一种具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的蛋白及其应用

专利名称：一种具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的蛋白及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202211350378.5

专利申请（专利权）人：河南省健康元生物医药研究院有限公司
权利人地址：河南省焦作市马村区金源路8号

专利发明（设计）人：发明人:梁恒宇,周鹏,李雪亮,韩超,陈民良,郭慧萍,张敏,杨梦园,侯剑桥,张皓

专利摘要：本发明公开了一种具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的蛋白及其应用。属于基因编辑技术领域。本发明通过对产黄枝顶头孢霉AcfaeB基因进行敲除，避免了将CPC水解为DCPC，从而提高CPC发酵产量，降低了其副产物DCPC的产量。利用本发明的产黄枝顶头孢霉AcfaeB基因及其编码的蛋白质能够有效促进头孢菌素C的合成速率和产量，具有很好的工业应用前景。

主权利要求：
1.敲除AcfaeB基因在发酵生产头孢菌素C中的应用，其特征在于，AcfaeB基因的核苷酸序列如SEQID:NO.1所示；
AcfaeB基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQID:NO.2所示。
2.敲除AcfaeB基因在头孢菌素C发酵生产过程中降低去乙酰头孢菌素C副产物产量积累的应用，其特征在于，AcfaeB基因的核苷酸序列如SEQID:NO.1所示；
AcfaeB基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQID:NO.2所示。
3.高产头孢菌素C的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过对产黄枝顶头孢霉(Acremoniumchrysogenum)的AcfaeB基因进行敲除获得，所述AcfaeB基因的核苷酸序列如SEQID:NO.1所示。
4.如权利要求3所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤:(1)构建AcfaeB靶基因敲除基因编辑载体；
(2)产黄枝顶头孢霉原生质体的制备；
(3)将AcfaeB靶基因敲除基因编辑载体转化到产黄枝顶头孢霉原生质体中；
(4)筛选、验证。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作为：(11)选取AcfaeB基因的sgRNA‑N19靶向序列SEQIDNO.5；
(12)设计AcfaeB基因CRISPR敲除片段ΔAcfaeB*，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
(13)将ΔAcfaeB*连接到pFC332空质粒。
6.权利要求3所述的基因工程菌、权利要求4‑5任一所述的构建方法构建的基因工程菌在发酵生产头孢菌素C中的应用。 说明书 : 一种具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的蛋白及其应用技术领域[0001] 本发明涉及基因编辑技术领域，更具体的说是涉及一种具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的蛋白及其应用。背景技术[0002] 头孢菌素C(CephalosporinC，英文缩写CPC)是自然界中发现的第二种β‑内酰胺类抗生素，也是生产头孢类抗生素重要中间体7‑氨基头孢烷酸(7‑ACA)的主要骨架原料。CPC能够抑制细菌细胞壁合成，但其抗菌活性较低。目前，工业上主要利用产黄支顶孢霉(Acremoniumchrysogenum，英文缩写Ac)发酵生产CPC。经过多年研究，CPC在产黄支顶孢霉中的生物合成途径已经基本清楚，这为利用基因工程手段改造这一重要的工业丝状真菌奠定了良好基础。[0003] 在CPC发酵过程中会产生青霉素N(PenicillinN，英文缩写PEN)、去乙酰氧头孢菌素C(DeacetoxycephalosporinC，英文缩写DAOC)、去乙酰头孢菌素C(DeacetylCephalosporinC，英文缩写DCPC)等中间代谢产物。其中DCPC为最主要的副产物，其结构与性质和CPC极为相似。发酵生产过程中DCPC的质量分数约为CPC质量分数的10％～30％。在目前主流的生产工艺中，DCPC虽能够与主产物CPC进行分离，但大量DCPC的积累不仅消耗发酵原料，其在余液中的残留还会造成环境污染，对工厂下游环保造成巨大压力。虽然目前已有学者对CPC废液中副产物的降低或再利用进行了一些研究，但因可操作性与经济效益低等问题，能真正应用于实际生产的工艺仍然很少。[0004] 以RNA介导的CRISPR系统(ClusteredRegularlyInterspaced ShortPalindromicRepeats，简写CRISPR)作为第三代基因组编辑技术，因其在基因编辑和基因修饰方面具有效率最高、成本最低和操作简便等优势。CRISPR技术在真菌遗传育种方面也具有重要应用前景，成为当前真菌功能基因组研究与遗传改造的研究热点。丝状真菌成熟基因编辑平台的构建，对挖掘这类微生物在工业、农业、医药等多种行业的应用价值与潜力起关键作用。在此基础上，通过中断宿主非同源末端连接的关键基因和精妙的同源重组供体设计，使得CRISPR/Cas系统能在特定位点引入变化，提高了基因编辑的精准性。[0005] DCPC在发酵液中的积累有两个主要原因：一、产黄支顶孢霉自身DCPC乙酰转移酶表达基因(cefG)启动子强度不足，转录量低，使DCPC无法有效向下转化为CPC，成为生产过程中的限速步骤之一；二、目前已知且唯一被研究过的CPC乙酰水解酶基因(cahB)存在于产黄支顶孢霉Ⅷ号染色体上。cahB可表达1.4kb的单链转录子，翻译出的乙酰水解酶(CPCAH)属于丝氨酸蛋白酶家族，可将发酵液中的CPC水解为DCPC，该酶活性随着发酵过程表达水平会持续下降，但有研究表明即使发酵144h后仍能检测到其活性。但最近有研究表明，单纯敲除cahB基因并不能显著降低产黄支顶孢霉菌株的DCPC产量(徐燕，冯涛，储炬.利用CRISPR/Cas9系统构建低DCPC杂质含量的CPC工业高产菌种[J].华东理工大学学报(自然科学版)，2021,47(4):427‑437.)，因此有学者推测还有其他类似基因表达产物具有将CPC水解为DCPC的乙酰水解酶活性。[0006] 综上，如何提供一种具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的蛋白及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。发明内容[0007] 有鉴于此，本发明提供了一种具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的蛋白及其应用。[0008] 针对现有头孢菌素C生产菌种在发酵过程中主要副产物脱乙酰基头孢菌素C(DCPC)产量较高从而导致的CPC上游发酵碳源利用率较低，而下游分离提取成本较高的难点，本发明首先要解决的技术问题是筛选到一种新的头孢菌素C乙酰水解酶基因，该基因是产黄支顶孢霉编码基因KFH42174.1，被命名为AcfaeB。[0009] 本发明其次要解决的技术问题是提供一株利用CRISPR/Cas9技术敲除AcfaeB编码基因KFH42174.1的产黄支顶孢霉基因编辑工程菌。[0010] 本发明还要解决的技术问题是提供上述产黄支顶孢霉基因编辑基因工程菌的构建方法。[0011] 本发明最后要解决的技术问题是提供上述产黄支顶孢霉基因编辑工程菌的应用。[0012] 为了克服上述技术问题和不足，本发明首先结合系统生物学数据和生物信息学预测工具进行基因挖掘，然后对疑似具有CPC乙酰水解酶活性的基因进行毕赤酵母表达，对可溶性表达的蛋白进行CPC体外水解去乙酰化能力进行研究，从中筛选得到一种新型阿魏酸酯酶B类蛋白(FeruloylesteraseB‑likeprotein)样基因的表达产物具有体外CPC乙酰水解酶活性，能够实现胞外分泌表达并水解CPC为DCPC。本发明将上述基因命名为AcfaeB。本发明还对产黄支顶孢霉AcfaeB基因进行了基因敲除，并对基因编辑后的基因工程菌的应用进行了研究。研究结果表明，敲除产黄支顶孢霉AcfaeB基因能够显著提高CPC的产量，同时大幅减少主要副产物DCPC的生成量。[0013] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：[0014] 一种蛋白，其氨基酸序列如SEQID:NO.2所示，且该蛋白具有头孢菌素C乙酰水解酶活性。[0015] MGNFRVTRSLAGLLTLGSSALAQLQNIPNFGNNPTGLSMDVYVPSNPPESPAVVLALHPCGGSGGGYAGQTGYTSIADQKGFIAIFPSSFRDMNCWDVASQASLTRDGGGDSTGLASMVQYALETWNADPDRIFVTGSSSGCMMTNVMSAAYPDLFAAASCYSGVAAGCLKGSPGSSPISADPTCANGEINLSAEEWAQRARDIYPGYSGSYPRFMTLHGTADWLVRIPNLEQQLMQWSTLHGVEQTASNPNTPQNGYTQLVYGDGTQLVGYSAEGVGHTVPVNSNLDMEWFGL，SEQID:NO.2。[0016] 进一步的，所述蛋白由SEQID:NO.1所示的核苷酸序列编码而成。[0017] ATGGGCAACTTCCGAGTCACACGGAGCCTTGCAGGTCTCCTTACGCTGGGCTCTTCAGCACTGGCCCAGCTGCAAAACATCCCCAACTTCGGCAACAACCCCACGGGCCTCTCCATGGACGTCTATGTCCCATCCAACCCCCCGGAGAGCCCTGCCGTGGTTCTGGCTCTCCATCCTTGCGGTGGTAGCGGTGGTGGCTATGCCGGGCAGACAGGCTACACTTCGATTGCGGACCAGAAGGGTTTCATCGCCATCTTCCCGTCCTCCTTCCGGGACATGAACTGCTGGGACGTGGCCTCCCAGGCCTCCTTGACCCGCGACGGCGGCGGCGATAGCACTGGGCTTGCCAGCATGGTGCAGTACGCCCTCGAGACCTGGAATGCGGACCCGGACAGGATCTTTGTCACCGGCAGCTCCTCCGGCTGCATGATGACCAACGTCATGAGCGCCGCCTACCCCGACCTCTTCGCCGCTGCTTCCTGCTATTCCGGCGTGGCCGCCGGGTGCCTAAAGGGCTCTCCCGGCAGCAGCCCCATCAGCGCCGACCCGACCTGCGCCAACGGCGAGATCAACCTGTCGGCCGAGGAGTGGGCTCAGCGGGCGCGCGACATCTACCCGGGCTACTCGGGTAGCTATCCGCGATTCATGACCCTCCACGGCACGGCGGACTGGCTGGTCCGCATCCCCAACCTGGAGCAGCAGCTGATGCAGTGGTCGACGCTCCACGGGGTCGAGCAGACGGCGAGCAACCCCAACACGCCCCAGAACGGTTATACGCAGCTGGTCTATGGCGATGGCACCCAGCTTGTCGGATACTCGGCCGAAGGTGTTGGCCACACCGTTCCGGTCAACAGCAACCTGGACATGGAGTGGTTCGGCCTGTAA，SEQID:NO.1。[0018] AcfaeB基因或其编码的蛋白在发酵生产头孢菌素C中的应用，AcfaeB基因的核苷酸序列如SEQID:NO.1所示；[0019] AcfaeB基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQID:NO.2所示。[0020] AcfaeB基因或其编码的蛋白在头孢菌素C发酵生产过程中降低去乙酰头孢菌素C副产物产量积累的应用，AcfaeB基因的核苷酸序列如SEQID:NO.1所示；[0021] AcfaeB基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQID:NO.2所示。[0022] 高产头孢菌素C的基因工程菌，所述基因工程菌是通过对产黄枝顶头孢霉的AcfaeB基因进行敲除获得，所述AcfaeB基因的核苷酸序列如序列如SEQID:NO.1所示。[0023] 一种基因工程菌的构建方法，包括如下步骤:[0024] (1)构建AcfaeB靶基因敲除基因编辑载体；[0025] (2)产黄枝顶头孢霉原生质体的制备；[0026] (3)将AcfaeB靶基因敲除基因编辑载体转化到产黄枝顶头孢霉原生质体中；[0027] (4)筛选、验证。[0028] 进一步的，步骤(1)的具体操作为：[0029] (11)选取AcfaeB基因的sgRNA‑N19靶向序列SEQIDNO.5；[0030] 5'‑CTTGCGGTGGTAGCGGTGG‑3'，SEQIDNO.5。[0031] (12)设计AcfaeB基因CRISPR敲除片段ΔAcfaeB*，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；[0032] 5'‑CACATACGACCATACCTAGTGGAAAATACGGGATCCCGTCCGCTCTCCCATAGTCAAGCCGCTAAGGGGCTGATTAGTAGTTGGGTCGGTGACGACCAGCGAATACCGGCTGTTGTATGAAAGGACGAAACACCCTTGCGGTGGTAGCGGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTT‑3'，SEQIDNO.6。[0033] (13)将ΔAcfaeB*连接到pFC332空质粒。[0034] 其中，将丝状真菌pFC332通用基因编辑质粒上gRNAscaffold序列上的靶位点改为基因AcfaeB的靶位点，基因靶位点可以是任何满足以下两点条件的约20nt的DNA序列，该序列在基因组中是特异存在的；靶位点紧邻着PAM(ProtospacerAdjacentMotif，前间区序列邻近基序)区并位于PAM区上游；使用CRISPR/Cas9系统切割靶基因编码区位点，可激活细胞内的DNA修复系统，造成切割位点附近随机插入/缺失若干碱基，如在外显子区域插入/缺失非3的整数倍碱基，将造成该基因移码突变，从而丧失原有功能。[0035] 所述的sgRNA表达框具有启动子‑(N)X‑sgRNA骨架‑终止子结构，所述的靶位点DNA具有5’‑(N)X‑NGG‑3’结构，(N)X表示X个N，N为A、T、C或T任一碱基，X为大于15小于25的自然数。[0036] 上述基因工程菌、上述的构建方法构建的基因工程菌在发酵生产头孢菌素C中的应用。[0037] 进一步的，上述基因工程菌的种子液按照5％～15％的体积比接种于发酵培养基中；优选为按照10％的体积比。[0038] 进一步的，培养温度为本领域常规的培养温度，更佳地为28℃～32℃，优选为30℃。[0039] 进一步的，震荡培养的震荡速度更佳地为200～300rpm，优选地为230rpm。[0040] 进一步的，培养时间更佳地为72～120小时，优选地为110小时。[0041] 进一步的，种子培养基配方如下：葡萄糖5g/L，蔗糖35g/L，玉米浆10mL/L，硫酸铵8g/L，DL‑甲硫氨酸0.5g/L，碳酸钙5g/L，豆油5mL/L。[0042] 进一步的，发酵培养基配方如下：淀粉30g/L，糊精60g/L，α‑淀粉酶0.2g/L，玉米浆10mL/L，DL‑甲硫氨酸6g/L，尿素2g/L，硫酸铵11g/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)3g/L，磷酸氢二钾9g/L，碳酸钙5g/L，豆油5mL/L。[0043] 经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明通过对产黄枝顶头孢霉AcfaeB基因进行敲除，避免了将CPC水解为DCPC，从而提高CPC发酵产量，降低了其副产物DCPC的产量。利用本发明的产黄枝顶头孢霉AcfaeB基因及其编码的蛋白质能够有效促进头孢菌素C的合成速率和产量，具有很好的工业应用前景。附图说明[0044] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。[0045] 图1附图为本发明实施例1中产黄支顶孢霉基因组提取结果，其中，#2：CGMCC3.3795；1：ACJ001；M：Marker；[0046] 图2附图为本发明实施例1中产黄支顶孢霉CGMCC3.3795基因组圈图；[0047] 图3附图为本发明实施例1中产黄支顶孢霉CGMCC3.3795KEGG代谢通路总图；[0048] 图4附图为本发明实施例1中产黄支顶孢霉CGMCC3.3795和ACJ001总RNA电泳检测图，其中，M：Marker；1～2：CGMCC3.3795发酵30h；4～6：CGMCC3.3795发酵60h；7～9：CGMCC3.3795发酵90h；10～12：ACJ001发酵30h；13～15：ACJ001发酵60h；16～18：ACJ001发酵90h；[0049] 图5附图为本发明实施例1中产黄支顶孢霉时序发酵基因表达量差异热图，其中，A1：ACJ001发酵30h；A2：ACJ001发酵60h；A3：ACJ001发酵90h；G1：CGMCC3.3795发酵30h；G2：CGMCC3.3795发酵60h；G3：CGMCC3.3795发酵90h；[0050] 图6附图为本发明实施例1中KFH42174.1基因表达的酶与CPC分子对接后的模拟图；[0051] 图7附图为本发明实施例3中pBARGPE1‑AcfaeB‑OE质粒图谱；[0052] 图8附图为本发明实施例4中pFC332‑ΔAcfaeB质粒图谱；[0053] 图9附图为本发明实施例5中CGMCC3.3795‑AcfaeB‑OE、CGMCC3.3795‑ΔAcfaeB和CGMCC3.3795摇瓶发酵HPLC谱图。具体实施方式[0054] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0055] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。[0056] 实施例1具有头孢菌素C乙酰水解酶活性的酶基因挖掘[0057] (一)产黄支顶孢霉基因组提取[0058] 产黄支顶孢霉基因组提取采用北京索莱宝科技有限公司(中国，北京)Solarbio品牌的真菌基因组提取试剂盒(货号：D2300)进行提取，具体方法依照说明书操作。产黄支顶孢霉CGMCC3.3795(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)和ACJ001(由焦作健康元生物制品有限公司惠赠)基因组提取结果如图1所示。[0059] (二)产黄支顶孢霉基因组测序分析[0060] 产黄支顶孢霉基因组测序工作由广东美格基因科技有限公司完成。测序方法为首先对原始样品进行DNA提取和回收，之后对DNA样品进行质检，然后用检测合格的样品构建文库。本实施例使用基因组评估软件GCE(GenomeCharacteristicsEstimation)(ftp://ftp.genomics.org.cn/pub/gce)，利用k‑mer频数统计评估基因组大小。测序结果表明产黄支顶孢霉基因组约为29Mbp。[0061] 产黄支顶孢霉基因组分析具体流程如下：[0062] (1)琼脂糖凝胶电泳分析DNA的降解程度以及是否有RNA、蛋白质污染。[0063] (2)采用Qubit核酸蛋白定量仪精确定量DNA浓度。[0064] (3)将基因组DNA经26GNeedle片段化，使用BluePippin自动化DNA片段回收系统选择20kb以上的片段，经末端修复和加A尾后，在片段两端分别连接接头，制备DNA文库。[0065] (4)构建好的文库经Qubit浓度定量，文库质检合格后，根据文库的有效浓度及数据产出需求使用Nanopore平台进行测序。[0066] 基因组圈图可以全面展示基因组的特征，如：基因在正义链和反义链上的分布情况、基因的COG功能分类情况、GC含量、基因组岛、同源基因等。将各种信息综合展示在一张基因组圈图中，可以使我们对样品基因组的特征有更全面、更直观的认识。本分析采用Circosv0.69(http://circos.ca/)软件进行基因组圈图的绘制。产黄支顶孢霉CGMCC3.3795基因组测序圈图结果见图2。[0067] (三)产黄支顶孢霉基因组编码基因预测、基因功能注释及代谢通路分析[0068] 真核生物的基因预测相当具有挑战性。在此本实施例使用真核生物编码基因预测软件GeneMark‑ES(GeneMark/gmes_instructions.html)对产黄支顶孢霉基因组测序结果进行基因预测，以下为预测CDS(codingsequences)结果统计。经预测产黄支顶孢霉基因数量约为8901个，总编码基因长度约为13.5Mbp，平均基因长度为1572bp，平均GC含量约为60.3％。[0069] 本实施例利用KEGG(https://www.kegg.jp/)数据库对产黄支顶孢霉进行基因注释和代谢通路分析，并从分子水平了解产黄支顶孢霉新陈代谢、遗传信息加工、环境信息加工、细胞过程、生物体系统等各种代谢通路的集合。产黄支顶孢霉CGMCC3.3795代谢通路总图见图3所示。[0070] (四)产黄支顶孢霉转录组测序分析[0071] 首先对产黄支顶孢霉不同时序的发酵样品进行总RNA提取(如图4所示)，并对提取的RNA进行检测，如总量及纯度等符合要求则进行后续实验，否则需要根据具体原因进行重新提取或对现有RNA进行纯化等。RNA样品检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。随后加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(randomhexamers)合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNApolymeraseI和RNaseH合成二链cDNA，随后利用AMPureXPbeads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA先进行末端修复、加A尾并连接测序接头，再用AMPureXPbeads进行片段大小选择。最后进行PCR扩增，并用AMPureXPbeads纯化PCR产物，得到最终的文库。建好的文库需进行文库质检，对于质检合格的文库将采用Illumina高通量测序平台进行PE150测序，测序得到的原始图像数据文件，经碱基识别(BaseCalling)分析转化为原始测序序列(RawReads)，结果以FASTQ文件格式存储，其中包含测序序列(Reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。[0072] (五)基因组结合转录组对产黄支顶孢霉时序发酵过程中基因表达差异的分析[0073] 基因聚类分析用于判断不同实验条件下基因表达量的聚类模式。通过将表达模式相同或相近的基因聚集成类，从而识别未知基因的功能或已知基因的未知功能，因为这些同类的基因可能具有相似的功能。我们基于基因表达量，对样本和基因间的关系进行层级聚类分析，图中每列代表一个样品，每行代表一个基因，基因在不同样品中的表达量用不同颜色表示，颜色越红表示表达量越高，颜色越蓝表示表达量越低。图5展示了不同时序发酵过程中所有基因表达量的聚类结果。[0074] (六)胞外酯酶分子预测及酶高通量虚拟筛选[0075] 从上述获得的产黄支顶孢霉基因序列中预测获得了8901条蛋白序列。经过序列分析后，得到445个可能的胞外蛋白。具体分析方法如下：[0076] 1、预测信号肽。胞外蛋白一般具有信号肽序列，使用氨基酸序列信号肽在线预测工具Signal‑P5.0预测信号肽(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP‑5.0)。共找到728个具有信号肽序列的蛋白序列。[0077] 2、TMHMM‑2.0预测跨膜序列。具有信号肽的蛋白也可能为外膜蛋白。通过蛋白跨膜结构预测工具TMHMM‑2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM‑2.0)预测跨膜序列来排除跨膜蛋白。排除跨膜蛋白后，剩余494个蛋白序列。[0078] 3、预测GPI序列。一些蛋白通过糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白GPI(glycosylphosphatidylinositol,GPI)序列铆钉到细胞外膜上。经GPI锚定蛋白预测软件big‑PIPredictor(https://mendel.imp.ac.at/gpi/gpi_server.html)预测排除GPI蛋白后，剩余445个蛋白序列。[0079] 4、将上述445个基因与典型酯酶序列在NCBI上进行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)比对分析，提取出最有可能是酯酶的基因30个。典型酯酶序列来源于细菌酯酶家族分类(细菌酯酶家族：classificationoflipolyticenzymesfrombacteria)和脂肪酶酶工程数据库(thelipaseengineeringdatabase：http://www.led.uni‑stuttgart.de/)。[0080] 5、采用分子对接的方式对上述30个疑似酯酶与CPC小分子进行分子模拟对接，若存在某一构象，其催化残基离断键原子距离小于 并且该构象的亲和力值小于‑5kcal/mol，即认为该酶具有潜在的催化头孢菌素C水解活性。结合人工筛选对BLAST结果进行判断排除，比对分析筛选出最有可能是胞外分泌酯酶的22个蛋白基因。[0081] 分子对接具体工作流程如下：[0082] 1)从国际蛋白质数据库RCSBPDB(Brookhaven国家实验室，美国)中搜索“备选酶”的晶体结构pdb.文件。RCSB PDB数据库中不存在结构数据的备选酶，本发明利用AlphaFold2蛋白质结构预测人工智能算法(英国，DeepMind)，根据“备选酶”的序列信息，预测其晶体结构。[0083] 2)从有机小分子生物活性数据PubChem数据库(美国国家生物技术信息中心，美国)中下载头孢菌素C的sdf.分子结构文件。[0084] 3)分子对接：[0085] ①受体准备：使用蛋白可视化软件PyMOL(薛定谔公司)将头孢菌素C的sdf.文件转换为pdb.文件，使用分子模拟软件AutoDockTools(Scripps研究所Olson实验室，美国)将其转换为pdbqt.文件；[0086] ②蛋白准备：使用AutoDockTools准备蛋白分子，包括去除水分子、加氢原子、加电荷，将准备好的蛋白分子存为pdbqt.文件；[0087] ③根据文献的报道，选取对接位点，将其写入para.文件备用；[0088] ④使用分子对接软件AutoDockVina进行分子对接。[0089] 4)检查所有的对接构象结构，若存在某一构象，其催化残基离断键原子距离小于并且该构象的亲和力值小于‑5kcal/mol，即认为该酶具有潜在的催化头孢菌素C水解活性。[0090] 共找到22种可能的酯酶基因。其中本发明中最后筛选得到的基因产物(KFH42174.1基因表达的酶)与CPC分子对接后的模拟图见图6。[0091] 6、对上述22个基因进行载体构建并在毕赤酵母中进行蛋白表达，其中有15个蛋白能够可溶性表达，有3个克隆子表达后的细胞上清液能够将CPC水解为DCPC，其中1个克隆子表达产物具有明显的胞外CPC水解酶活性。[0092] (七)酶异源重组表达体系的构建及诱导表达[0093] 目的基因通过PCR扩增后，连接到毕赤酵母蛋白表达载体pGAPZαA(购自湖南科爱医疗器械有限公司，货号VT1332)上，以构建异源酯酶表达载体。构建好的载体，经测序验证后，提取质粒，线性化后转化毕赤酵母表达菌株KM71H(购自北京百奥来博科技有限公司，货号BTN12‑220y)。[0094] 每个转化的基因分别挑取3个转化子用于表达验证。挑取转化子接入到YPD培养基(酵母提取物1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％；250mL三角瓶，装液量20mL)，30℃振荡培养3天。离心收集上清液，用于后续水解CPC乙酰基团为DCPC能力检测。[0095] (八)酶催化CPC水解为DCPC能力的体外检测[0096] 酶水解CPC能力验证反应体系：1％CPC，100mM磷酸缓冲液pH5.5(终浓度)。具体反应条件：吸取50μL的底物，加入50μL发酵液，25℃反应24h。[0097] 酶解反应体系薄层层析检测结果。薄层层析条件为展层剂：乙醇:乙酸:5％磷酸氢二钠＝6:2:1；280nm波长紫外光照射显色10h。[0098] 可能的具有胞外分泌能力的酯酶家族的候选基因。本发明通过利用毕赤酵母蛋白表达体系对上述酶进行表达，表达的粗酶与底物CPC作用，结果发现3个基因表达产物具有潜在的CPC乙酰水解酶活性，其中编码KFH42174.1基因的酶能够在体外有效地将CPC水解为DCPC，作为具有头孢菌素C乙酰水解酶功能的待选基因进行深入研究，命名为AcfaeB，该基因序列DNA序列如SEQIDNO.1所示，其编码的蛋白序列如SEQIDNO.2所示。[0099] 经过基因组测序后发现该菌株AcfaeB基因序列与NCBI公布的典型菌株ATCC11550公开等位基因ACRE_045940(GenBank：KFH42174.1)完全一致。[0100] 实施例2产黄支顶孢霉原生质体的制备[0101] 将冻存于‑80℃低温冰箱中的产黄支顶孢霉CGMCC3.3795取出并在冰浴上融化，用接种环挑取完全融化后的种子冻存液涂布于事先配制好的试管斜面培养基上，28℃条件下静置活化培养10天。活化培养结束后铲取试管斜面培养基上生长良好的新鲜产黄支顶孢霉菌CGMCC3.3795菌苔，接种至GYM液体培养基中，30℃下160rpm摇床震荡培养48h。然后按每瓶4～6mL的接种量转接至YPS液体培养基中，30℃下160rpm继续培养24h。[0102] 培养结束后，按下述步骤进行操作：(1)用50mL离心管收集YPS培养后的发酵液菌体，8000rpm离心15min后弃去上清；(2)用35mL无菌水洗1次，8000rpm离心15min后弃上清；(3)1mol/L山梨醇缓冲液洗2次，8000rpm离心15min后弃上清，称湿重；(4)每0.1g/mL菌密度加入10mg/mL溶壁酶(美国Sigma，Driselase，货号D9515‑25G)酶解液，30℃下120～160rpm摇床酶解2.5～3.5h；(5)镜检大部分菌丝体开始释放原生质体，加入至少4倍体积的1mol/L山梨醇缓冲剂终止酶解反应，使用擦镜纸过滤酶解液(过滤前先用山梨醇缓冲液润湿)，3500rpm离心15min后弃上清；(6)山梨醇缓冲液10mL清洗1次，沉淀，再以3500rpm离心5min后弃上清；(7)用1mL山梨醇缓冲液吹打混匀，并转移至1.5mL离心管，3500rpm离心4min后弃上清；(8)最后加入250μL山梨醇缓冲液溶解制备好的原生质体，备用。[0103] 试管斜面培养基：麦芽提取物，24.2g/L；麦芽糖，10.0g/L；酵母提取物，1.0g/L；无水乙酸钠，1.0g/L；琼脂粉，22.0g/L。[0104] GYM液体培养基：葡萄糖，4.0g/L；酵母提取物，4.0g/L；麦芽提取物，10.0g/L；碳酸钙2.0g/L；用0.1mol/L的氢氧化钾调节pH＝7.2。[0105] YPS液体培养基：酪蛋白胨，10.0g/L；酵母提取物，5.0g/L；NaCl，10.0g/L；用0.1mol/L的氢氧化钾调节pH＝7.2。[0106] 实施例3产黄支顶孢霉AcfaeB基因过表达载体pBARGPE1‑AcfaeB‑OE及重组菌CGMCC3.3795‑AcfaeB‑OE的构建[0107] (一)AcfaeB基因过表达载体pBARGPE1‑AcfaeB‑OE的构建[0108] 通用型丝状真菌基因过表达质粒pBARGPE1‑Hygro质粒(购自淼灵质粒平台，货号为P0381)DNA序列总计5992bp，含有丝状真菌的AMA1复制起点，gpdA基因启动子，trpC基因终止子，潮霉素抗性基因。本发明设计AcfaeB基因过表达重组片段AcfaeB‑OE的PCR扩增引物序列一对，引物上分别含有限制性内切酶BamHI、ApaI酶切位点。其中上游引物2174‑F序列为(下划线为限制性内切酶ApaI酶切位点)：5'‑GACCGGACGGGGCGGTACCGGGCCCTTACAGGCCGAACCACTCCA‑3'，SEQID:NO.3；下游引物2174‑R序列为(下划线为限制性内切酶BamHI酶切位点)：5'‑CGTCGACCTCGACTCTAGAGGATCCATGGGCAACTTCCGAGTCAC‑3'，SEQID:NO.4。[0109] 以产黄支顶孢霉CGMCC3.3795基因组为模板，以AcfaeB基因过表达重组片段AcfaeB‑OE的PCR扩增引物2174‑F和2174‑R扩增目的基因AcfaeB基因过表达重组片段AcfaeB‑OE，扩增用PCR酶为诺唯赞 MaxMasterMix，扩增体系如下：2×MaxMasterMix，25μL；引物2174‑F，0.1μL；引物2174‑R，0.1μL；gDNA模板，1μL；ddwater，加至50μL。将扩增后得到的AcfaeB基因过表达重组片段AcfaeB‑OE进行纯化回收。[0110] 用限制性内切酶BamHI、ApaI对pBARGPE1‑Hygro环状质粒进行双酶切，具体双酶切体系如下：pBARGPE1‑Hygro质粒，80μL；限制性内切酶BamHI，8μL；限制性内切酶ApaI，8μL；Cutsmartbuffer，20μL；ddwater，加至50μL。双酶切体系置于37℃水浴过夜处理后进行验证及回收，获得下一步所需要的线性化质粒载体pBARGPE1‑Hygro*。[0111] 使用无缝克隆试剂盒2XSeamlessCloningMix(SeamlessCloningKit，上海碧云天生物技术有限公司，货号为D7010S)对AcfaeB基因过表达重组片段AcfaeB‑OE与线性化质粒载体pBARGPE1‑Hygro*进行同源重组，重组体系如下：线性化质粒载体pBARGPE1‑Hygro*，172ng；AcfaeB基因过表达重组片段AcfaeB‑OE，516ng；2XSeamlessCloningMix，4μL；ddH2O，加至20μL。体系混匀后置于50℃水浴孵育15min，然后通过热激转化至E.coliDH5α感受态中，37℃恒温培养过夜，次日挑单菌落扩培进行质粒验证。由电泳结果可知，AcfaeB基因过表达重组片段AcfaeB‑OE经酶连至线性化质粒载体pBARGPE1‑Hygro*上，是为质粒pBARGPE1‑AcfaeB‑OE，该质粒质粒图谱如图7所示。对质粒pBARGPE1‑AcfaeB‑OE进一步进行测序验证，测序结果表明质粒构建结果完全正确。[0112] (二)产黄支顶孢霉AcfaeB基因过表达重组菌CGMCC3.3795‑AcfaeB‑OE的构建[0113] 吸取实施例2中制备得到的产黄支顶孢霉CGMCC3.3795原生质体细胞50μL，加入2μg的pBARGPE1‑AcfaeB‑OE质粒和4μL的1mol/L的氯化钙溶液，然后加入10μL的40％PEG4000温和混合均匀，25℃条件下孵育25min；再加入500μL的40％PEG4000溶液混合均匀，25℃下孵育50min；将孵育好的原生质体与质粒混合体系加入到10mL软琼脂(55℃保温)中混合均匀，从中吸取5mL涂布于再生培养基平板上，待其凝固后28℃倒置培养；培养24h后，覆盖2.5mL含潮霉素(210μg/mL)的软琼脂，28℃密封培养7天；7天后揭去封口膜继续培养13天(全程牛皮纸包裹培养)；培养结束后刮取再生培养基平板上约1/4面积长出的菌苔，加入到装有3～4mL生理盐水的50mL离心管(装有玻璃珠)中，打散均匀，从中吸取1mL菌液均匀涂布斜面复壮培养基平板(含5μg/mL潮霉素)，吹干后28℃下培养8～10天(全程牛皮纸包裹培养)；用扁头牙签挑取斜面复壮培养基平板上长出的单菌涂于斜面培养基平板(含5μg/mL潮霉素)上，涂布面积约为整个平板的1/2，每个平板涂两个单菌落(中间留1cm宽空隙)，然后继续在28℃培养8～10天。本实施例将AcfaeB基因过表达质粒通过原生质体转化导入至产黄支顶孢霉CGMCC3.3795原生质体中，通过潮霉素筛选转化子，挑取能在潮霉素抗性平板上生长的突变菌株作为阳性转化子进行后续的发酵验证。[0114] 实施例4产黄支顶孢霉基因靶向AcfaeB基因编辑载体pFC332‑ΔAcfaeB和基因敲除重组菌CGMCC3.3795‑ΔAcfaeB的构建[0115] (一)靶向AcfaeB基因编辑载体pFC332‑ΔAcfaeB的构建[0116] pFC332质粒DNA序列总计15560bp，含有丝状真菌的AMA1复制起点，gRNAscaffold，Aspergillusnidulanstef1基因启动子，经Aspergillusnidulans密码子优化的Cas9蛋白表达基因，Aspergillusnidulanstef1基因终止子，潮霉素抗性基因。根据Cas9蛋白的PAM(NGG)识别位点规则选取AcfaeB基因的sgRNA‑N19靶向序列：5'‑CTTGCGGTGGTAGCGGTGG‑3'，SEQIDNO.5；PAM位点为TGG。[0117] 设计AcfaeB基因CRISPR敲除片段ΔAcfaeB*(如序列SEQIDNO.6所示)：[0118] 5'‑CACATACGACCATACCTAGTGGAAAATACGGGATCCCGTCCGCTCTCCCATAGTCAAGCCGCTAAGGGGCTGATTAGTAGTTGGGTCGGTGACGACCAGCGAATACCGGCTGTTGTATGAAAGGACGAAACACCCTTGCGGTGGTAGCGGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTT‑3'，SEQIDNO.6。[0119] 该序列从5'端到3'端分别由sgRNA序列启动子(134bp)、sgRNA序列(19bp，带下划线)、tracrRNA序列(76bp)和sgRNA转录终止子(8bp)4个部分组成，全长237bp，由常州基宇生物科技有限公司合成并连接到pFC332空质粒的PacI限制性内切酶酶切位点内，形成pFC332‑ΔAcfaeB基因敲除质粒(如图8所示)。[0120] pFC332‑ΔAcfaeB基因敲除质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布于氨苄青霉素抗性平板，挑取单克隆过夜培养提取质粒保存。[0121] (二)产黄支顶孢霉基因编辑重组菌CGMCC3.3795‑ΔAcfaeB的构建[0122] 吸取实施例2中制备得到的产黄支顶孢霉CGMCC3.3795原生质体细胞50μL，加入2μg的pFC332‑ΔAcfaeB质粒和4μL的1mol/L的氯化钙溶液，然后加入10μL的40％PEG4000温和混合均匀，25℃条件下孵育25min；再加入500μL的40％PEG4000溶液混合均匀，25℃下孵育50min；将孵育好的原生质体与质粒混合体系加入到10mL软琼脂(55℃保温)中混合均匀，从中吸取5mL涂布于再生培养基平板上，待其凝固后28℃倒置培养；培养24h后，覆盖2.5mL含潮霉素(210μg/mL)的软琼脂，28℃密封培养7天；7天后揭去封口膜继续培养13天(全程牛皮纸包裹培养)；培养结束后刮取再生培养基平板上约1/4面积长出的菌苔，加入到装有3～4mL生理盐水的50mL离心管(装有玻璃珠)中，打散均匀，从中吸取1mL菌液均匀涂布斜面复壮培养基平板(含5μg/mL潮霉素)，吹干后28℃下培养8～10天(全程牛皮纸包裹培养)；用扁头牙签挑取斜面复壮培养基平板上长出的单菌涂于斜面培养基平板(含5μg/mL潮霉素)上，涂布面积约为整个平板的1/2，每个平板涂两个单菌落(中间留1cm宽空隙)，然后继续在28℃培养8～10天后，长出的且经测序验证正确的菌株即为CGMCC3.3795‑ΔAcfaeB，进行后续的发酵验证。[0123] (三)产黄支顶孢霉基因编辑结果的验证[0124] 挑取适量上述在斜面复壮培养基上生长良好且待验证的CGMCC3.3795‑ΔAcfaeB菌株菌丝体，利用丝状真菌基因组提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号D2300)提取待测试菌株基因组总DNA。取0.2g石英砂于1.5mL离心管中，加入600uLDNA提取缓冲液；挑取少量正常生长的气生菌丝于上述离心管中，涡旋20～30s，65℃烘箱放置约10min，12000rpm离心10min，取上清到新的EP管中；加入等体积的酚仿溶液，充分震荡混匀使蛋白质变性，12000rpm离心5min(至溶液清澈透明)，取上清到新的EP管中，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液，以及等体积的异丙醇，在‑20℃冰箱放置10min，使DNA沉淀；12000rpm离心5min去除上清，加入1mL无水乙醇，混匀后放置10min，12000rpm离心5min去除乙醇，55℃烘箱放置至彻底去除乙醇；在沉淀中加入适量的无菌水将沉淀充分溶解，所获得的总DNA用于PCR鉴定。[0125] 取若干顶头孢霉菌基因编辑后的单克隆基因组DNA进行PCR鉴定。验证PCR反应鉴定引物为ΔAcfaeB‑F：cgtggagggtcatgaatcgc，SEQID:No.7；ΔAcfaeB‑R：gcagtgtgtgactacaaagcac，SEQID:No.8。PCR扩增体系：2×RapidTaqMasterMix，25μL；引物ΔAcfaeB‑F，0.8μL；引物ΔAcfaeB‑R，0.8μL；基因组DNA，0.1μL；ddH2O，upto20μL。PCR反应条件：预变性，95℃×3min，1次循环；变性，95℃×15s，30次循环；退火，55℃×15s，30次循环；延伸，72℃×12s，30次循环；彻底延伸，72℃×10min，1次循环。[0126] PCR产物琼脂糖凝胶电泳长度约750bp，回收后进行一代测序，与自测产黄支顶孢霉CGMCC3.3795的AcfaeB基因和ATCC1150公开等位基因ACRE_045940(GenBank：KFH44592.1)进行序列比对；若编辑后的基因编码区发生随机的非3的整数倍插入缺失，导致整个基因发生移码突变，该靶基因即被沉默。正确基因敲除突变菌株PCR扩增鉴定测序结果如SEQID:No.9所示。[0127] cgtggagggtcatgaatcgcggatagctacccgagtagcccgggtagatgtcgcgcgcccgctgagcccactcctcggccgacaggttgatctcgccgttggcgcaggtcgggtcggcgctgatggggctgctgccgggagagccctttaggcacccggcggccacgccggaatagcaggaagcagcggcgaagaggtcggggtaggcggcgctcatgacgttggtcatcatgcagccggaggagctgccggtgacaaagatcctgtccgggtccgcattccaggtctcgagggcgtactgcaccatgctggcaagcccagtgctatcgccgccgccgtcgcgggtcaaggaggcctgggaggccacgtcccagcagttcatgtcccggaaggaggacgggaagatggcgatgaaacccttctggtccgcaatcgaagtgtagcctgtctgcccggcatagccaccaccgctaccaccgcaaggatggagagccagaaccacggcagggctctccggggggttggatgggacatagacgtccatggagaggcccgtggggttgttgccgaagttggggatgttttgcagctgggccagtgctgaagagcccagcgtaaggagacctgcaaggctccgtgtgactcggaagttgcccatggtgaggttggcgtcgatgtaaatgcgtttacacagtatgttaaaagggggtgcgtagttgggataacaggtgctttgtagtcacacactgc，SEQID:No.9。[0128] 保留发生正确移码突变的产黄支顶孢霉克隆，即为AcfaeB基因敲除正确的CGMCC3.3795‑ΔAcfaeB菌株，留待进行后续的应用研究和发酵验证。[0129] 实施例5产黄支顶孢霉突变菌株CGMCC3.3795‑AcfaeB‑OE、CGMCC3.3795‑ΔAcfaeB和野生型菌株CGMCC3.3795发酵结果比较研究[0130] 本实施例中均采用规格为500mL的三角瓶进行发酵验证，三角瓶底部带有直挡板，每个实验菌株有5个摇瓶重复。[0131] 从培养10d的斜面培养基上刮取适量产黄枝顶孢霉孢子，以野生型产黄支顶孢霉CGMCC3.3795出发菌株作为对照组，CGMCC3.3795‑ΔAcfaeB菌株为实验组。[0132] 将CGMCC3.3795和CGMCC3.3795‑ΔAcfaeB分别接种于装有30mL种子培养基的500mL摇瓶中，28℃震荡培养3d，转速为230rpm。再以10％(v/v)的接种量转接至装量为30mL发酵培养基的500mL摇瓶中，25℃震荡培养6d，转速为230rpm。[0133] 表1CGMCC3.3795‑AcfaeB‑OE、CGMCC3.3795‑ΔAcfaeB和CGMCC3.3795摇瓶发酵结果[0134]菌株 CPC含量(mg/L) DCPC含量(mg/L)CGMCC3.3795 16645.6±217.3 4347.6±273.2CGMCC3.3795‑AcfaeB‑OE 3364.2±671.2 13823.4±711.4CGMCC3.3795‑ΔAcfaeB 22392.7±276.8 887.8±194.7[0135] 发酵结束后，将发酵液经0.22μm普通滤纸过滤并收集滤液，稀释20倍后进行HPLC检测。HPLC检测器使用的是美国Agilent1260，C18色谱柱，柱温40℃，流动相为甲醇：0.2％(w/v)磷酸二氢钠＝5:95，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，进样量10μL，分析时间9min。根据峰面积和标准品的有效含量计算出样品中CPC、DCPC含量，典型图谱如图9所示。从表1所示的检测结果可知，野生型出发对照菌株CGMCC3.3795的CPC产量为16645.6±217.3mg/L，DCPC产量为4347.6±273.2mg/L；AcfaeB基因过表达突变株CGMCC3.3795‑AcfaeB‑OE的CPC产量为3364.2±671.2mg/mL，DCPC产量为13823.4±711.4mg/L；AcfaeB基因敲除突变株CGMCC3.3795‑ΔAcfaeB的CPC产量为22392.7±276.8mg/mL，DCPC产量为887.8±194.7mg/L。对数据进行统计分析后可知：(1)CGMCC3.3795‑AcfaeB‑OE与野生型对照菌株CGMCC3.3795相比CPC产量显著降低了约79.8％(p<0.01)，而DCPC产量显著增加了217.9％(p<0.01)；(2)CGMCC3.3795‑ΔAcfaeB与野生型对照菌株CGMCC3.3795相比CPC产量显著提高了约34.5％(p<0.01)，而DCPC产量显著降低了79.6％(p<0.01)。上述实验结果充分证明：(1)产黄支顶孢霉AcfaeB基因具有CPC乙酰基水解酶活性，能够水解CPC侧链乙酰基团形成DCPC；(2)利用基因编辑技术敲除产黄支顶孢霉AcfaeB基因，能够显著提升CPC的产量，同时降低主要副产物DCPC的产量。[0136] 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。[0137] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

专利地区：河南

专利申请日期：2022-10-31

专利公开日期：2024-10-11

专利公告号：CN115992111B