gly‑OH、Oxyma溶于DMF中，加入DIC，室温搅拌5min，倒入到SPPS反应釜中，室温下搅拌1h；（IPC：茚三酮:无色），抽滤；DMF洗涤抽滤后的树脂，重复2次，每次2min。[0069] 其他氨基酸或二肽片段的偶联和Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑Wang树脂的合成步骤类似。实施例1[0070] 司美格鲁肽的合成[0071] 按照上述步骤合成侧链1Dde‑AEEA‑AEEA‑OH和侧链2Octa(OtBu)‑Glu‑OtBu。[0072] 1、合成Fmoc‑Gly‑DEG‑Wang树脂[0073] 称取DEG‑Wang（取代度0.6mmol/g）树脂10g，加入到SPPS反应釜（具砂芯三口双层夹套反应釜，定制G3筛板，250ml*24*24*24四氟活塞）中，加入DCM（150mL），搅拌膨胀30min，抽滤；称取Fmoc‑Gly‑OH（1.78g），DMAP（73.2mg），溶于DCM/DMF=1/1（体积比）混合液中（60mL），加入DIC（1.11mL），搅拌5min，倒入到反应釜中，室温下搅拌2h，抽滤；向抽滤后的树脂中加入DMF/Ac2O/DIEA（90/5/5，体积比）（60mL），搅拌30min，抽滤；用DMF（60ml）洗涤抽滤后的数值，重复3次，每次2min；之后用MeOH（60ml）收缩洗涤，重复3次，每次2min；取洗涤后的树脂小样干燥测氨基酸树脂的取代度（DS），DS=0.2 0.5mmol/g。其中取代~度（DS）的测定方法如下：[0074] 配置标准品：称取约25mgFmoc‑Gly‑OH于样品瓶A中，加入5mL5%DBU/DMF，室温下搅拌0.5h。取1mL反应溶液到100mL容量瓶，以50%ACN/UPW稀释，得标准溶液A。再取1mL标准溶液A到10mL容量瓶，以50%ACN/UPW稀释，得标准溶液B。[0075] 配置样品：1）树脂以MeOH清洗3次后，于40 °C真空烘干1h。检测检出限LOD（75℃，30min）；2）称取约150mg树脂于样品瓶B中，加入5mL5%DBU/DMF，室温下搅拌0.5h。过滤反应溶液。取1mL反应溶液到100mL容量瓶，以50%ACN/UPW稀释，得样品溶液A。再取1mL样品溶液A到10mL容量瓶，以50%ACN/UPW稀释，得样品溶液B。[0076] 检测：以UV‑Vis光谱检测标准溶液B及样品溶液B于255.3nm的吸收，并计算树脂的取代度。[0077] 2、Fmoc‑Arg（Pbf）‑Gly‑Wang树脂合成[0078] SPPS反应釜中加入浓度为20%的PIP/DMF（PIP：DMF的体积比为20%：80%，60mL）及上述步骤1得到的Fmoc‑Gly‑DEG‑Wang树脂，搅拌10min，（IPC：TNBS:橙红色），抽滤；DMF（60mL）洗涤抽滤后的树脂，重复6次，每次2min；将洗涤后的树脂重新加入SPPS反应釜中。称取Fmoc‑Arg（Pbf）‑OH（11.6g），DEPBT（3.14g），溶于DMF中（60mL）中，冰浴降温至5℃以下，加入冰DIEA（2.44mL），冰浴下搅拌5min，倒入到SPPS反应釜中，室温下搅拌1h；（IPC：茚三酮:无色），抽滤；DMF（60mL）洗涤抽滤后的树脂，重复2次，每次2min。[0079] 3、Fmoc‑Arg（Pbf）‑Gly‑Arg（Pbf）‑Gly‑Wang树脂合成[0080] SPPS反应釜中加入含有0.1MHOBt的20%的PIP/DMF（PIP：DMF的体积比为20%：80%，60mL）及上述步骤2得到的Fmoc‑Arg（Pbf）‑Gly‑Wang树脂，搅拌10min，（IPC：TNBS:橙红色），抽滤；DMF（60mL）洗涤抽滤后的树脂，重复6次，每次2min；将洗涤后的树脂重新加入SPPS反应釜中。称取Fmoc‑Arg（Pbf）‑Gly‑OH（12.6g），Oxyma（2.24g），溶于DMF中（60mL），加入DIC（2.11mL），室温搅拌5min，倒入到SPPS反应釜中，室温下搅拌1h；（IPC：茚三酮:无色），抽滤；DMF（60mL）洗涤抽滤后的树脂，重复2次，每次2min。[0081] 4、Fmoc‑Val‑Arg（Pbf）‑Gly‑Arg（Pbf）‑Gly‑Wang树脂合成[0082] SPPS反应釜中加入20%的PIP/DMF（PIP:DMF的体积比为20%：80%，60mL）及上述步骤3得到的Fmoc‑Arg（Pbf）‑Gly‑Arg（Pbf）‑Gly‑Wang树脂，搅拌10min，（IPC：TNBS:橙红色），抽滤；DMF（60mL）洗涤抽滤后的树脂，重复6次，每次2min；洗涤后的树脂重新加入SPPS反应釜中。称取Fmoc‑Val‑OH（6.1g），DEPBT（3.14g），溶于DMF（60mL），冰浴降温至5℃以下，加入冰DIEA（2.44mL），冰浴下搅拌5min，倒入到SPPS反应釜中，室温下搅拌1h；（IPC：茚三酮:无色），抽滤；DMF（60mL）洗涤抽滤后的树脂，重复2次，每次2min。[0083] 5.Fmoc‑Lys（Mmt）‑Glu（OtBu）‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp（Boc）‑Leu‑Val‑Arg（Pbf）‑Gly‑Arg（Pbf）‑Gly‑Wang树脂合成[0084] 按照上述步骤4的方法，以司美格鲁肽的一级序列依次偶联剩余的氨基酸或二肽片段，得到Fmoc‑Lys（Mmt）‑Glu（OtBu）‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp（Boc）‑Leu‑Val‑Arg（Pbf）‑Gly‑Arg（Pbf）‑Gly‑树脂。[0085] 在上述步骤中，偶联的氨基酸或二肽片段的顺序及其用量如表4所示，所使用的缩合试剂及用量如表5所示。[0086] 表4[0087] 。[0088] 表5[0089] 。[0090] 6.Fmoc‑Lys[AEEA‑AEEA‑G1u(α‑Octa(OtBu))‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑Wang树脂合成[0091] 冰DCM（2 8℃）洗涤（7倍体积），重复3次，每次5min；SPPS反应釜中加入体积比为~DCM/TFA/TIS=95/4/1的DCM/TFA/TIS溶液（7倍体积），22℃±4℃搅拌30min，抽滤；通过TNBS检测上述洗涤液显色为橙红色，否则再重复上述脱Mmt保护基30min一次，DCM洗涤（7倍体积），重复3次，每次5min；冰2%DIEA/DCM（2 8℃）洗涤（7倍体积），重复3次，每次5min；~检测最后一次洗涤液pH值大于7。TNBS:橙红色为通过。小于或等于7，未通过，重复洗涤直至合格为止。[0092] 称取DDE‑AEEA‑AEEA‑OH6.2g，降温至10 20℃，目标15℃，加入缩合剂DEPBT3.1g，~DIEA2.4mL，溶解澄清，控温（10 20℃），搅拌5min，加入到SPPS反应釜中，22℃±4℃下~搅拌2h；TNBS:无色表示偶联反应彻底。DMF*2洗涤。[0093] 加入2%水合肼/DCM(7倍体积)反应30min，重复一次。TNBS:橙红色为通过。DMF洗涤7次，加入Octa(OtBu)‑Glu‑OtBu5.5g，加入缩合剂DEPBT3.1g，DIEA2.4mL，溶解澄清，22℃±4℃下搅拌2h。TNBS:无色表示偶联反应彻底。[0094] 7.Boc‑His(Trt)‑Aib‑Glu(OtBu)‑Gly‑Thr(tBu)‑Phe‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Asp(OtBu)‑Val‑Ser(tBu)‑Ser(tBu)‑Tyr(tBu)‑Leu‑Glu(OtBu)‑Gly‑Gln(Trt)‑Ala‑Ala‑Lys[AEEA‑AEEA‑Glu(α‑Octa(OtBu))‑Glu(OtBu)‑Phe‑Ile‑Ala‑Trp(Boc)‑Leu‑Val‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑Wang树脂合成[0095] 按照与以上步骤类似的方法依次偶联剩余氨基酸或二肽片段；按照司美格鲁肽一级氨基酸序列依次偶联剩余氨基酸或二肽片段，步骤7所使用的氨基酸或二肽片段的顺序及其用量如表6所示，所使用的缩合试剂及用量如表7所示。[0096] 表6[0097] 。[0098] 表7[0099] 。[0100] 得到司美格鲁肽全保护树脂的重量为26g，收率92%，其中收率的计算方式为收率=实际获得肽树脂质量/10g*0.47mmol/g*（5976）/1000*100%。[0101] 8.裂解得到司美格鲁肽粗品[0102] 配制裂解液，配制体积比例为TFA/EDT/TIS/UPW=90/5/2.5/2.5的第一溶液，然后向所述第一溶液加入苯酚，所述苯酚的重量为所述第一溶液重量的2.5%。在0 5℃下放置备~用。往反应器中加入步骤7得到的肽树脂5倍体积（5V）的裂解液，氮气流下，逐渐加入肽树脂，边加边搅拌。室温下搅拌2 3h。裂解完成后，过滤，滤出树脂，用1V的裂解液润洗树脂，~合并滤液。将滤液加入到冰冷的甲基叔丁基醚中沉淀，边加边搅拌。离心，除去上清液，用MBTE洗涤固体5 6次，室温下真空干燥，得到司美格鲁肽粗品12g，收率为90%，其中收率的计~算方式为（粗品质量‑Loading）/DS*树脂质量*4113.58/1000*100%，其中（粗品质量‑Loading）代表粗品扣除水分之后的量，粗品HPLC纯度达85%，其中HPLC仪器型号：PDA（ALLIANCEE2695/ACQUITYArcWaterse2695，仪器参数如下表8所示：[0103] 表8[0104] 。[0105] 9.纯化得到司美格鲁肽[0106] 将步骤8中的司美格鲁肽粗品溶于含30%TFE/0.1%TFA（体积分数）的水溶液得到司美格鲁肽粗品溶液，采用Waters2545RP‑HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1%三氟醋酸（流动相A）/乙腈（流动相B）流动相进行第一步纯化，再将纯化品转盐进行第二步纯化，仪器参数如下表9所示。与司美格鲁肽对照品进行HPLC定位比较，然后LCMS确认目标峰馏分并收集目标峰馏分，旋蒸浓缩（旋转蒸发仪：EYELA N‑1300OSB‑2200），冻干（真空冷冻干燥机：LYOTKO.5）得到司美格鲁肽纯化品2.4g，HPLC纯度99.6%（PDA（ALLIANCEE2695/ACQUITYArcWaterse2695）），纯化收率60%。司美格鲁肽纯化品的HPLC图谱见图2b。[0107] 表9[0108] 。[0109] 实施例2[0110] 除了所用DEG‑wang树脂的取代度为0.4mmol/g以外，采用与实施例1相同的合成步骤合成司美格鲁肽，结果得到司美格鲁肽粗品14.8g，收率为90%，粗品HPLC纯度达60%。[0111] 实施例3[0112] 实施例3除了所述Fmoc的脱保护剂PIP/DMF溶液的浓度以外，采用与实施例1相同的合成步骤合成司美格鲁肽，得到司美格鲁肽粗品，结果如表10所示。[0113] 实施例4[0114] 实施例4除了所述Fmoc的脱保护剂PIP/DMF溶液的浓度以外，采用与实施例1相同的合成步骤合成司美格鲁肽，得到司美格鲁肽粗品，结果如表10所示。[0115] 表10[0116] 。[0117] 比较例1[0118] 司美格鲁肽的合成[0119] 按照上述步骤合成侧链1Dde‑AEEA‑AEEA‑OH和侧链2α‑Octa（OtBu）‑Glu‑OtBu。[0120] 1、合成Fmoc‑Gly‑DEG‑Wang树脂[0121] 称取DEG‑Wang（取代度0.5mmol/g）树脂10g，加入到SPPS反应釜中，加入DCM（150mL），搅拌膨胀30min，抽滤；将抽滤后的树脂重新加入SPPS反应釜中。称取Fmoc‑Gly‑OH（1.78g），DMAP（73.2mg），溶于DCM/DMF=1/1混合液中（60mL），加入DIC（1.11mL），搅拌5min，倒入到SPPS反应釜中，室温下搅拌3h，抽滤；向抽滤后的树脂中加入DMF/Ac2O/DIEA=85/10/5（60mL），搅拌30min，抽滤；用DMF（60ml）洗涤抽滤后的树脂，重复3次，每次2min；之后用MeOH（60ml）收缩洗涤，重复3次，每次2min；取洗涤后的树脂小样干燥测氨基酸树脂的DS，DS=0.2 0.5mmol/g。~[0122] 2、Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑Wang树脂合成[0123] SPPS反应釜中加入浓度为20%的PIP/DMF（PIP:DMF的体积比为20%：80%，60mL）及上述步骤1得到的Fmoc‑Gly‑DEG‑Wang树脂，搅拌10min（IPC：TNBS:橙红色），抽滤；DMF（60mL）洗涤抽滤后的树脂，重复6次，每次2min；将洗涤后的树脂重新加入SPPS反应釜中。称取Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH（6.81g），DEPBT（3.14g），溶于DMF（60mL）中，冰浴降温至5℃以下，加入冰DIEA（2.44mL），冰浴下搅拌5min，倒入到SPPS反应釜中，室温下搅拌1h（IPC：茚三酮:无色），抽滤；DMF（60mL）洗涤抽滤后的树脂，重复2次，每次2min。[0124] 3、Fmoc‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑Wang树脂合成[0125] SPPS反应釜中加入20%的PIP/DMF（PIP:DMF的体积比为20%：80%，60mL）及上述步骤2得到的Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑Wang树脂，搅拌10min（IPC：TNBS:橙红色），抽滤；DMF（60mL）洗涤抽滤后的树脂，重复6次，每次2min；将洗涤后的树脂重新加入SPPS反应釜中。称取Fmoc‑Gly‑OH（3.12g），Oxyma（2.24g），溶于DMF中（60mL），加入DIC（2.11mL），室温搅拌5min，倒入到SPPS反应釜中，室温下搅拌1h（IPC：茚三酮:无色），抽滤；DMF（60mL）洗涤抽滤后的树脂，重复2次，每次2min。[0126] 4、Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑Wang树脂合成[0127] SPPS反应釜中加入20%的PIP/DMF（PIP:DMF的体积比为20%：80%，60mL）及上述步骤3得到的Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑Arg(Pbf)‑Gly‑Wang树脂，搅拌10min（IPC：TNBS:橙红色），抽滤；DMF洗涤（60mL），重复6次，每次2min；将洗涤后的树脂重新加入SPPS反应釜中。称取Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH（6.81g），DEPBT（3.14g），溶于DMF（60mL）中，冰浴降温至5℃以下，加入冰DIEA（2.44mL）冰浴下搅拌5min，倒入到SPPS反应釜中，室温下搅拌1h（IPC：茚三酮:无色），抽滤；DMF（60mL）洗涤抽滤后的树脂，重复2次，每次2min。[0128] 按照上述步骤3的方法，以司美格鲁肽一级序列依次偶联剩余氨基酸，偶联的氨基酸顺序及其用量如表11所示。[0129] 表11[0130][0131] 。[0132] 其中，在Fmoc‑Lys（Mmt）‑OH与主链偶联反应进行之后，侧链1DDE‑AEEA‑AEEA‑OH和侧链2Octa(OtBu)‑Glu‑OtBu分别与主链进行偶联反应，之后再偶联其余氨基酸，侧链与主链偶联的步骤与实施例1中相同。[0133] 得到司美格鲁肽全保护树脂的重量为20g，收率70%。[0134] 采用与实施例1相同的裂解方式，得到司美格鲁肽粗品，重量为10.6g，收率为80%，司美格鲁肽粗品的纯度为65%。[0135] 将对比例1制得的司美格鲁肽粗品溶于含30%TFE/0.1%TFA（体积分数）的水溶液得到司美格鲁肽粗品溶液，采用Waters2545RP‑HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1%三氟醋酸/乙腈流动相转盐，其中洗脱时间、流速、检测波长等纯化参数与实施例1中纯化司美格鲁肽的参数一致。收集目标峰馏分，旋蒸浓缩，冻干得到司美格鲁肽纯化品1.8g，HPLC纯度99.6%，纯化收率50%，司美格鲁肽纯化品的HPLC图谱如图3b所示与实施例得到的结果相似。[0136] 比较例2[0137] 除了DEG‑wang树脂的取代度与实施例2不同之外，采用与实施例2相同的合成步骤合成司美格鲁肽，其中所使用的DEG‑wang树脂的取代度以及得到的司美格鲁肽粗品的质量、收率以及HPLC纯度如下表12所示。[0138] 比较例3[0139] 除了DEG‑wang树脂的取代度与实施例2不同之外，采用与实施例2相同的合成步骤合成司美格鲁肽，其中所使用的DEG‑wang树脂的取代度以及得到的司美格鲁肽粗品的质量、收率以及HPLC纯度如下表12所示。[0140] 表12[0141] 。[0142] 比较例2采用取代度为0.10mmol/g的DEG‑wang树脂，得到司美格鲁肽粗品纯度提高一些，但是产能低，成本高，不适合产业化。比较例3采用取代度为0.65mmol/g的DEG‑wang树脂，司美格鲁肽粗品收率和粗品纯度明显下降。[0143] 比较例4[0144] 除了所用树脂为普通wang‑树脂（溶胀率为8ml/g）以外，采用与实施例2相同的合成步骤合成司美格鲁肽，其结果如下表13所示，得到司美格鲁肽粗品11.5g，收率为70%，粗品HPLC纯度达50%。[0145] 表13[0146] 。[0147] 比较例5[0148] 除了每步反应步骤中所使用的缩合试剂均为HOBt/DIC之外，采用与实施例1相同的合成步骤合成司美格鲁肽，得到司美格鲁肽粗品质量11.8g，其结果如下表14所示。[0149] 表14[0150] 。[0151] 比较例6[0152] 除了所用裂解液与实施例1不同之外，采用与实施例1相同的合成步骤合成司美格鲁肽，得到司美格鲁肽粗品质量13.9g，其结果如下表15所示。[0153] 表15[0154] 。[0155] 比较例7[0156] 除了在脱除Fmoc‑Arg(Pbf)‑Gly‑Wang树脂的Fmoc时脱保护剂不含HOBt之外，采用与实施例1相同的合成步骤合成司美格鲁肽，得到司美格鲁肽粗品13.1g，结果如下表16所示。[0157] 表16[0158] 。[0159] 通过上述实施例与比较例可以看出，使用本发明的制备方法步骤较少、操作简单、提高了反应的收率，且制备得到的产品的纯度更高，更适用于工业化生产。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

专利地区：福建

专利申请日期：2024-03-21

专利公开日期：2024-10-01

专利公告号：2024-10-01