一种复合植物提取物及其在抗家禽热应激中的应用

专利名称：一种复合植物提取物及其在抗家禽热应激中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410800606.7

专利申请（专利权）人：黄淮学院
权利人地址：河南省驻马店市驿城区开源大道6号黄淮学院

专利发明（设计）人：发明人:郭红伟,李源馨,刘纳琪,王樊,任璐,刘军和,林祈翔,章君

专利摘要：本发明属于家禽养殖技术领域，尤其涉及一种复合植物提取物及其在抗家禽热应激中的应用，由槲皮素、芦丁和夏枯草提取物按照质量比为3:3:1的比例混合制备而成，槲皮素纯度为98%，芦丁纯度为95%，夏枯草提取物由以下方法制备得到：夏枯草药材用水煎煮1‑3次，每次2‑3小时，过滤，水煎煮液浓缩，加入70‑90%乙醇使含醇为55‑60%，静置取上清液，浓缩得提取物，三种植物提取物组成的复合植物提取物可用于家禽热应激的预防和治疗。

主权利要求：
1.一种复合植物提取物，其特征在于：由槲皮素、芦丁和夏枯草提取物按照质量比为3:
3:1的比例混合制备而成，槲皮素纯度为98%，芦丁纯度为95%，夏枯草提取物由以下方法制备得到：夏枯草药材用水煎煮1‑3次，每次2‑3小时，过滤，水煎煮液浓缩，加入70‑90%乙醇使含醇为55‑60%，静置取上清液，浓缩得提取物。
2.如权利要求1所述的复合植物提取物的应用，其特征在于：该复合植物提取物在细胞水平上用于缓解由双氧水诱导的鸡胚原代肝细胞毒性。
3.如权利要求1所述的复合植物提取物的应用，其特征在于：用300g芦丁提取物，300g槲皮素提取物和100g夏枯草提取物，余量为无水葡萄糖配置的1kg复合植物提取液，用于肉鸡饲料中作为功能饲料添加剂，添加量为1kg/吨时，用于治疗肉鸡热应激引起的生长发育不良、养分代谢率低、血清抗氧化酶活力低的问题。
4.如权利要求1所述的复合植物提取物的应用，其特征在于：该复合植物提取物添加至饲料中用于缓解家禽热应激。 说明书 : 一种复合植物提取物及其在抗家禽热应激中的应用技术领域[0001] 本发明属于家禽养殖技术领域，尤其涉及一种复合植物提取物及其在抗家热应激中的应用。背景技术[0002] 近年来全球气候的持续变暖，给全球家禽养殖带来了巨大挑战，高温和高湿环境以及密集养殖造成的氧化应激成为家禽养殖中的主要危害之一。氧化应激被定义为细胞或生物体内氧化还原状态的失衡，家禽遭受氧化应激会降低家禽的生产性能和肉质，增加死亡率。在家禽生产过程中，应激源可能来自饲料、饲养条件和环境等因素，在营养方面，例如食物的摄入、消化以及肠道对营养物质的吸收会在肠粘膜、肝脏和外周代谢部位产生ROS和自由基，导致抗氧化系统失衡、脂质过氧化以及膜和其他生物分子(包括DNA)的损伤。肝脏相较于其他器官更易受到氧化应激，作为主要的解毒和合成代谢器官，肝脏过度积累脂肪、代谢产物和毒素时会产生自由基。为了缓解肉鸡受到的氧化应激，在肉鸡日粮中添加抗氧化剂成为研究热点。天然植物提取物由于其天然性、多功能性、低毒副作用和无残留等独特优势，被认为是各种动物日粮中最具潜力的天然抗氧化剂之一，可以用于缓解肉鸡生产过程中遭受的氧化应激。发明内容[0003] 本发明的目的是提供一种复合植物提取物及其应用。[0004] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：[0005] 一种复合植物提取物，由槲皮素、芦丁和夏枯草提取物按照质量比为3:3:1的比例混合制备而成，槲皮素纯度为98％，芦丁纯度为95％，夏枯草提取物由以下方法制备得到：夏枯草药材用水煎煮1‑3次，每次2‑3小时，过滤，水煎煮液浓缩，加入70‑90％乙醇使含醇为55‑60％，静置取上清液，浓缩得提取物。[0006] 一种复合植物提取物的应用，该复合植物提取物具有较强的体外抗氧化能力。[0007] 一种复合植物提取物的应用，该复合植物提取物在细胞水平上可缓解由双氧水诱导的鸡胚原代肝细胞毒性。[0008] 一种复合植物提取物的应用，用300g芦丁提取物，300g槲皮素提取物和100g夏枯草提取物，余量为无水葡萄糖配置的1kg复合植物提取液，用于肉鸡饲料中作为功能饲料添加剂，添加量为1kg/吨时，用于治疗肉鸡热应激引起的生长发育不良、养分代谢率低、血清抗氧化酶活力低的问题。[0009] 一种复合植物提取物的应用，该复合植物提取物添加至饲料中用于缓解家禽热应激。[0010] 本发明具有的优点是：芦丁是一种广泛存在于中草药、水果和蔬菜中的类黄酮化合物，具有广泛的药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗病毒等作用。研究表明，芦丁可以清除人体内自由基，抑制食品中金黄色葡萄球菌的生长，还具有抗癌作用。芦丁还减少了山梨糖醇，活性氧，高级糖基化终产物前体和炎性细胞因子的形成。这些作用被认为是芦丁对高血糖和血脂异常引起的肾病，神经病，肝损伤和心血管疾病的保护作用。槲皮素是一种重要的类黄酮物质，富含于水果和蔬菜中。在体外它可以通过直接清除活性氧自由基、螯合金属离子、抑制脂质过氧化及抑制DNA氧化损伤，展现出强大的抗氧化能力，在体内主要通过保护血管内皮细胞、提高一氧化氮水平和外周血总抗氧化力等方式发挥抗氧化作用，且具有抗炎、抗癌等多种生物活性和药理作用。夏枯草是一种常见的中药材，具有抗菌抗炎的作用，可以用于治疗感染性疾病。夏枯草能够抑制病原微生物的生长，减轻炎症反应；本发明以这三种提取物为基础，通过体外抗氧化能力筛选复合植物提取物，通过鸡胚原代肝细胞实验验证复合植物提取对氧化损伤保护效果，最终通过21d肉鸡热应激实验验证使用效果。[0011] 说明书附图[0012] 图1是本发明实验例1中1～6mmol/LFeSO4标准曲线图。具体实施方式[0013] 实施例[0014] 一种复合植物提取物，由槲皮素、芦丁和夏枯草提取物按照质量比为3:3:1的比例混合制备而成，槲皮素纯度为98％，芦丁纯度为95％，夏枯草提取物由以下方法制备得到：夏枯草药材用水煎煮1‑3次，每次2‑3小时，过滤，水煎煮液浓缩，加入70‑90％乙醇使含醇为55‑60％，静置取上清液，浓缩得提取物。[0015] 一种复合植物提取物的应用，该复合植物提取物在细胞水平上可缓解由双氧水诱导的鸡胚原代肝细胞毒性。[0016] 一种复合植物提取物的应用，该复合植物提取物添加至肉鸡饲料中作为制备治疗肉鸡热应激引起的生长发育不良、养分代谢率低、血清抗氧化酶活力低的功能性饲料的添加剂。[0017] 一种复合植物提取物的应用，该复合植物提取物添加至饲料中用于缓解氧化应激引起的家禽养殖中。[0018] 实验例[0019] 实验1复合植物提取物(Compoundplantsextract，CPE)的筛选[0020] 1材料和方法[0021] 1.1实验材料[0022] 95％芦丁(购自上海士锋生物科技有限公司)；98％槲皮素(购自陕西圣青生物科技有限公司)；夏枯草(购自确山)；DDPH(购自百思一基实验室用品商城)；ABTS(购自百思一基实验室用品商城)；过二硫酸钾(购自东莞西陇科学广州番禹力强)；TPTZ(购自化学试剂城)；PTIO(购自合肥伊卡生物试剂)；维C(购自西陇科学股份有限公司)；无水醋酸钠(购自荣凤贤实验室用品商城总店)；冰乙酸(≥99.0％g/g，购于标准实验分析纯化学试剂)；FeSO4(购自杰辉化工)；维生素C(≥99.7％，上海展云生物化工有限公司)。[0023] 1.2夏枯草提取物的制备[0024] 取夏枯草药材用水煎煮1‑3次，每次2‑3小时，过滤，水煎煮液浓缩，加入70‑90％乙醇使含醇为55‑60％，静置，取上清液，浓缩得提取物。20g夏枯草得1g夏枯草提取物。[0025] 1.3芦丁、槲皮素、夏枯草溶液的配制[0026] 芦丁、槲皮素、夏枯草提取物各0.5g分别溶于10mL甲醇，用定性滤纸反复过滤3次后用去离子水定容至100m，0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。[0027] 1.4维生素C溶液的配置[0028] 10mg维生素C溶于100mL去离子水中，0.22μm滤膜过滤，4℃保存备用。[0029] 1.5抗氧化性能的评估[0030] PTIO·自由基清除试验：将30mg的PTIO固体溶解在200mg的蒸馏水中，通过充分摇动使其完全溶解，从而得到PTIO的工作液。接着，在反应试管中，加入不同体积的待测样品溶液。为了评估PTIO的清除效果，在557nm的波长下测量溶液的吸光度，记作A。同时，为了作为对照，我们也在相同条件下测量不加入样品时的吸光度，记作A0。A0的数值应在0.2至0.6之间，以确保实验的准确性。最后，根据以下公式计算PTIO的清除效果：PTIO清除效果＝(A0‑A)/A0×100％，其中A0表示不加样品时的值。[0031] ABTS·+自由基清除试验：[0032] 取0.2mg的ABTS二铵盐储备液和0.2mg的K2S2O8储备液，按照1:1的比例混合。随后，将混合液在黑暗环境下，于室温条件下放置12h，使ABTS与K2S2O8充分反应生成ABTS·+自由基。使用pH7.4的无水乙醇逐步稀释上述混合液，直至其吸光度达到0.70±0.02的范围内，这个稀释后的溶液就是ABTS·+工作液。在反应试管中，加入不同体积的待测样品溶液。在室温下，让样品与ABTS·+工作液反应6分钟。为了评估样品的ABTS自由基清除能力，在734nm的波长下测量反应后溶液的吸光度，记作A。同时，为了作为对照，在相同条件下测量不加入样品时的吸光度，记作A0。根据以下公式计算样品的ABTS清除效果：ABTS清除效果＝(A0‑A)/A0×100％，其中A表示加入不同体积样品后反应液的吸光度。[0033] DPPH·自由基清除试验：取3mg的DPPH固体，将其溶解在72mL的无水乙醇中。通过充分振摇，确保DPPH固体完全溶解于无水乙醇中。配置好的DPPH溶液需要避光保存，并在五小时内使用完毕，以保证其稳定性和准确性。取72mL上述配置好的DPPH溶液，并加入36mL的无水乙醇进行稀释。通过逐步添加无水乙醇，调整溶液的吸光度，使其处于0.6至1.0的范围内。如果溶液的吸光度过大，继续添加无水乙醇进行稀释；如果吸光度过小，则需要补充加入DPPH固体。经过这样的调整，得到DPPH工作液。在反应试管中，加入不同体积的待测样品溶液。在室温下让样品与DPPH工作液反应30分钟。反应结束后，使用分光光度计在519nm的波长下测定溶液的吸光度值，记作A，为了作为对照，在不加入样品的情况下，测定DPPH工作液在519纳米波长下的吸光度值，记作A0。最后，根据以下公式计算样品的DPPH清除效果：DPPH清除效果＝(A0‑A)/A0×100％。[0034] FRAP总抗氧化能力测定试验：在进行抗氧化能力测定时，向反应管中注入0.1mL的样品溶液，然后添加2.4mL的FRAP(FerricReducingAntioxidantPower)工作液。将两者充分混合后，将反应管置于37℃的水浴中加热10分钟。使用分光光度计在593nm的波长下测量溶液的吸光度。为了准确计算样品的抗氧化能力，使用1‑6mmol/L的FeSO4标准溶液绘制2了标准曲线(图1)。通过这条标准曲线，得到了回归方程Y＝0.0692x+0.0247，其相关系数R为0.971，显示了良好的线性关系。将测得的样品吸光度值代入这个回归方程中，从而计算出样品的FRAP值。1个FRAP单位被定义为相当于1毫摩尔/升的FeSO4的抗氧化能力。通过这种方法，可以直接得知样品的抗氧化能力相当于多少毫摩尔/升的FeSO4。[0035] 1.6复合植物提取物(CPE)的筛选[0036] 采用三因素三水平正交实验对复合植物提取进行，以三种提取物为三因素，三种植物提取物分别以1份、2份和3份重量为三因素，设计表见表1。[0037] 表1正交实验设计表[0038] 槲皮素 芦丁 夏枯草1 1 1 12 1 2 23 1 3 34 2 1 25 2 2 36 2 3 17 3 1 38 3 2 19 3 3 2[0039] 2结果与分析[0040] 2.1不同草药抗氧化性能的评估[0041] 3种草药PTIO·自由基清除效果的评估见表2，由表2可知芦丁对PTIO·自由基清除效果最好，相当于469.37mgVc/g，槲皮素为318.51mgVc/g，夏枯草为100.55mgVc/g，相比有显著差异(P＞0.05)。在PTIO·自由基清除试验中，三种物质的抗氧化能力为芦丁＞槲皮素＞夏枯草。[0042] 表2PTIO·自由基清除效果[0043]提取物 浓度 加样量(μL) 清除率(％) Vc(mg/g)芦丁 0.5g/100mL 100 37.39±2.28 469.37±23.1A槲皮素 0.5g/100mL 100 25.37±1.72 318.51±18.00B夏枯草 0.5g/100mL 500 40.05±3.37 100.55±7.49C维生素C 0.1g/100mL 400 63.72±3.67 [0044] 同列大写字母相同表示差异不显著(P＞0.05)；大写字母不同差异显著(P＜0.05)，下同。[0045] 3种物质DPPH·自由基清除效果的评估见表3，由表2可知槲皮素对DPPH·自由基清除效果最高，相当于82.61mgVc/g，芦丁为53.15mgVc/g，相比无显著差异(P＜0.05)，夏枯草为49.38mgVc/g，有显著差异(P＞0.05)。因此在DPPH·自由基清除试验中，三种物质的抗氧化能力槲皮素＞芦丁＞夏枯草。[0046] 表3DPPH·自由基清除效果[0047] 提取物 浓度 加样量(μL) 清除率(％) Vc(mg/g)芦丁 0.5g/100mL 60 53.15±3.62 118.46±8.07B槲皮素 0.5g/100mL 60 72.61±3.90 161.83±8.69A夏枯草 0.5g/100mL 100 49.38±1.18 66.9±0.16C维生素C 0.1g/100mL 50 74.71±5.01 [0048] 3种物质ABTS·+自由基清除效果的评估见表4，由表3可知槲皮素对ABTS·+清除效果最好，相当于106.91mgVc/g，芦丁为101.14mgVc/g，相比无显著差异(P＜0.05)，夏枯草为75.68mgVc/g，有显著差异(P＞0.05)。因此在ABTS·+自由基清除试验中，三种物质的抗氧化能力为槲皮素＞夏枯草＞芦丁。[0049] 表4ABTS·+自由基清除效果[0050]提取物 浓度 加样量(μL) 清除率(％) Vc(mg/g)芦丁 0.5g/100mL 100 67.14±8.71 38.43±2.00C槲皮素 0.5g/100mL 100 93.91±4.75 53.75±2.74A夏枯草 0.5g/100mL 500 80.68±6.59 46.18±0.75B维生素C 0.1g/100mL 15 52.41±5.60 [0051] 3种物质FRAP值的评估见表5，由表5可知槲皮素FRAP值最大，为1.45mmol/LFeSO4，芦丁为1.01mmol/LFeSO4，相比有显著差异(P＞0.05)，夏枯草为0.93mmol/LFeSO4。3种样品FRAP值排序为：槲皮素＞芦丁＞夏枯草。[0052] 表5FRAP值实验结果[0053]提取物 浓度 加样量(μL) FRAP Vc(mg/g)芦丁 0.5g/100mL 100 1.05 0.48±0.03B槲皮素 0.5g/100mL 100 1.45 0.66±0.05A夏枯草 0.5g/100mL 100 0.93 0.43±0.04C维生素C 0.1g/100mL 500 2.18 [0054] 3种物质正交试验结果见表6，由表6可知三种物质复合之后，主效应为槲皮素＞芦丁＞夏枯草，正交实验理论分析结果表明：三种物质的配比为3:3:1时，总抗氧化能力最大。经重复验证在该配比情况下，ABTS、DPPH、PTIO和FRAP值分别为59.67、173.69、321.59和0.89VCmg/g，合计总抗氧化能力为555.84VCmg/g。综合分析，使用该最佳配比用于后续试验。[0055] 表6正交实验结果[0056][0057] 实验2复合植物提取物(Compoundplantsextract，CPE)缓解双氧水诱导的鸡胚原代肝细胞毒性研究[0058] 1材料与方法[0059] 1.1药品及试剂[0060] 复合植物提取物(槲皮素：芦丁：夏枯草＝3:3:1)，溶于无水乙醇中。DMEM与Ham’sF‑12培养基以1:1比例混合改改良得到的DMEM/F‑12培养基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶EDTA购自Gibco(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。青霉素‑链霉素抗生素溶液购自Pricells(中国武汉)。磷酸盐缓冲盐水(PBS)购自Dulbecco。ML385购自GlpBio。[0061] 1.2细胞的准备与处理[0062] CEHs细胞的培养基是由高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)/F12培养基组成，并补充了10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素‑链霉素。[0063] 取14胚龄的无菌鸡胚放置于一次性无菌培养皿中，迅速断头处死后剖腹取出肝脏置于4℃预冷含有1％青霉素‑链霉素的磷酸缓冲液(PBS)中，剥离其余组中后分别置于5mL离心管中剪碎，加入2mL0.25％胰蛋白酶，置于37℃水浴锅中消化30min，每隔3min摇动1次，待大块肝脏组织消失后加入2mL含有10％胎牛血清和1％青霉素‑链霉素的DMEM/F12培养基混匀，用200目细胞筛过滤收集滤液，以1000r/min的离心10min，除去上清液并加入1.5ml的DMEM/F12完全培养基和提前准备的3mL50％Percoll细胞分离液混合均匀后，以3000r/min的速度离心15min。离心后取2mL中间层放入新的离心管中，加入等量的DMEM/F12完全培养基2mL，以1000r/min的速度离心10min。弃除上清，加入DMEM/F12完全培养基对肝5细胞进行重悬，然后以1.0×10 个/mL的密度接种到6孔板或96孔板中，每隔48h更换一次培养基，观察并拍摄细胞图片，测定细胞活力并绘制细胞生长曲线。[0064] 1.3细胞活力的测定[0065] 使用甲基噻唑四唑(MTT)测定细胞活力，向每个孔中加入10μL的5mg/mLMTT溶液后孵育4小时后，除去细胞上清液，并向每个孔中加入150μLDMSO。然后，在室温下摇动10分钟后，使用ELx800酶标仪(Bio‑TekInstrumentsInc.，Winooski，VT，USA)在490nm的波长和630nm的参考波长下测量每个孔的吸光度并使用以下公式计算细胞活力：细胞活力(％)＝(实验组OD490‑实验组OD630)/(对照组OD490‑对照组OD630)×100。每个处理组6个重复。[0066] 1.4不同浓度过氧化氢和作用时间对CEHs细胞活力的影响[0067] 将原代鸡胚肝细胞以1.0×105个/mL接种到96孔板中，待细胞在5％CO2的37℃细胞培养箱中达约80％左右融合度，用不含血清和抗生素的细胞培养基稀释不同浓度的H2O2(0、0.25、0.5、1.0、2.0和4.0mM)，分别在6、12和24h检测细胞活力。[0068] 1.5不同浓度CPE和作用时间对CEHs细胞活力的影响[0069] 将细胞以1.0×105个/mL接种到96孔板中，用不含血清和抗生素的细胞培养基稀释不同浓度的CPE(0、5、10、20和40μM)处理细胞，分别在6、12和24h检测细胞活力。[0070] 1.6CPE对H2O2诱导下细胞的保护效果[0071] 将细胞以1.0×105个/mL接种到96孔板中，分别将与1mMH2O2混合后终浓度为0、5、10、20和40μM的CPE处理细胞12h检测细胞活力。[0072] 1.7CPE缓解H2O2诱导的细胞氧化应激[0073] 将CEHs细胞以1.0×105个/mL接种到6孔板中，达到80％合度后设置4个处理组(对照组、1mMH2O2组、10μMCPE组和1mMH2O2+10μM6‑Gin组)每个处理组3个重复，对应处理12h后分别进行流式细胞术检测、抗氧化酶活性检测、炎症因子检测。[0074] 1.8流式细胞凋亡测定[0075] 使用AnnexinV‑FITC/PICellApoptosisDetectionKit(#G1511(ServicebioBiotechnology,Wuhan,China))检查凋亡细胞死亡。用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化细胞，并以1,000rpm离心5分钟去除培养基。然后，用4℃预冷的PBS洗涤两次，将BindingBuffer(10×)稀释成1×Bindingbuffer工作液备用(1mLBindingBuffer(10×)加入9mL无菌去离子水),在细胞沉淀中加100μL1×Bindingbuffer工作液，重悬细胞。先加入5μLAnnexinV‑FITC混匀后再加入5μLPropidiumIodide，混匀。室温下避光反应15min。染色孵育后，每管加入400μL1×BindingBuffer工作液，混匀后使用CytoFLEX流式细胞仪检测(Beckman，Brescia，CAUS)。AnnexinV‑FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测，PI红色荧光通过PI通道(FL2)检测。流式细胞仪参数如下：激发波长Ex＝488nm，发射波长FL1(Em＝525±20nm)；FL2(Em＝585±21nm)。用FlowJo软件分析细胞不同状态的比例及数目。[0076] 1.9数据统计与分析[0077] 数据被呈现为均值±标准差(SD)，并使用SPSS23.0软件(IBMCorporation，Armonk，NY，USA)进行单因素方差分析(ANOVA)。所有图片均使用GraphPadPrism9生成(GraphPadSoftwareInc，SanDiego，CA，USA),在统计学上P‑value<0.05被认为是显著的，P<0.01被认为极显著其差异，P>0.05被认为无显著性差异。[0078] 2结果[0079] 2.1不同浓度H2O2和时间对CEHs细胞活力的影响[0080] 将CEHs细胞分别暴露于不同浓度(0、0.25、0.5、1、2、4mM)的H2O2中6、12和24h，如表7所示，CEHs细胞活力随着H2O2浓度和处理时间的增加而逐渐降低。H2O2浓度为1mM处理CEHs12h时CEHs活力为76.69％，适合作为后续损伤模型。[0081] 表7不同浓度的H2O2处理不同时间对CEHs细胞活力的影响[0082][0083] 在相同的列中，显著差异P<0.01水平由不同的大写字母(A，B和C)表示，而显著差异P>0.05水平由相同的大写字母表示。在同一行中，显著差异P<0.05水平由不同的小写字母(a，b，candd)表示，而不显著的差异P>0.05水平由相同的小写字母表示。[0084] 2.3不同浓度CPE和作用时间对CEHs细胞活力的影响[0085] 如表8所示，与对照组相比5、10和20μM的CPE未对细胞表现出显著损伤(P>0.05)，但达到40μM时对细胞呈现抑制趋势。10μM的CPE处理12h细胞活力达到最高(112.4％)。[0086] 表8不同浓度的CPE孵育不同时间对细胞活力的影响[0087][0088] 在相同的列中，显著差异P<0.01水平由不同的大写字母(A，BandC)表示，而不显著差异P>0.05水平由相同的大写字母表示。在同一行中，显著差异P<0.05水平由不同的小写字母(a，b，candd)表示，而不显著的差异P>0.05水平由相同的小写字母表示。[0089] 2.4CPE缓解H2O2诱导的CEHs细胞的损伤[0090] 将10μMCPE与1mMH2O2共同孵育12h后，细胞活力见表9，1mMH2O2处理细胞活力为77.28％，添加10μMCPE后细胞活力提升至101.11％(P<0.05)。结果表明，添加10μMCPE共处理可以缓解H2O2诱导的CEHs细胞损伤。[0091] 表9CPE缓解H2O2诱导的CEHs细胞的损伤[0092] 对照组 1mMH202 10μMCPE 10μMCPE+1mMH202a b a a细胞活力％ 100±3.8 77.28±2.14 103.12±3.24 101.11±2.15[0093] 实验3复合植物提取物(CPE)缓解肉鸡热应激动物实验[0094] 1动物试验[0095] 1.1饲养试验设计及分组[0096] 每1kgCPE含300g芦丁提取物+300g槲皮素提取物+100g夏枯草提取物(20:1)，其余载体为无水葡萄糖。[0097] 选取健康且体重无差异的AA肉鸡300只(公母各半)，思维肉鸡前期日粮21d后(表1)，选取体重一致的肉鸡120只，分为3个处理组，每个处理组5个重复，每个重复8只(公母各半)。分组如下：[0098] 对照组：温度控制在(23±1)℃，湿度约60％；[0099] B组：热应激组，温度控制在(33±1)℃，湿度约70％。[0100] C组：热应激+CPE组(0.5kg/吨)，温度控制在(33±1)℃，湿度约70％。[0101] 试验周期21d，日粮配比见表10。多层笼养，24h光照，自由采食和饮水。[0102] 表10肉鸡饲料配比[0103][0104][0105] 注:日粮配方按照NRC(1994)的肉仔鸡饲养标准配制。预混料包括(每kg全价料中计)：VA12000IU；VD33000IU；VE20IU；VK31.0mg；VB12.0mg；VB63.5mg；VB120.01mg；铜Cu(ascoppersulfate)8mg；铁Fe(asferroussulfate)100mg；锰Mn(asmanganesesulfate)80mg；锌Zn(aszincoxide)60mg；碘I(ascalciumiodate)0.45mg；硒Se(assodiumselenite)0.35mg；生物素Biotin0.15mg；叶酸Folicacid1.25mg；核黄素(VB2，riboflavin)6mg；烟酸(尼克酸)Nicotinicacid35mg；泛酸钙10mg。粗蛋白、钙、总磷含量为测定值，其余为计算值。[0106] 2测定指标及方法[0107] 2.1生产性能测定[0108] 记录每天的采食量，回收抛洒料；观察记录肉鸡的健康状况、死亡情况以及腹泻情况。分别于21d和42d空腹12h称重，计算每个重复鸡的平均日增重(ADG)，平均日采食量(ADF)，并计算饲料转化率(F/G)和死亡率。死亡率＝死亡数/鸡总数，[0109] 2.2代谢试验及相关指标测定[0110] 采用全收粪法，在鸡笼下设粪盘套黑色垃圾袋，收集第37‑39d的排泄物，及时拣出皮屑、羽毛和饲料等杂物。每天的排泄物混匀，滴加10％硫酸以固定氮，冻于‑20℃冰箱中，试验结束后混匀3d收集的排泄物，称重、取样，记录总粪重和取样重。在60‑65℃烘干，自然状态下充分回潮24h，称重记录，粉碎后过40目筛备用。[0111] 饲料和粪样中的粗蛋白质测定，采用国标GB/T6432‑94；粗脂肪测定采用国标GB/T6433‑2006；钙测定采用乙二胺四乙酸二钠络合滴定法；磷测定采用国标GB/T6437‑2002。饲料和样品中的两种毒素含量按照拜发试剂盒步骤测定。[0112] 2.3血清的抗氧化酶测定[0113] 从每个重复中分别选择一只接近平均体重的鸡颈动脉采血，每只采血5mL，3000rpm离心10min，取血清。血清中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH‑PX)、总抗氧化能力(T‑AOC)和丙二醛(MDA)的测定均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行检测[0114] 3试验结果[0115] 3.1生长性能[0116] 在22‑42d试验期，热应激的平均采食量、日增重显著低于其它2组，料肉比显著其它2组(P＜0.05)。添加CPE后上述指标恢复到和对照组无显著性差异(P＞0.05)。[0117] 表11CPE对肉鸡热应激生产性能的影响[0118] 对照组 热应激组 热应激+CPE组a b a平均采食量g 121.35±8.79 89.35±7.21 116.25±8.32a b a平均日增重g 59.27±7.31 36.89±4.21 58.21±7.32ab a b料肉比 2.04±0.12 2.42±0.27 1.99±0.32死亡率％ 0 30 5[0119] 3.2养分代谢率[0120] 在22‑42d试验期，热应激组的平均采食量、日增重显著低于其它2组，料肉比显著其它2组(P＜0.05)。添加CPE后上述指标恢复到和对照组无显著性差异(P＞0.05)。[0121] 表12CPE对肉鸡热应激养分代谢率的影响(％，n＝4)[0122] 对照组 热应激组 热应激+CPE组a b a粗蛋白 62.31±1.35 49.34±2.11 54.61±3.04a b a粗脂肪 72.38±2.32 59.23±1.11 71.19±3.21a b aCa 41.29±0.89 29.34±1.08 38.35±1.31a b ap 49.27±2.13 27.12±0.64 47.29±1.31[0123] 3.3血清抗氧化酶活力[0124] 在22‑42d试验期，热应激组的抗氧化酶显著低于其它2组，MDA含量显著高于其它2组(P＜0.05)。添加CPE后上述指标恢复到和对照组无显著性差异(P＞0.05)。[0125] 表13CPE对肉鸡热应激血清抗氧化酶活力的影响(n＝4)[0126] 对照组 热应激组 热应激+CPE组a b a总抗氧化能力(mmol/mL) 0.61±0.02 0.31±0.02 0.59±0.02a b过氧化氢酶(u/mL) 8.89±0.29 4.39±0.23 8.87±0.69ab c aSOD(u/mL) 42.08±4.95 10.98±0.38 51.49±0.27b b aGSH‑PX(μmol/mL) 503.12±12.12 283.47±18.21 499.31±14.28b a bMDA(nmol/mL) 2.88±0.13 4.15±0.12 2.99±0.13

专利地区：河南

专利申请日期：2024-06-20

专利公开日期：2024-10-08

专利公告号：CN118743722A