基于QuEChERS法建立的棉花叶片中植物激素的HPLC-MS/MS检测方法

专利名称：基于QuEChERS法建立的棉花叶片中植物激素的HPLC-MS/MS检测方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202311710616.3

专利申请（专利权）人：中国农业科学院棉花研究所
权利人地址：河南省安阳市开发区黄河大道38号

专利发明（设计）人：发明人:吴长才,王文浩,马艳,单永潘,马亚杰,王丹,宋贤鹏,任相亮,胡红岩

专利摘要：本发明属于分析化学领域，提供了一种基于QuEChERS法建立的棉花叶片中植物激素的HPLC‑MS/MS检测方法。该方法可对棉花叶片中的ZR、ZT、IAA、GA3和ABA等多种植物激素同时进行检测与定量，该方法包括：对新鲜叶片进行前处理，制备待测液，高效液相色谱‑串联质谱检测等操作，采用电喷雾电离正负离子同时扫描模式和多反应监测扫描模式，可同时对5种植物激素中的一种或多种进行定性或定量检测。本发明提供的方法具有良好的特异性、选择性与精密度，可以实现低定量限，高线性范围的检测，一个样品的检测时间仅6 min，因此本发明可以有效提高分析效率，适用于棉花叶片中植物激素的检测。

主权利要求：
1.一种基于QuEChERS法建立的棉花叶片中植物激素的HPLC‑MS/MS检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）QuEChERS前处理：称取2.5±0.05g的棉花叶片置于离心管中，研磨粉碎，加入7.5mL提取溶液，再加入0.25mL去离子水；使用高速匀浆机高速匀浆提取1min后5000r/min离心5min，吸取1.8mL离心后得到的上清液置于含有150mgMgSO4+30mgC18的QuEChERS离心管中，涡旋混合1min，以4000r/min离心5min，过0.22μm亲水性PTFE滤膜后，得前处理样品；
（2）配制不同浓度的植物激素混合标准溶液，绘制标准曲线；
（3）使用高效液相色谱‑串联质谱法对前处理样品中的植物激素进行定性定量检测；
所述植物激素为ZR、ZT、IAA、GA3和ABA；
步骤（1）中，所述提取溶液为含有1mmol/LBHT的0.1%乙酸甲醇；
步骤（3）中，所述液相色谱‑串联质谱法的色谱条件为：色谱柱：Shim‑packC18色谱柱，
150mm×3.0mm，3μm；自动进样器温度为15℃，柱温：40℃；流动相：流动相A相为0.1%乙酸‑甲醇溶液，流动相B相为0.1%甲酸‑水溶液；流速：0.4mL/min；洗脱时间为6min；洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的过程为：
；
所述液相色谱‑串联质谱法的质谱条件包括：离子源：电喷雾离子源，正/负离子扫描模式；气帘气压力：35psi；喷雾器压力：40psi；辅助加热气压力：40psi；正离子电离模式下离子化电压：5500kV；负离子电离模式下离子化电压：‑4500kV。
2.根据权利要求1所述的HPLC‑MS/MS检测方法，其特征在于，步骤（2）中，标准溶液的具体配置为：使用甲醇溶解植物激素标准品10mg，制备成10mg/mL的对照品母液；使用甲醇将母液稀释成0.5‑500μg/kg的目标植物激素标准溶液，避光储存于‑20℃。
3.根据权利要求1所述的HPLC‑MS/MS检测方法，其特征在于，待测植物激素的化合物离子对及质谱参数为：。 说明书 : 基于QuEChERS法建立的棉花叶片中植物激素的HPLC‑MS/MS检
测方法技术领域[0001] 本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于QuEChERS法建立的棉花叶片中植物激素的HPLC‑MS/MS检测方法。背景技术[0002] 植物激素是植物细胞在特定环境信号诱导下产生的活性物质，可在低浓度下调节植物的生理反应，在植物的整个生长周期（包括细胞分裂、器官发育、种子休眠、萌发、器官衰老和脱落）中发挥重要作用。在植物的生长发育、新陈代谢以及生物和非生物胁迫反应中发挥着至关重要的作用。目前，常见的植物激素包括生长素、细胞分裂素（CK）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、油菜素内酯（BR）、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）以及几种新发现的植物激素，如绞股蓝内酯（SL）。植物激素并非独立作用，不同激素之间存在促进或拮抗作用，系统地调节植物的生长和发育。其调节作用通常取决于植物激素的浓度[0003] 植物内源激素的丰度极低，在植物中大多仅存在痕量，检测难度较高，通常需要复杂的前处理方法及精确的仪器进行检测和定量。目前常用的检测技术主要包分为酶联免疫法、电化学分析以及色谱质谱联用分析三类。酶联免疫法的操作简单，适合测量大量植物中的植物内源激素，但是在检测中不同的激素间容易相互污染，导致样本出现假阳性。早期的植物内源激素电化学研究主要集中在脱落酸、赤霉素、玉米素和激动素的电化学行为上，但研究发现激素的电化学行为会受到PH值和溶液基质的影响，尤其在植物样品中的影响更大，因此电化学分析很少用于真实样品的测定。近年来植物内源激素分析定量较为常用的方法是色谱质谱联用法，其灵敏度和特异性高且可以同时检测多种激素，可以在组织和细胞水平上对植物内源激素进行定量和定性分析。相较于气相色谱，液相色谱‑质谱可以通过复杂的衍生过程分离化合物，是目前植物内源激素检测常用的重要方法。[0004] 不论使用何种方法检测植物内源激素，都需要对对植物基质进行一定步骤的前处理过程来对消除杂质，并且使目标化合物富集，目前，SPE是提取植物内源激素最常使用的前处理方法，但是其较为复杂的前处理过程导致其需要更长的时间去完成基质的净化，因此无法应用于大规模的植物内源激素检测实验中。[0005] 棉花是世界上种植最广泛的纤维作物，占全球纤维产量的近40%，长期以来一直是植物研究的重点之一。当棉花遭遇逆境时，植物激素可以在浓度较低的情况下进行协调，使植物能够准确及时地感知并做出反应。棉花叶片中ABA升高、IAA降低、ZR降低气孔导度等现象可能会减缓植物的新陈代谢，从而降低逆境损失。JA、SA和BR会参与棉花对涝害的响应，因为许多与JA、SA和BR相关的差异表达基因在受胁迫的棉花中上调，JA、SA和BR这三种激素参与了同个信号级联网络，帮助植物适应非生物胁迫。因此，植物激素浓度的变化及其相互作用在棉花适应逆境和抗逆生长中起着至关重要的作用。现有技术中棉花中内源激素的检测方法，前处理过程复杂，且检测灵敏度等有待提高。发明内容[0006] 针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种基于QuEChERS法建立的棉花叶片中植物激素的HPLC‑MS/MS检测方法，该方法可对棉花叶片中的玉米素核苷（ZR）、玉米素（ZT）、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）中的一种或多种同时进行检测，本发明建立的检测方法，简单、方便、价廉、灵敏度高、选择性强，并将该方法应用于实际样品中，对棉花中的植物激素进行检测、分析和定量，有助于棉花上进行更深入的生理研究。[0007] 为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：[0008] 本发明提供了一种基于QuEChERS法建立的棉花叶片中植物激素的HPLC‑MS/MS检测方法，包括以下步骤：[0009] （1）基于QuEChERS方法对棉花叶片进行前处理，得到前处理样品；[0010] （2）配制不同浓度的植物激素混合标准溶液，绘制标准曲线；[0011] （3）使用高效液相色谱‑串联质谱法对样品中的植物激素进行定性定量检测。[0012] 本发明提供的检测方法，所述植物激素包括但不限于：ZR、ZT、IAA、GA3、IAA。[0013] 进一步的，步骤（1）中，所述前处理过程中，棉花叶片和提取溶液的质量体积比为1g:(3‑4)mL；优选的，所述前处理使用的提取溶液为含有1‑2mmol/L的0.01‑0.11%乙酸‑甲醇溶液。[0014] 进一步的，步骤（1）中，所述前处理还包括净化过程，采用的净化剂为140‑160mgMgSO4+20‑40mgC18。[0015] 进一步的，步骤（2）中，标准溶液的具体配置为：使用甲醇溶解植物激素标准品10mg，制备成10mg/mL的对照品母液；使用甲醇将母液稀释成0.5‑500μg/kg的目标植物激素标准溶液，避光储存于‑20℃。[0016] 本发明提供的检测方法中，所述液相色谱‑串联质谱法的色谱条件为：色谱柱：Shim‑packC18色谱柱，150mm×3.0mm，3μm；自动进样器温度为15℃，柱温：40℃；流动相：流动相A相为0.1%乙酸‑甲醇溶液，流动相B相为0.1%甲酸‑水溶液；流速：0.4mL/min；洗脱时间为6min；洗脱方式为梯度洗脱。[0017] 进一步的，所述梯度洗脱的过程为：[0018] 。[0019] 进一步的，所述液相色谱‑串联质谱法的质谱条件包括：离子源：电喷雾离子源，正/负离子扫描模式；气帘气压力：35psi；喷雾器压力：40psi；辅助加热气压力：40psi；正离子电离模式下离子化电压：5500kV；负离子电离模式下离子化电压：‑4500kV。[0020] 采用上述检测方法，待测植物激素的化合物离子对及质谱参数为：[0021] 。[0022] 本发明采用QuEChERS前处理法仅涉及两个步骤，因此最大限度地减少了样品制备步骤的数量，本发明提供的前处理方法，具有允许提取极性分析物，选择性和可检测性更高，与气相色谱和液相色谱结合质谱法直接兼容，需要的提取溶剂和样品的制备时间更少，且回收率更加出色等优点。本发明提供的检测方法，同样适用于其他植物叶片中内源激素的痕量检测，普适性强。[0023] 相较于现有技术，本发明的有益效果在于：[0024] （1）本发明提供的方法具有良好的特异性、选择性与精密度，可以实现低定量限，高线性范围的检测，一个样品的检测时间仅6min，因此本发明可以有效提高分析效率，适用于如棉花叶片中浓度较低的植物激素的检测；[0025] （2）本发明使用QuEChERS法作为前处理方法，实现了前处理的快速、简便、高效、精准，并且可以和高效液相色谱‑串联质谱法直接兼容，形成了完整的检测方法，可以有效降低棉花中植物激素检测的难度。附图说明[0026] 图1为本发明前处理流程图；[0027] 图2为5种植物激素的色谱图；[0028] 图3对比例3的总离子流图。具体实施方式[0029] 下面将对本发明的技术方案进行完整、清晰的叙述，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，而并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。[0030] 实施例1[0031] 本实施例提供一种棉花叶片中多种植物激素的检测方法，用于检测棉花叶片中一种或多种植物激素的含量，具体操作流程如下：[0032] 1、样品预处理[0033] 将棉花叶片冷冻后，使用破碎机进行破碎，使其完全均质。[0034] 2、配置标准工作溶液[0035] 准确称取10mg（精确至0.01mg）的玉米素核苷（ZR）、玉米素（ZT）、吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）于10mL的容量瓶中，使用甲醇溶解，并定容至刻度线，配置成浓度为1mg/mL的标准母液。试验前使用甲醇稀释至0.5‑500μg/kg的标准工作溶液，现配现用。[0036] 3、QuEChERS前处理[0037] 称取2.5±0.05g的棉花叶片置于置于50ml聚四氟乙烯离心管中，研磨粉碎，加入7.5mL提取溶液（含有1mmol/LBHT的0.1%乙酸甲醇），再加入0.25mL去离子水。使用高速匀浆机高速匀浆提取1min后5000r/min离心5min。吸取1.8mL离心后得到的上清液置于含有150mgMgSO4+30mgC18的QuEChERS离心管中，涡旋混合1min，以4000r/min离心5min，过0.22μm亲水性PTFE滤膜后，注入进样小瓶，待上机检测。[0038] 4、上机检测[0039] 将经过QuEChERS前处理后的待测样品进行上机检测，使用高效液相色谱‑串联质谱测定样品中ZR、ZT、IAA、GA3、ABA的含量。[0040] （1）色谱条件：[0041] 色谱柱：Shim‑packC18column（150mm×3.0mm,3μm），日本岛津公司；[0042] 自动进样器温度为15℃，柱温箱温度为40℃，进样量：2μL；[0043] 流动相A相：0.1%乙酸甲醇溶液流动相B相：0.1%甲酸水溶液[0044] 洗脱方式：梯度洗脱梯度洗脱程序如下：0.0‑1.0min，流动相A相保持5%，流动相B相保持95%；1.0‑3.0min，流动相A相由5%‑95%，流动相B相由95%‑5%，3.0‑4.5min，流动相A相保持95%，流动相B相保持5%；4.5‑4.6min，流动相A相由95%‑5%，流动相B相由5%‑95%；4.6‑6.0min，流动相A相保持5%，流动相B相保持95%[0045] （2）质谱条件：[0046] 离子源：电喷雾离子源，正/负离子扫描模式；气帘气压力：35psi；喷雾器压力：40psi；辅助加热气压力：40psi；正离子电离模式下离子化电压：5500kV；负离子电离模式下离子化电压：‑4500kV。[0047] 效果实施例[0048] 本实验例用于对实施例1中的检测方法进行可行性验证。[0049] （1）方法的特异性与稳定性[0050] 将5种不含目标植物激素的空白棉花叶片样品基质按照实施例1中所述方法分别进行前处理，本发明通过检测7个100μg/L添加水平下的空白基质样品来评估方法的特异性，并证实在所有样品中目标分析物的保留时间附近没有干扰峰。每个月对基质标准工作溶液（100μg/L）进行分析，并采用t检验评价各植物内源激素在空白棉花叶片样品中的稳定性。且每个月的空白棉花叶片的基质标准溶液均无显著差异。[0051] （2）方法的线性与基质效应[0052] 通过采用实施例1中配置标准工作溶液的步骤配置的混合母液，使用甲醇分别稀释为0.5、1、5、10、50、100、500μg/kg的混合标准工作溶液，[0053] 上机测定后，以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，仪器的响应值为纵坐标，绘制标准工作曲线，标准工作曲线如表1所示，在0.5‑500μg/kg的浓度范围内，5种植物激素的相2关系数R均>0.99，表明本发明具有良好的线性范围。[0054] 表15种植物激素的标准曲线线性方程[0055][0056] （3）方法的定量限与检测限[0057] 测定标准品及加标样品，通过计算3倍信噪比（S/N）得出检出限，10倍信噪比（S/N）得出定量限。本方法中ZR、ZT、IAA和ABA的定量限均为5μg/kg，GA3的定量限为20μg/kg。此外，棉花叶片中所有化合物的均在0.09‑0.27μg/kg的范围内。[0058] （4）方法的准确性与精密度[0059] 本试验中，方法的准确性与精密度通过样品的添加回收试验进行验证，使用空白的棉花样品，在四个添加回收水平下（5、10、100、1000μg/kg）进行了3天的添加回收试验，对棉花叶片中5种植物激素的回收率和、日内相对标准偏和日间相对标准偏差进行了评价，以验证该方法的准确性和精密度。每个处理均按照1.3中的步骤进行连续3天的连续提取，结果如表2所示，回收率介于80.78% 92.87%之间，日内相对标准偏差和日间相对标准~偏差分别介于2.19% 8.47%和1.07% 14.64%之间。~ ~[0060] 表25种植物激素在棉花叶片样品中的准确度和精密度[0061][0062] 对比例1[0063] （1）本对比例提供一种棉花叶片中多种植物激素的检测方法，用于检测棉花叶片中一种或多种植物激素的含量，该方法中步骤1（样品预处理）、步骤2（配置标准工作溶液）、步骤4（上机检测）与实施例1相同，区别主要在于：在步骤3（QuEChERS前处理）中，提取溶液采取：甲醇+1mmol/LBHT、具体如下：[0064] QuEChERS前处理[0065] 称取2.5±0.05g的棉花叶片置于置于50ml聚四氟乙烯离心管中，研磨粉碎，加入7.5mL提取溶液（含有1mmol/LBHT的甲醇），再加入0.25mL去离子水。使用高速匀浆机高速匀浆提取1min后5000r/min离心5min。吸取1.8mL离心后得到的上清液置于含有150mgMgSO4+30mgC18的QuEChERS离心管中，涡旋混合1min，以4000r/min离心5min，过0.22μm亲水性PTFE滤膜后，注入进样小瓶，待上机检测。[0066] （2）将对比例1提供的检测方法进行方法学验证，具体如下：[0067] 取5.00g空白棉花叶片样品于离心管中，0.1μg/kg的ZR、ZT、IAA、GA3和ABA，按对比例1中方法进行前处理后，在高效液相色谱‑串联质谱仪（UPLC‑MS/MS）上机测定5种植物激素的含量，计算加标回收率。[0068] ZR、ZT、IAA、GA3和ABA在棉花叶片中的回收率分别为77.29%、94.13%、75.65%、73.74%和83.10%；其中ZR、IAA和GA3在棉花叶片的回收率均不满足方法学评价要求，说明含有1mmol/LBHT的甲醇并不适用于棉花中5种植物激素含量的检测。[0069] 对比例2[0070] （1）本对比例提供一种棉花叶片中多种植物激素的检测方法，用于检测棉花叶片中一种或多种植物激素的含量，该方法中步骤1（样品预处理）、步骤2（配置标准工作溶液）、步骤4（上机检测）与实施例1完全相同，区别主要在于：在步骤3（QuEChERS前处理）中，提取溶液采取：0.1%甲酸甲醇+1mmol/LBHT、具体如下：[0071] QuEChERS前处理[0072] 称取2.5±0.05g的棉花叶片置于置于50ml聚四氟乙烯离心管中，研磨粉碎，加入7.5mL提取溶液（含有1mmol/LBHT的0.1%甲酸甲醇），再加入0.25mL去离子水。使用高速匀浆机高速匀浆提取1min后5000r/min离心5min。吸取1.8mL离心后得到的上清液置于含有150mgMgSO4+30mgC18的QuEChERS离心管中，涡旋混合1min，以4000r/min离心5min，过0.22μm亲水性PTFE滤膜后，注入进样小瓶，待上机检测。[0073] （2）将对比例2提供的检测方法进行方法学验证，具体如下：[0074] 取5.00g空白棉花叶片样品于离心管中，0.1μg/kg的ZR、ZT、IAA、GA3和ABA，按对比例2中方法进行前处理后，在高效液相色谱‑串联质谱仪（UPLC‑MS/MS）上机测定5种植物激素的含量，计算加标回收率。[0075] ZR、ZT、IAA、GA3和ABA在棉花叶片中的回收率分别为76.07%、[0076] 67.39%、76.63%、71.54%和78.20%，5种植物激素在棉花叶片的回收率均不满足方法学评价要求，说明含有1mmol/LBHT的0.1%甲酸甲醇并不适用于棉花中5种植物激素含量的检测。[0077] 对比例3[0078] （1）本对比例提供一种棉花叶片中多种植物激素的检测方法，用于检测棉花叶片中一种或多种植物激素的含量，该方法中步骤1（样品预处理）、步骤2（配置标准工作溶液）、步骤3（QuEChERS前处理）与实施例1完全相同，区别主要在于：在步骤4（上机检测）中，流动相A相采取：甲醇，流动相B相采取：水，具体如下：[0079] （2）上机检测[0080] 将经过QuEChERS前处理后的待测样品进行上机检测，使用高效液相色谱‑串联质谱测定样品中ZR、ZT、IAA、GA3、ABA的含量。[0081] ①色谱条件：[0082] 色谱柱：Shim‑packC18column（150mm×3.0mm,3μm），日本岛津公司；[0083] 自动进样器温度为15℃，柱温箱温度为40℃，进样量：2μL；[0084] 流动相A相：甲醇流动相B相：水[0085] 洗脱方式：梯度洗脱梯度洗脱程序如下：0.0‑1.0min，流动相A相保持5%，流动相B相保持95%；1.0‑3.0min，流动相A相由5%‑95%，流动相B相由95%‑5%，3.0‑4.5min，流动相A相保持95%，流动相B相保持5%；4.5‑4.6min，流动相A相由95%‑5%，流动相B相由5%‑95%；4.6‑6.0min，流动相A相保持5%，流动相B相保持95%[0086] ②质谱条件：[0087] 离子源：电喷雾离子源，正/负离子扫描模式；气帘气压力：35psi；喷雾器压力：40psi；辅助加热气压力：40psi；正离子电离模式下离子化电压：5500kV；负离子电离模式下离子化电压：‑4500kV。[0088] （3）将对比例3提供的检测方法的峰形进行考察，具体如下：[0089] 色谱条件：[0090] 色谱柱：Shim‑packC18column（150mm×3.0mm,3μm），日本岛津公司；[0091] 自动进样器温度为15℃，柱温箱温度为40℃，进样量：2μL；[0092] 流动相A相：甲醇流动相B相：水[0093] 洗脱方式：梯度洗脱梯度洗脱程序如下：0.0‑1.0min，流动相A相保持5%，流动相B相保持95%；1.0‑3.0min，流动相A相由5%‑95%，流动相B相由95%‑5%，3.0‑4.5min，流动相A相保持95%，流动相B相保持5%；4.5‑4.6min，流动相A相由95%‑5%，流动相B相由5%‑95%；4.6‑6.0min，流动相A相保持5%，流动相B相保持95%[0094] （2）质谱条件：[0095] 离子源：电喷雾离子源，正/负离子扫描模式；气帘气压力：35psi；喷雾器压力：40psi；辅助加热气压力：40psi；正离子电离模式下离子化电压：5500kV；负离子电离模式下离子化电压：‑4500kV。[0096] 总离子流图如图3所示，5种植物激素无法被全部分离，说明使用甲醇作为流动相A相，水作为流动相B相并不适用于棉花中5种植物激素含量的检测。

专利地区：河南

专利申请日期：2023-12-13

专利公开日期：2024-10-11

专利公告号：CN117571906B