一种用于缺氧缓解增强光动力治疗的氧气纳米调节器及其制备方法与应用

专利名称：一种用于缺氧缓解增强光动力治疗的氧气纳米调节器及其制备方法与应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202311310911.X

专利申请（专利权）人：沈阳药科大学
权利人地址：辽宁省本溪市高新技术产业开发区华佗大街26号

专利发明（设计）人：发明人:罗聪,杨馥骏,李术萌,纪庆彧,何仲贵

专利摘要：本发明公开了一种用于缺氧缓解增强光动力治疗的氧气纳米调节器及其制备方法与应用，属于药物制剂联合治疗新辅料和新剂型技术领域。所述氧气纳米调节器由还原敏感的焦脱镁叶绿酸a(PPa)氟化前药(FSSP)、阿托伐醌(ATO)和PEG修饰剂共组装而成，所述FSSP与ATO的摩尔比为20:1‑1:10，FSSP与ATO之和与PEG修饰剂的质量比为10:90‑90:10。本发明所述的氧气纳米调节器具有显著缓解肿瘤缺氧能力以及强效的抗肿瘤活力，并且具有很高的安全性。本发明的共组装纳米制剂为开发药物的递送以及光动化疗的联合应用提供新的策略和更多的选择，满足临床中对高效富氧策略在制剂上的迫切需求。

主权利要求：
1.一种焦脱镁叶绿酸a氟化前药，其特征在于，其结构式为：
2.一种纳米组装体，其特征在于，将权利要求1所述的焦脱镁叶绿酸a氟化前药、阿托伐醌和PEG修饰剂溶解到有机溶剂中，搅拌下，将该溶液滴加到水中，自组装形成粒径均匀的PEG修饰的纳米粒，除去有机溶剂，得到无载体杂化纳米组装体；然后将O2以恒定流量充入所述的无载体杂化纳米组装体中，直至氧饱和，即得；
所述的PEG修饰剂为DSPE‑PEG2k，焦脱镁叶绿酸a氟化前药与阿托伐醌之和与PEG修饰剂的质量比为10:90‑90:10；所述的焦脱镁叶绿酸a氟化前药与阿托伐醌的摩尔比为4:1‑1:2。
3.权利要求2所述的纳米组装体在制备药物递送系统中的应用。
4.权利要求2所述的纳米组装体在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述药物传递系统或抗肿瘤药物的给药形式为注射给药、口服给药或局部给药。 说明书 : 一种用于缺氧缓解增强光动力治疗的氧气纳米调节器及其制
备方法与应用技术领域[0001] 本发明属于药物制剂联合治疗新辅料和新剂型技术领域，具体涉及一种用于缺氧缓解增强光动力治疗的氧气纳米调节器及其制备方法与应用。背景技术[0002] 光动力疗法(photodynamictherapy，PDT)作为一种具有时空选择性和安全性的癌症治疗方式已被广泛研究。在激光照射下，大多数光敏剂以高度依赖氧气的方式产生具有细胞毒性的单线态氧，进而导致肿瘤细胞死亡。然而，恶性实体肿瘤通常具有低氧的微环境，严重限制了氧气依赖型PDT的治疗效果。近年来，人们发现了导致肿瘤缺氧的因素，其中包括肿瘤血管异常、血流波动以及肿瘤组织内氧气扩散不足。此外，与正常细胞相比，具有快速增殖特征的肿瘤细胞通常具有更高的耗氧量，这加剧了实体肿瘤中乏氧的程度。据文献报道，实体肿瘤中的氧气含量低于2.5mmHgpO2，远低于正常组织的40mmHgpO2。缺氧微环境导致肿瘤细胞对PDT、化疗、放疗和免疫治疗产生抗性，进而显著影响其临床抗肿瘤治疗结果。此外，肿瘤的缺氧微环境与临床预后差、肿瘤复发及转移密切相关。特别是，肿瘤缺氧已被广泛认为是氧气依赖型PDT在临床转化中最艰巨的挑战之一。目前迫切需要制定更有效可行的策略来应对肿瘤缺氧引起的治疗耐受和耐药。[0003] 近年来，人们一直致力于通过供氧或抑制细胞耗氧来缓解肿瘤缺氧。其中，全氟化碳(perfluorocarbons，PFCs)由于其良好的生物相容性和溶氧能力，已被广泛用于向肿瘤细胞递送氧气。PFCs良好的溶氧性应归因于其极弱的分子间范德华力以及较低的内聚力，这为溶氧提供了充足的分子空间。此外，PFCs与氧具有非常相似的Hildebrandt参数，这赋予其优异的携氧能力。PFCs的化学惰性特性使其不会与体内的内源性物质发生潜在的相互作用，因此，PFC被认为是静脉注射制剂中合格的候选赋形剂，甚至作为人工血液替代品。更重要的是，有证据表明，PFCs能够显著延长活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)的半衰期，这无疑有利于ROS介导的治疗方式。此外，PFCs通过物理溶解氧气的特性使得氧气在需要时更容易从PFCs中释放出来，这与血红蛋白通过共价结合氧气的情况形成了鲜明对比。尽管如此，基于PFCs的供氧策略的临床转化仍然受到其高度疏水性和PFCs聚合物材料生物相容性差的限制。[0004] 为了应对缺氧条件下有限的氧气供应，细胞通常会下调其耗氧率(oxygenconsumptionrate，OCR)。4T1乳腺癌细胞和CT26结肠癌细胞在缺氧条件下的OCR明显低于其在正常条件下的OCR。值得注意的是，在缺氧条件下，肿瘤细胞在接受外源性供氧后，其OCR急剧增加，这极大地限制了通过供氧缓解肿瘤缺氧的效率。显然，抑制肿瘤细胞耗氧与向肿瘤细胞供氧，对缓解肿瘤缺氧同样重要。近几年来，一些药物因为可以降低OCR来缓解缺氧，进而被用为耗氧抑制剂，其中包括阿托伐醌(atovaquone，ATO)、二甲双胍、他莫昔芬和罂粟碱。其中，二甲双胍是FDA批准的能够降低OCR的药物，但其在药理学上可达到的浓度下，其对OCR的降低效率较低(10‑20％)。相比之下，ATO作为一种更有效的耗氧抑制剂，在多种肿瘤细胞系、细胞肿瘤球以及异种移植肿瘤小鼠模型中可以显著降低OCR(高达80％)。具体来说，ATO可以有效抑制线粒体电子传递链复合体III，进而损害线粒体相关氧化磷酸化(OXPHOS)代谢途径。然而，尽管ATO对氧气消耗具有高效的抑制作用，但其在临床使用中依然存在水溶性低、从血液中快速清除和脱靶毒性的问题。此外，考虑到实体瘤细胞内固有的低氧水平，单独使用ATO缓解肿瘤缺氧的效果并不理想。因此，一个基于供应氧气/抑制耗氧的双向氧气调节策略是非常需要的。发明内容[0005] 基于现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于缺氧缓解增强光动力治疗的氧气纳米调节器及其制备方法与应用。具体来说，本发明通过氟化、响应以及光动力模块进行模块化设计和合成了一种由1H,1H‑全氟己胺和PPa组成的还原敏感前药(FSSP)。更重要的是，FSSP能够在没有任何载体材料的帮助下与ATO共组装形成纳米粒。值得注意的是，与ATO共组装之后，FSSP的携氧效率并未发生改变。经过优化，以FSSP/ATO摩尔比为2:1的最佳比例精确制备了双向氧气纳米调节器(FSSPAO纳米粒)，其载氧能力高达～68mg/L。值得注意的是，FSSP和ATO同时作为载体和药物，赋予了氧气纳米调节器高效的FSSP/ATO共递送特性。氧气纳米调节器中的氟化模块不仅可以促进FSSP和ATO组装，而且可以使该纳米组装体高效地携带氧气。此外，谷胱甘肽(GSH)引发的FSSP中的二硫键断裂会导致氧气纳米调节器解体，这有效缓解了PPa的聚集引起的猝灭(aggregation‑causedquenching，ACQ)困境，并促进了ATO在肿瘤部位特异性释放。正如预期的那样，FSSPAO纳米粒在体外和体内均可以显著缓解肿瘤缺氧微环境以及增强PDT治疗效果。[0006] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：[0007] 第一方面，本发明提供了一种焦脱镁叶绿酸a氟化前药，其结构式为：[0008][0009] 式中，X为肿瘤环境敏感键；R为氟化侧链。[0010] 进一步地，上述技术方案中，所述的肿瘤环境敏感键为pH敏感键或氧化还原环境敏感键，所述的pH敏感键包括腙键、碳酸酯键中的至少一种，所述的氧化还原环境敏感键包括单硫醚键、二硫醚键、二硫键、三硫键或金属蛋白酶敏感键中的至少一种。[0011] 进一步地，上述技术方案中，所述的氟化侧链包括全氟烷基乙醇、全氟己基乙基醇、2,2,3,4,4,4‑六氟‑1‑丁醇、3,3,4,4,5,5,5‑七氟‑1‑戊醇、八氟戊醇、4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8‑十一氟辛烷‑1‑醇、1H,1H,2H,2H‑十三氟‑1‑正辛醇、2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8‑十五氟辛‑1‑醇、1H,1H,2H,2H‑全氟十二烷‑1‑醇1,1,2,2‑四氢全氟十四醇、1.2,2,3,3,4,4,4‑七氟丁胺、1H,1H‑九氟戊胺、1H,1H‑十一氟己胺、1H,1H‑全氟辛基胺、4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11‑十七氟十一胺以及1H,1H,2H,2H‑全氟癸基胺中的一种。[0012] 第二方面，本发明提供了一种焦脱镁叶绿酸a氟化前药的制备方，所述肿瘤环境敏感键为二硫键的焦脱镁叶绿酸a氟化前药的制备方法，包括如下步骤：[0013] (1)二硫代二乙酸、3,3'‑二硫代二丙酸或4,4'‑二硫代二丁酸成酸酐与所述氟化侧链成酯得到中间产物1；[0014] (2)焦脱镁叶绿酸a与乙二醇发生成酯反应得到中间产物2；[0015] (3)中间产物1与中间产物2发生成酯反应，即得。[0016] 第三方面，本发明提供了一种用于缺氧缓解增强光动力治疗的氧气纳米调节器，将所述的焦脱镁叶绿酸a氟化前药、ATO和PEG修饰剂溶解到有机溶剂中，搅拌下，将该溶液滴加到水中，自组装形成粒径均匀的PEG修饰的纳米粒，除去有机溶剂，得到无载体杂化纳米组装体；然后将O2以恒定流量充入所述的无载体杂化纳米组装体中，直至氧饱和，即得。[0017] 进一步地，所述的PEG修饰剂为DSPE‑PEG、TPGS、PCL‑PEG、PLGA‑PEG、PE‑PEG中的一种，PEG的分子量为500‑10000，焦脱镁叶绿酸a氟化前药与ATO之和与PEG修饰剂的质量比为10:90‑90:10。[0018] 进一步地，所述的焦脱镁叶绿酸a氟化前药与ATO的摩尔比为20:1‑1:10。[0019] 进一步地，所述低氧为氧气浓度0Vol％‑5Vol％。[0020] 进一步地，除去有机溶剂的方法包括透析法、溶剂蒸发法、超滤法或膜渗透法。[0021] 优选的，所述PEG修饰剂为DSPE‑PEG2k。[0022] 优选的，有机溶剂为四氢呋喃/乙醇的体积为1:1。[0023] 优选的，焦脱镁叶绿酸a氟化前药和ATO的摩尔比为2:1。[0024] 具体的，本发明提供的用于缺氧缓解增强光动力治疗的氧气纳米调节器的制备方法，包括如下步骤：[0025] 将焦脱镁叶绿酸a氟化前药、ATO和PEG修饰剂溶解到四氢呋喃/乙醇(1:1‑1:5)溶剂中，搅拌下，将该溶液缓缓滴加到水中，自组装形成均匀的PEG修饰的纳米粒，然后除去有机溶剂，得到无载体杂化纳米组装体；然后将O2以恒定流量(5L/min)充入所述的无载体杂化纳米组装体30min，即得。[0026] 第四方明，本发明还提供了氧气纳米调节器在制备药物递送系统中的应用。[0027] 第五方明，本发明还提供了氧气纳米调节器在制备抗肿瘤药物中的应用。[0028] 进一步地，所述药物传递系统或抗肿瘤药物的给药形式包括注射给药、口服给药或局部给药。[0029] 本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：[0030] 1.本发明制备氧气纳米调节器，可用于双向氧气调节以及闭环肿瘤根除，氟化模块不仅可以促进FSSP和ATO组装，而且赋予纳米组装体高效和稳定的氧气负载和传递。此外，与ATO的共组装不仅保持了纳米组件的载氧效率，而且提高了其缓解肿瘤缺氧的效率。[0031] 2.本发明的FSSP和ATO共组装形成的杂化纳米组装体实现了载药量高、稳定性好、毒副作用低等技术效果，满足临床中对高效低毒制剂的迫切需求，为基于氟化前药与耗氧抑制剂的协同联用提供了一个新策略，推动了缺氧缓解用于增强抗癌模式的概念上的进步。附图说明[0032] 为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。[0033] 图1为本发明实施例1的还原敏感的PPa氟化小分子前药(FSSP)的质谱图和1HNMR谱图。[0034] 图2为本发明对比例1‑2的还原敏感的PPa非氟化小分子对照前药(HSSP)与非还原1敏感的PPa氟化小分子对照前药(FCCP)的质谱图和HNMR谱图。[0035] 图3为本发明实施例2的FSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒以及HSSPA纳米粒的马尔文粒径分布图。[0036] 图4为本发明实施例2的FSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒以及HSSPA纳米粒的透射电镜图。[0037] 图5为本发明实施3的FSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒以及HSSPA纳米粒的胶体稳定性图。[0038] 图6为本发明实施例4的FSSP和ATO的分子对接图。[0039] 图7为本发明实施例4的FSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒以及HSSPA纳米粒的分子作用力破坏图。[0040] 图8为本发明实施例4的FSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒以及HSSPA纳米粒的紫外吸收光谱图。[0041] 图9为本发明实施例5的向脱氧水中加入FSSPO纳米粒FSSPAO纳米粒、FCCPAO纳米粒以及HSSPAO纳米粒后氧气浓度发生变化图。[0042] 图10发明实施例6的缓解ACQ效应图。[0043] 图11为本发明实施例6的FSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒、HSSPA纳米、FSSPAO纳米粒、FCCPAO纳米粒以及HSSPAO纳米粒在含1mMDTT的释放介质中，ATO的累积释放量。[0044] 图12为本发明实施例7的不同制剂的4T1与CT26细胞摄取定量图。[0045] 图13为本发明实施例8的不同制剂对4T1与CT26细胞的线粒体损伤图。[0046] 图14为本发明实施例8的不同制剂对4T1与CT26细胞中线粒体复合酶体III的抑制情况。[0047] 图15为本发明实施9的不同制剂处理后4T1与CT26细胞中相对氧气含量。[0048] 图16为本发明实施例10的不同制剂处理后的4T1与CT26细胞在常氧(N)或缺氧(H)条件下HIF‑1α蛋白的免疫荧光图像。[0049] 图17为本发明实施例11的不同制剂处理后的4T1与CT26细胞中常氧或缺氧条件下体外单线态氧产生图。[0050] 图18为本发明实施例12的不同制剂对4T1细胞在常氧或低氧条件下的细胞毒性图。[0051] 图19为本发明实施例12的不同制剂对CT26细胞在常氧或低氧条件下的细胞毒性图。[0052] 图20为本发明实施例13的不同制剂的的血药浓度‑时间曲线图。[0053] 图21为本发明实施例14的PPa溶液剂、FSSPO纳米粒、FSSPA纳米粒、HSSPAO纳米粒、FCCPAO纳米粒以及FSSPAO纳米粒在4，12和24h的组织分布图。[0054] 图22为本发明实施例14的PPa溶液剂、FSSPO纳米粒、FSSPA纳米粒、HSSPAO纳米粒、FCCPAO纳米粒以及FSSPAO纳米粒在4，12，24h的组织分布定量图。[0055] 图23为本发明实施例15的生理盐水、FSSPA纳米粒、FSSPO纳米粒以及FSSPAO纳米粒在0.5、4、8、12和24h的体内氧合血红蛋白的光声信号强度定量结果图。[0056] 图24为本发明实施例16的不同制剂在4T1乳腺癌模型中的肿瘤生长曲线图。I,II,III,IV,V,VI,VII,VIII和IX代表生理盐水，ATO溶液剂，PPa溶液剂/光照，ATO/PPa混合溶液剂/光照，FSSPO纳米粒/光照,FSSPA纳米粒/光照,HSSPAO纳米粒/光照,FCCPAO纳米粒/光照以及FSSPAO纳米粒/光照。[0057] 图25为本发明实施例16的不同制剂在体抗肿瘤实验的4T1乳腺癌模型小鼠肿瘤图像。[0058] 图26为本发明实施例16的不同制剂在体抗肿瘤实验的4T1乳腺癌模型小鼠荷瘤率图。[0059] 图27为本发明实施例16在体抗肿瘤实验的4T1乳腺癌模型小鼠体重图。[0060] 图28为本发明实施例16的不同制剂在CT26结肠癌模型中的肿瘤生长曲线图。I,II,III,IV,V,VI,VII,VIII和IX代表生理盐水，ATO溶液剂，PPa溶液剂/光照，ATO/PPa混合溶液剂/光照，FSSPO纳米粒/光照,FSSPA纳米粒/光照,HSSPAO纳米粒/光照,FCCPAO纳米粒/光照以及FSSPAO纳米粒/光照。[0061] 图29为本发明实施例16的不同制剂在体抗肿瘤实验的CT26结肠癌模型小鼠肿瘤图像。[0062] 图30为本发明实施例16在体抗肿瘤实验的CT26结肠癌模型小鼠体重图。具体实施方式[0063] 下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。[0064] 实施例1：二硫键桥连的PPa氟化小分子前药(FSSP)的合成[0065] 将PPa(1mmol)溶于二氯甲烷中，在冰浴中滴入EDCI(2mmol)、HOBt(2mmol)和DMAP(0.4mmol)溶液，反应2h；然后在室温氮气保护下，将乙二醇(EG，2mmol)加入反应溶液中反应48h。然后，采用制备液相色谱法(纯甲醇为流动相)分离出化学中间体(PPa‑EG)。将1mmol二硫代二乙酸溶解于乙酸酐中，室温下氮气保护反应2h。然后用无水二氯甲烷溶解粗产物，加入0.1mmol的DMAP和0.5mmol的PPa‑EG，室温反应24h，用硅胶柱层析法纯化产物(环己烷/丙酮＝15:1)。将纯化所得产物(1mmol)、EDCI(2mmol)、HOBt(2mmol)溶解于无水二氯甲烷中，然后将1H、1H‑全氟己胺(1mmol)滴入反应溶液中，室温氮气下搅拌48h。最后采用制备液相色谱法(乙腈/水＝95:5为流动相)获得FSSP。[0066] 采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定实施例1中前药的结构，结果如图1所示。核磁共振选用的溶剂为氘代DMSO(C2D6SO)，波谱解析结果如下：[0067] MS(ESI)m/zforC45H44F11N5O6S2[M+H]+:1024.26.1HNMR(400MHz,C2D6SO):δ:9.72(s,10‑meso‑1H),9.45(s,1H,5‑meso‑H),8.89(s,1H,20‑meso‑H),8.26(m,1H,3a‑H),6.20‑6.41(m,2H,3b‑H),5.11‑5.26(dd,2H,13b‑H),4.58(m,1H,18‑H),4.34(dd,1H,17‑H),3.78(q,2H,8a‑CH2),3.66(s,3H,12a‑CH3),3.44(s,3H,2a‑CH3),3.22(s,3H,7a‑CH3),2.66‑2.68(m,2H,17b‑CH2),2.24‑2.45(m,2H,17a‑CH2),1.76(d,3H,18a‑CH3),1.63(t,3H,8b‑CH3).[0068][0069] 对比例1：二碳键桥连的PPa氟化对照前药(FCCP)的合成[0070] 将1mmol己二酸溶解于乙酸酐中，室温下氮气保护反应2h。然后用无水二氯甲烷溶解粗产物，加入0.1mmol的DMAP和0.5mmol的PPa‑EG，室温反应24h，硅胶柱层析纯化产物(环己烷/丙酮＝15:1)。将所得产物(1mmol)、EDCI(2mmol)、HOBt(2mmol)溶解于无水二氯甲烷中，然后将1H、1H‑全氟己胺(1mmol)滴入反应溶液中，室温氮气下搅拌48h。最后采用制备液相色谱法(乙腈/水＝95:5为流动相)获得二碳键桥连的PPa氟化对照前药(FCCP)。[0071] 采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定对比例1中前药的结构，结果如图2所示。核磁共振选用的溶剂为C2D6SO，波谱解析结果如下：[0072] MS(ESI)m/zforC47H49F11N5O6[M+H]+:988.35andC47H48F11N5NaO6[M+Na]+:11010.33.HNMR(400MHz,C2D6SO):δ:9.70(s,10‑meso‑1H),9.42(s,1H,5‑meso‑H),8.88(s,1H,20‑meso‑H),8.20(m,1H,3a‑H),6.19‑6.40(m,2H,3b‑H),5.10‑5.76(dd,2H,13b‑H),4.57(m,1H,18‑H),4.32(dd,1H,17‑H),3.89(q,2H,8a‑CH2),3.45(s,3H,12a‑CH3),3.20(s,3H,2a‑CH3),3.18(s,3H,7a‑CH3),2.65‑2.67(m,2H,17b‑CH2),1.78(d,3H,18a‑CH3),1.64(t,3H,8b‑CH3).[0073] 对比例2：二硫键桥连的非氟化PPa对照前药(HSSP)的合成[0074] 将1mmol二硫代二乙酸溶解于乙酸酐中，室温下氮气保护反应2h。然后用无水二氯甲烷溶解粗产物，加入0.1mmol的DMAP和0.5mmol的PPa‑EG，室温反应24h，硅胶柱层析纯化产物(环己烷/丙酮＝15:1)。将所得产物(1mmol)、EDCI(2mmol)、HOBt(2mmol)溶解于无水二氯甲烷中，然后将正己胺(1mmol)滴入反应溶液中，室温氮气下搅拌48h。最后采用制备液相色谱法(乙腈/水＝95:5为流动相)获得二硫键桥连的非氟化PPa对照前药(HSSP)。[0075] 采用质谱法以及核磁共振氢谱法来确定对比例2中前药的结构，结果如图2所示。核磁共振选用的溶剂为氘代C2D6SO，波谱解析结果如下：[0076] MS(ESI)m/zforC45H56N5O6S2[M+H]+:826.36.1HNMR(400MHz,C2D6SO):δ:9.45(s,10‑meso‑1H),9.19(s,1H,5‑meso‑H),8.68(s,1H,20‑meso‑H),7.95‑8.03(m,1H,3a‑H),5.99‑6.20(m,2H,3b‑H),4.90‑5.00(dd,2H,13b‑H),4.16(m,1H,18‑H),4.14(dd,1H,17‑H),3.98(q,2H,8a‑CH2),3.23(s,3H,12a‑CH3),3.15(s,3H,2a‑CH3),2.98(s,3H,7a‑CH3),2.46‑2.49(m,2H,17b‑CH2),1.83‑2.15(m,2H,17a‑CH2),1.58(d,3H,18a‑CH3),1.43(t,3H,8b‑CH3).[0077] 实施例2：纳米粒的制备[0078] 采用一步纳米沉淀法制备了由FSSP自组装的纳米粒(FSSP纳米粒)。简言之，将5.12mgFSSP和DSPE‑PEG2k(20％，w/w)溶于0.5mL乙醇/四氢呋喃混合物(1∶1，v/v)中，然后在搅拌(1200rpm)下将混合溶液逐滴加入去离子水(5mL)中。然后，在30℃下通过真空旋转蒸发去除有机溶剂。FSSP纳米粒的流体动力学直径由Zetasizer(NanoZS，MalvernCo.，UK)测定。此外，将O2以恒定流量(5L/min)充入所制备的纳米粒30min，即得到相应的氧气饱和的FSSPO纳米粒。[0079] 表1.FSSPA纳米粒的粒径和PDI(n＝3)[0080][0081] 如表1所示，纳米组装体的粒径大约为70nm，FSSP纳米粒具有良好的粒径和PDI。此外，将O2以恒定流量(5L/min)充入所制备的纳米粒30min，即得到相应的氧气饱和的FSSPO纳米粒。[0082] 采用纳米沉淀法制备了由FSSP和ATO组装的双向氧气纳米调节器。简单地说，将5.12mgFSSP和1.84mgATO分别溶解在0.5mL乙醇/四氢呋喃混合物中(1:1，v/v)。为优化制剂，将FSSP与ATO按4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3和1∶4的不同摩尔比例(FSSP/ATO)进行混合，得到FSSP/ATO的混合物。在此基础上，再加入20wt％的DSPE‑PEG2k。然后，将去离子水滴加到混合有机溶液中，在涡旋条件下制备一系列聚乙二醇化的杂化纳米组装体(FSSPA纳米粒)。然后，通过真空旋转蒸发去除纳米体系中的有机溶剂。此外，采用Zetasizer(NanoZS,MalvernCo.，UK)和透射电镜(JEOL100CXII,Japan)分别测定了FSSPA纳米粒的水动力直径和形态。[0083] 表2.不同摩尔比下FSSPA纳米粒的粒径和PDI(n＝3)[0084][0085][0086] 如表2所示，纳米组装体的粒径在90‑210nm之间，当摩尔比为2:1(FSSP/ATO)，FSSPA纳米粒具有良好的粒径和PDI。初步优选FSSP和ATO的摩尔比例为2:1。此外，将O2以恒定流量(5L/min)充入所制备的纳米粒30min，即得到相应的氧气饱和的氧气纳米调节器(FSSPAO纳米粒)。[0087] 在确定2:1的摩尔比(FSSP/ATO)为最佳纳米组装配方后，以相同2:1的摩尔比(PPa前药/ATO)进一步制备FCCPA纳米粒和HSSPA纳米粒。用Zetasizer和透射电镜考察了其粒径与形态。结果见表2与图3‑4。[0088] 表3.纳米组装体的粒径、粒径分布与Zeta电位[0089][0090] 如表3所示，FSSPAO纳米粒的粒径在89nm左右，Zeta电位在‑25mV左右；FSSPA纳米粒的粒径在93nm左右，Zeta电位在‑25mV左右；FCCPA纳米粒的粒径在88nm左右，Zeta电位在‑24mV左右；HSSPA纳米粒的粒径在107nm左右，Zeta电位在‑26mV左右。[0091] 通过透射电子显微镜测定实施例2中制备的FSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒和HSSPA纳米粒的粒径和形态，结果如图3和图4所示，纳米粒的粒径均在90‑110nm左右，且形状为均一的球形。[0092] 实施例3：纳米组装体的胶体稳定性[0093] 将实施例2中制备的FSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒和HSSPA纳米粒在10％FBS的磷酸盐缓冲液中孵育，并且在预定的时间点(0、2、4、6、8和12小时)测定其粒径变化。结果如图5所示，FSSPA纳米粒和FCCPA纳米粒在12h内粒径没有发生明显的变化，均表现出良好的胶体稳定性。这些结果支持前药中的氟化模块可以促进药物的组装。[0094] 实施例4：纳米组装体组装机理分析[0095] 通过紫外光谱扫描实验，初步研究纳米组装体的组装机理。通过计算机模拟，探索FSSPA纳米粒组装的机理，采用殷赋云计算平台的Vina方案完成分子对接计算。结果如图6所示，FSSP和ATO分子之间存在多种作用力，其中包括π‑π堆积、疏水作用力和氢键作用。[0096] 为了验证π‑π堆积作用力，使用酶标仪分别测定PPa溶液剂、FSSPAO纳米粒、FSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒和HSSPA纳米粒的紫外吸收光谱。此外，为了研究组装过程中疏水作用力以及氢键作用，十二烷基硫酸钠(200mM)和尿素(200mM)在37℃条件下孵育FSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒和HSSPA纳米粒30分钟，使用MalvernZetasizer对其粒径进行表征。[0097] 如图7所示，在SDS存在下，所有纳米粒的粒径均急剧增大，表明疏水相互作用在纳米组装中起主导作用。此外，与尿素孵育的纳米粒的平均粒径也比对照组略有增加，这表明氢键的贡献。值得注意的是，与FSSPA纳米粒和FCCPA纳米粒相比，HSSPA纳米粒的粒径变化更大，这表明氢键在驱动HSSP和ATO的共组装中发挥了更重要的作用。如图8所示，与PPa溶液相比，FSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒和HSSPA纳米粒的紫外光谱发生了明显的红移，证实了混合NAs中π‑π堆叠相互作用的存在。这些结果表明，多种相互作用和力协同驱动了PPa前药和ATO的纳米组装。[0098] 实施例5：纳米组装体载氧能力[0099] 以恒流量(5L/min)让纯O2进入30min，得到氧饱和的FSSPAO纳米粒、FCCPAO纳米粒和HSSPAO纳米粒。然后将5mLPBS(pH7.4)、FSSPAO纳米粒、FCCPAO纳米粒、HSSPAO纳米粒(等于2μmol/mL1H,1H‑全氟己胺或己胺)加入15mL脱氧水中。随后，外部超声触发氧气释放，并通过溶解氧仪(WLDO‑300，上海水科学技术有限公司)进一步记录氧气浓度。按下式计算1mL纳米粒(等于2μmol/mL1H,1H‑全氟己胺或己胺)的载氧能力:[0100] 载氧能力＝加入制剂后增加的氧浓度×最终溶液的总体积/纳米粒的体积[0101] 如图9所示，氟化纳米粒(FSSPAO纳米粒和FCCPAO纳米粒)表现出非常相似的绝对载氧能力(～68mg/L)。同时，HSSPAO纳米粒不能像预期的那样携带氧。FSSPAO纳米粒具有出色的携氧能力，通过同时递送氧气和抑制细胞耗氧，充分解决了肿瘤缺氧的挑战。[0102] 实施例6：纳米组装体缓解ACQ效应与药物释放[0103] 为了验证FSSPAO纳米粒和FSSPA纳米粒缓解ACQ效应的能力，将纳米粒(相当于5μg/mLPPa)在含有0、0.5或1mMDTT的介质中于37℃的条件下孵育4h，然后用荧光光谱通过多功能酶标仪(ThermoScientific,USA)对其荧光光谱进行了扫描。激发波长为415nm，发射波长为675nm。此外，为了评估纳米粒的体外释放ATO的行为，将20％的四氢呋喃加入pH7.4的PBS中溶解ATO。将1mL纳米粒(相当于0.5μmol/mLATO)放入透析袋中37℃孵育，透析袋分别浸泡在含有0、0.2、0.5或1mMDTT的30mL释放介质中。在预设时间点，用高效液相色谱法测定ATO的累积释放量。采用C18色谱柱(4.6×150mm,5μm)进行色谱分离。乙腈和乙酸铵(0.02M，pH3)以85:15(v/v)的比例为流动相。流速为1mL/min，ATO的紫外检测波长为254nm。[0104] 结果如图10所示，FSSPAO纳米粒和FSSPA纳米粒在DTT孵育的条件下，荧光光谱得到恢复，证明其具有高效的缓解ACQ的能力。此外，如图11所示，FSSPA纳米粒和HSSPA纳米粒均表现出还原敏感的ATO释放行为。相比之下，在相同条件下，非敏感的FCCPA纳米粒在12小时内释放ATO非常缓慢(不到20％)。值得注意的是，在相同条件下，HSSPA纳米粒的ATO释放速度比FSSPA纳米粒快，这可能是由于非氟化纳米粒的稳定性较差。此外，载氧对纳米粒的释放ATO行为几乎没有影响。[0105] 实施例7：纳米组装体的细胞摄取[0106] 将4T1或CT26细胞以5×104细胞/mL的密度接种到24孔板上，置培养箱中孵育24h使其贴壁，待细胞贴壁后加入制剂(相当于PPa为2.5μg/mL)，孵育1和4小时后，清洗细胞，收集细胞并分散在PBS中，之后通过超声破碎、离心和沉淀蛋白法提取PPa，最后用多功能酶标仪(ThermoScientific,USA)考察摄取情况。[0107] 实验结果如图12所示，PPa溶液剂和纳米粒的摄取呈时间依赖性。此外，载氧纳米粒(HSSPAO纳米粒、FCCPAO纳米粒和FSSPAO纳米粒)和非载氧纳米粒(HSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒和FSSPA纳米粒)的细胞荧光强度几乎没有差异，表明载氧对细胞摄取的影响可以忽略不计。在相同条件下，含有氟化模块的纳米粒(FCCPAO纳米粒、FCCPA纳米粒、FSSPAO纳米粒、FSSPA纳米粒和FSSPO纳米粒)的细胞荧光强度远强于非氟化纳米粒(HSSPAO纳米粒和HSSPA纳米粒)，尤其是在孵育后4h。因此，制备的氟化纳米组装体具有比游离PPa和非氟化纳米组装体更高的细胞摄取效率。[0108] 实施例8：纳米组装体对线粒体的抑制作用[0109] 采用共聚焦显微镜测定细胞线粒体损伤。使用MitoTrackerGreen(Mito‑G)试剂4盒评估纳米粒对线粒体损伤作用。简单地说，4T1或CT26细胞接种于24孔板(5×10 细胞/孔)。孵育过夜后，用PBS、FSSPO纳米粒、ATOSol、HSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒、FSSPA纳米粒、HSSPAO纳米粒、FCCPAO纳米粒和FSSPAO纳米粒(分别等于2μMPPa或1μMATO)培养肿瘤细胞12h。用MitoTrackerGreen(2μM)孵育细胞20min，用CLSM(C2,Nikon,Japan)观察细胞荧光。为了进一步验证ATO介导的线粒体损伤机制，本实施例评估了不同制剂处理的4T1和CT26细6胞线粒体复合物III的活性。简单地说，4T1或CT26细胞在培养皿中以10 个细胞/皿的密度培养。孵育过夜后，分别用PBS、FSSPO纳米粒、ATO溶液剂、HSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒、FSSPA纳米粒、HSSPAO纳米粒、FCCPAO纳米粒和FSSPAO纳米粒(相当于2μM的PPa或1μM的ATO)孵育细胞12h。之后，收集细胞提取线粒体。最后，根据试剂盒指南测定4T1和CT26细胞线粒体复合物III的活性。[0110] 结果如图13所示，在接受无ATO制剂(PBS或FSSPO纳米粒)和非敏感的FCCPAO纳米粒处理的4T1和CT26细胞中观察到明亮的绿色荧光。相比之下，ATO溶液剂、具有还原敏感的HSSPAO纳米粒和FSSPAO纳米粒处理的4T1和CT26细胞的绿色荧光明显减弱，表明线粒体损伤明显。此外，如图14所示，与PBS、FSSPO纳米粒和FCCPAO纳米粒相比，ATO溶液剂、HSSPAO纳米粒和FSSPAO纳米粒显著抑制线粒体复合体III。[0111] 实施例9：纳米组装体抑制耗氧能力[0112] 为了进一步检测抑制细胞耗氧的效率，以106个细胞/皿的密度培养4T1和CT26细胞。孵育过夜后，细胞分别用PBS(pH7.4)、PPa溶液剂、ATO溶液剂、HSSPA纳米粒、FCCPA纳米粒、FSSPA纳米粒、HSSPAO纳米粒、FCCPAO纳米粒和FSSPAO纳米粒(等于2μMPPa或1μMATO)处理12h。然后用液体石蜡密封培养基，避免氧气交换，利用溶氧仪(WLDO‑300，上海水科学技术有限公司)实时记录细胞培养基中的氧气含量。[0113] 如图15所示，用PBS和非敏感FCCPAO纳米粒处理的4T1和CT26细胞中的氧气含量均呈时间依赖性显著下降，说明肿瘤细胞持续耗氧。结果表明，用含ATO的制剂(FSSPAO纳米粒、HSSPAO纳米粒、FSSPA纳米粒、HSSPA纳米粒和ATO溶液剂)处理的细胞在1小时内的相对氧含量仍可以保持在90％左右，这表明ATO溶液剂和还原敏感的纳米粒可以有效抑制肿瘤细胞的氧气消耗。[0114] 实施例10：HIF‑1α的含量[0115] 采用免疫荧光染色法检测不同剂型的4T1和CT26细胞中缺氧诱导因子(HIF‑1α)的表达。简单地说，4T1和CT26细胞分别在常氧或缺氧(5％的氧气浓度)条件下接种于24孔板4(5×10细胞/孔)。孵育过夜后，4T1和CT26细胞分别用PBS、PPa溶液剂、ATO溶液剂、FSSPO纳米粒、FCCPA纳米粒、FSSPA纳米粒、HSSPAO纳米粒、FCCPAO纳米粒和FSSPAO纳米粒(相当于2PPa为200nM)的缺氧环境下培养12h。用660nm激光(20mW/cm)照射含有PPa的制剂组处理的4T1和CT26细胞5min。以常氧环境下PBS处理的细胞作为对照。然后用4％多聚甲醛固定所有肿瘤细胞，用抗HIF‑1α抗体(1:200)在4℃冰箱中孵育12h。随后，在室温下用二抗对细胞进行染色。2h后，用Hoechst33342培养细胞，进行细胞核染色。荧光信号用CLSM(C2,Nikon，Japan)观察。[0116] 如图16所示，常氧条件下PBS处理的4T1和CT26细胞中HIF‑1α表达极低，而缺氧条件下PBS处理的4T1和CT26细胞中HIF‑1α出现了明显的绿色免疫荧光。此外，ATO虽然可以降低耗氧量，但在缺氧条件下，对4T1和CT26细胞内HIF‑1α表达几乎没有影响。其中，不具备载氧能力的HSSPAO纳米粒无法逆转激光照射下HIF‑1α的过表达。相比之下，携带氧能力优异的FSSPO纳米粒和FSSPAO纳米粒在相同条件下均表现出较低的HIF‑1α表达，表明供氧可以有效缓解缺氧。[0117] 实施例11：体外单线态氧检测[0118] 采用DCFH‑DA探针检测不同制剂处理的4T1和CT26细胞的单线态氧生成能力。简单4地说，在常氧或缺氧条件下，以5×10细胞/孔的密度将4T1和CT26细胞接种于24孔板中。培养12h后，用PBS、PPa溶液剂、FSSPO纳米粒、FCCPA纳米粒、FSSPA纳米粒、HSSPAO纳米粒、FCCPAO纳米粒和FSSPAO纳米粒(相当于200nM的PPa)处理细胞，并在常氧或缺氧条件下孵育212h。再用DCFH‑DA探针(20μM)培养细胞30min，然后在660nm(20mW/cm)下照射5min，用倒置显微镜(NikonCorp.，Tokyo，Japan)观察细胞荧光强度。[0119] 如图17所示，PPa溶液剂处理的4T1和CT26细胞在常氧条件下的荧光强度明显强于低氧条件下的荧光强度，表明肿瘤缺氧对单线态氧生成和PDT有不利影响。值得注意的是，即使在缺氧条件下，与无氧纳米粒(FCCPA纳米粒、FSSPA纳米粒和HSSPAO纳米粒)和无ATO纳米粒(FSSPO纳米粒和FCCPAO纳米粒)相比，FSSPAO纳米粒也表现出较高的单线态氧产量，说明FSSPAO纳米粒具有良好的PDT作用。[0120] 实施例12：纳米组装体的细胞毒性[0121] 采用MTT法评价ATO溶液剂和PPa溶液剂的暗毒性。简单地说，将4T1和CT26细胞接3种于96孔板(2×10 细胞/孔)，在常氧或缺氧条件下培养12小时。然后，用含有梯度浓度的ATO溶液剂或PPa溶液剂的新鲜培养基分别在常氧和缺氧环境下培养48h。未处理的细胞作为对照。再加入20μL MTT溶液，静置4h后，用DMSO溶解。在多功能酶标仪(ThermoScientific,USA)上记录490nm处的吸光度。此外，在常氧或缺氧条件下，纳米粒在660nm激2光照射(20mW/cm ，5min)下对4T1和CT26细胞的体外细胞毒性也进行了类似的评估，只是2ATO溶液剂或PPa溶液剂分别被纳米粒取代。培养12h后以660nm激光(20mW/cm，5min)进行光照。[0122] 如图18‑19所示，PPa溶液剂和ATO溶液剂在常氧或缺氧条件下均表现出可忽略不计的暗毒性。在常氧条件下，FSSP纳米粒/光照和FSSPA纳米粒/光照的细胞毒性没有显著差异，而在缺氧条件下，FSSPAO纳米粒/光照的细胞毒性强于FSSPO纳米粒/光照。此外，缺氧条件下FSSPAO纳米粒对4T1和CT26细胞的光动力细胞毒性与常氧条件下的FSSPA纳米粒相当，表明FSSPAO纳米粒能够逆转缺氧阻碍的PDT。此外，在缺氧条件下，FSSPAO纳米粒比PPa溶液剂、HSSPAO纳米粒和FCCPAO纳米粒表现出更强的光动力细胞毒性，这应归因于其良好的胶体稳定性、高效的细胞摄取、充足的氧气供应和缓解ACQ的作用。[0123] 实施例13：纳米组装体的药代动力学[0124] 取体重在180‑220g之间的SD大鼠，随机分组，给药前禁食12h，自由饮水。分别静脉注射PPa溶液剂、FSSPO纳米粒、FSSPA纳米粒、HSSPAO纳米粒、FCCPAO纳米粒和FSSPAO纳米粒(PPa当量为2mg/kg)，在规定的时间点眼眶取血，分离获得血浆。之后通过离心和沉淀蛋白法提取PPa，最后用多功能酶标仪测定PPa的浓度(激发415nm，发射675nm)。[0125] 实验结果如图20所示，由于半衰期短，PPa溶液从血液中清除速度较快。同时，稳定性较差的非氟化HSSPAO纳米粒也表现出不理想的药代动力学行为。而氟化纳米粒(FSSPO纳米粒、FSSPA纳米粒、FCCPAO纳米粒和FSSPAO纳米粒)在延长血液中的滞留时间、提高血浆浓度‑时间曲线(AUC)下的面积方面具有明显优势，为药物在体内肿瘤的蓄积提高了很好基础。[0126] 实施例14：纳米组装体的组织分布[0127] 将4T1细胞接种于BALB/c小鼠，当肿瘤体积达到500mm3左右时，尾静脉注射：PPa溶液剂、FSSPO纳米粒、FSSPA纳米粒、HSSPAO纳米粒、FCCPAO纳米粒和FSSPAO纳米粒(PPa当量为4mg/kg)。给药4、12和24h后，将小鼠处死，分离出主要器官(心，肝，脾，肺，肾)和肿瘤，用活体成像仪进行分析。[0128] 结果如图21‑22所示，这些制剂在4h时表现出相似的体外生物分布。值得注意的是，从4到12h，氟化纳米粒(FSSPA纳米粒、FCCPAO纳米粒和FSSPAO纳米粒)在肿瘤部位的荧光强度逐渐增加。相比之下，PPa溶液剂和HSSPAO纳米粒在相同条件呈下降趋势。值得注意的是，尽管FCCPAO纳米粒具有良好的药代动力学结果，但在相同条件下，FSSPAO纳米粒在肿瘤中表现出比FCCPAO纳米粒更高的荧光强度。FCCPAO纳米粒相对较弱的肿瘤荧光强度可能归因于PPa被困在非还原敏感纳米结构中的ACQ困境。此外，FSSPO纳米粒、FSSPAO纳米粒和FSSPA纳米粒的瘤内荧光强度几乎没有差异，这与药代动力学结果一致。综上所述，氧气纳米调节器(FSSPAO纳米粒)不仅可以显著延长了体循环时间，而且表现出肿瘤特异性的药物积累。[0129] 实施例15：氧合血红蛋白含量考察[0130] 将4T1细胞接种于BALB/c小鼠，当肿瘤体积达到500mm3左右时，尾静脉注射：生理盐水、FSSPA纳米粒、FSSPO纳米粒和FSSPAO纳米粒(1H,1H全氟己胺当量为2.2mg/kg)。在预设的时间点(0.5、4、8、12和24h)，采用光声成像系统(LOIS3DTomoWaveLaboratories，USA)监测小鼠肿瘤内氧合血红蛋白信号强度(1064nm)。[0131] 如图23所示，从0.5到12h，FSSPO纳米粒和FSSPAO纳米粒的小鼠瘤内光声信号逐渐增加，这与组织分布结果高度一致。相比之下，生理盐水和FSSPA纳米粒处理小鼠从0.5到24h的光声信号几乎没有差异。值得注意的是，仅含有ATO的FSSPA纳米粒不能显著增加瘤内氧水平，这可能与实体瘤中低氧含量有关。值得注意的是，在相同条件下，具有闭环缺氧缓解能力的FSSPAO纳米粒在肿瘤中表现出比仅具有供氧功能的FSSPO纳米粒更强的光声信号，特别是在12h时。这与组织分布结果高度相符，并为纳米组装体缓解肿瘤部位缺氧提供条件。[0132] 实施例16：体内抗肿瘤研究[0133] 我们分别在4T1荷瘤BALB/c小鼠和CT26荷瘤BALB/c小鼠中评估了制剂体内抗肿瘤3研究。肿瘤体积约为150mm后，将小鼠随机分为生理盐水组、ATO溶液剂组、PPa溶液剂/光照组、ATO/PPa混合物/光照组、FSSPO纳米粒/光照组、FSSPA纳米粒/光照组、HSSPAO纳米粒/光照组、FCCPAO纳米粒/光照组和FSSPAO纳米粒/光照组(n＝5)，给药剂量为ATO1.4mgkg‑1或PPa4mgkg‑1，每隔1天进行尾静脉注射共5次。根据组织分布结果，PPa溶液剂、PPa/ATO2混合物和HSSPAO纳米粒组在给药4h后进行激光照射5min(660nm、20W/cm)；FSSPO纳米粒、FSSPA纳米粒、FCCPAO纳米粒和FSSPAO纳米粒组在给药后12h进行激光照射5min(660nm、220W/cm)。在整个治疗期间，每天监测和计算小鼠的体重和肿瘤大小。[0134] 如图24‑30所示，ATO溶液剂、PPa溶液剂/光照和ATO/PPa混合物/光照的抗肿瘤活性较差，这应归因于静脉给药后游离药物的药代动力学差。值得注意的是，载氧的FSSPO纳米粒/光照和含有ATO的FSSPO纳米粒/光照仅显示出较弱的抗肿瘤活性，这表明单独的氧气供应或消耗策略在缓解肿瘤缺氧方面都不充分。此外，非敏感的FCCPAO纳米粒/光照也显示出中等的治疗效果，在相同条件下，FSSPAO纳米粒比其他制剂具有明显的治疗优势，在两种荷瘤小鼠模型中显著抗肿瘤。此外，4T1乳腺和CT26结肠荷瘤小鼠治疗后的体重均无显著变化。这些结果表明，这种双向氧纳米调节剂(FSSPAO纳米粒)不仅具有强大的抗肿瘤活性，而且在整个治疗过程中几乎没有全身毒性。[0135] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

专利地区：辽宁

专利申请日期：2023-10-10

专利公开日期：2024-10-15

专利公告号：CN117384172B