一种具有抗氧化活性的中华小苦荬多糖的制备方法及其应用

专利名称：一种具有抗氧化活性的中华小苦荬多糖的制备方法及其应用

专利类型：实用新型专利

专利申请号：CN202310753481.2

专利申请（专利权）人：沈阳药科大学
权利人地址：辽宁省本溪市高新技术产业开发区华佗大街26号

专利发明（设计）人：发明人:李玲芝,李婉萌

专利摘要：一种具有抗氧化活性的中华小苦荬多糖的制备方法及其应用，属于植物多糖的制备方法，制备方法：乙醇回流小苦荬茎叶药材，弃去单糖及小分子化合物后，用热水回流提取药材得到水提液，通过酶解法及Sevage试剂法去除蛋白、AB‑8大孔树脂法除去色素，减压旋蒸后获得粗多糖浸膏，通过DEAE‑52柱色谱进行分离，用蒸馏水、NaCl溶液进行洗脱后得到三个馏分，分别通过Sephadax G‑200进一部纯化得到三种粗多糖，对多糖收率高、纯度高的粗多糖进行结构测定，确定其分子量和单糖成分，此外，经过ABTS及DPPH体外清除自由基测试，显示其具有显著的抗氧化活性，有望成为潜在的天然抗氧化剂。

主权利要求：
1.一种具有抗氧化活性的中华小苦荬多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）取干燥后的中华小苦荬全草粉进行粉碎，过80‑90目筛；
（2）用乙醇回流提取，确保单糖皂苷在内的小分子物质留在醇提液中；
（3）将草取出风干后用蒸馏水回流提取；
（4）将得到的水提液减压蒸馏后配制成80‑100mg/mL的溶液，加入中性蛋白酶搅拌均匀后放入水浴锅进行灭酶处理；
（5）离心后取上清液；
（6）加入上清液体积1/4的Sevage试剂搅拌30‑50min后离心取上清液；
（7）将上清液减压蒸馏后，上样AB‑8大孔树脂进行脱色，用蒸馏水洗脱，用苯酚硫酸法跟踪测定多糖含量；
（8）脱色后的粗多糖溶液减压蒸馏后上样DEAE‑52Cellulose色谱柱，分别使用蒸馏水、0.03MNaCl、0.06MNaCl洗脱得到三种粗多糖，标记为CICP‑1，CICP‑2，CICP‑3；
（9）取量大的CICP‑2经SephadexG‑200柱色谱分离，使用蒸馏水洗脱，并用苯酚硫酸法跟踪记录糖出现的位置并收集；
（10）冻干后得到1个纯多糖ICP‑2。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的中华小苦荬多糖的制备方法，其特征在于，制得的ICP‑2通过高效凝胶渗透色谱测得其分子量为12.3KDa，且是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成的，比例分别为20.1%、14.67%、20.31%、
6.98%、18.04%和19.91%。
3.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的中华小苦荬多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中乙醇回流提取时间为2‑3h，提取次数为2‑3次。
4.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的中华小苦荬多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中蒸馏水在90‑100℃下回流提取时间为2‑3h，提取次数为2‑3次。
5.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的中华小苦荬多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中将水提液减压蒸馏制成80‑100mg/mL的溶液，加入中性蛋白酶搅拌均匀后，先放入50℃恒温水浴锅中0.5‑3h，再放入80‑90℃水浴锅5‑10min进行灭酶处理。
6.一种具有抗氧化活性作用的中华小苦荬多糖，采用权利要求1‑5任一项所述方法制备得到。
7.权利要求6所述的一种具有抗氧化活性作用的中华小苦荬多糖在制备食品中的抗氧化剂的应用。 说明书 : 一种具有抗氧化活性的中华小苦荬多糖的制备方法及其应用技术领域[0001] 本发明属于植物多糖的制备方法，具体涉及从中华小苦荬中提取一种具有抗氧化活性的植物多糖及该多糖在制药及食品领域具有潜在的应用价值。背景技术[0002] 中华小苦荬Ixeriduimchinese(Thunb.)Tzvel.为菊科小苦荬属植物。具有清热解毒、凉血消肿等功效，用于治疗肺痈、乳痈、痢疾肠炎及无名肿痛等多种疾病，同时具有抗炎保肝、抗氧化、抗菌等生物活性，是重要的民间药物，分布于黑龙江、河北、山西、陕西、山东、江苏、安徽、浙江、江西、福建、台湾、河南、四川、贵州、云南、西藏等地。[0003] 多糖类是中药化学成分中普遍存在的一种成分，且许多天然的植物和药物中均含有丰富的多糖，如人参、黄芪、灵芝等，它们都具有强身健体、增强免疫力等作用，而这些药材中的多糖为其发挥功效的重要成分。在对不同中药的化学成分进行分析的过程中，多糖的开发受到人们的广泛关注。目前研究显示中华小苦荬主要含有二萜、黄酮、木脂素、鞣质、有机酸和多糖类。由于植物多糖具有特殊的生物学功能和丰富的来源，且目前关于中华小苦荬的研究基本为其小分子化合物研究，因此，开展对中华小苦荬多糖的提取，纯化、结构表征及其药理活性，对中华小苦荬在食品、工业、药物研究开发等领域具有广阔的开发前景。发明内容[0004] 本发明的目的是提供一种具有抗氧化活性作用的中华小苦荬多糖制备方法，使用热水浸提的方法得到粗多糖水提液。随后经过去蛋白、去色素、减压旋蒸后得浸膏，浸膏经过柱层析分离得到三个粗多糖，进一步纯化后得到一个纯化多糖。[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：[0006] 一种具有抗氧化活性的中华小苦荬粗多糖的制备方法，包括如下步骤：[0007] (1)取干燥后的中华小苦荬全草粉进行粉碎，过80‑90目筛；[0008] (2)用乙醇回流提取，确保单糖皂苷在内的小分子物质留在醇提液中；[0009] (3)将草取出风干后用蒸馏水回流提取；[0010] (4)将得到的水提液减压蒸馏后配制成80‑100mg/mL的溶液，加入中性蛋白酶搅拌均匀后放入水浴锅进行灭酶处理；[0011] (5)离心后取上清液；[0012] (6)加入上清液体积1/4的Sevage试剂(二氯甲烷：正丁醇＝4:1,v/v)搅拌30‑50min后离心取上清液；[0013] (7)将上述上清液减压蒸馏后，上样AB‑8大孔树脂进行脱色，用蒸馏水洗脱，用苯酚硫酸法跟踪测定多糖含量；[0014] (8)脱色后的粗多糖溶液减压蒸馏后上样DEAE‑52Cellulose色谱柱，使用不同浓度的NaCl洗脱得到三种粗多糖，标记为CICP‑1，CICP‑2，CICP‑3；[0015] (9)取量大的CICP‑2经SephadexG‑200柱色谱分离，使用蒸馏水洗脱，并用苯酚硫酸法跟踪记录糖出现的位置并收集；[0016] (10)冻干后得到1个纯多糖ICP‑2。[0017] 制得的ICP‑2通过高效凝胶渗透色谱测得其分子量为12.3KDa，且是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成的，比例分别为20.1％、14.67％、20.31％、6.98％、18.04％和19.91％。[0018] 上述制备方法，其中：[0019] 所述步骤(2)中乙醇回流提取时间为2‑3h，提取次数为2‑3次；[0020] 所述步骤(3)中蒸馏水在90‑100℃下回流提取时间为2‑3h，提取次数为2‑3次；[0021] 所述步骤(4)中将水提液减压蒸馏制成80‑100mg/mL的溶液，加入中性蛋白酶搅拌均匀后，先放入50℃恒温水浴锅中0.5‑3h，再放入80‑90℃水浴锅5‑10min进行灭酶处理；[0022] 所述步骤(8)中NaCl浓度为0.03MNaCl、0.06MNaCl。[0023] 一种具有抗氧化活性作用的中华小苦荬多糖，采用上述方法制备得到。[0024] 所述的一种具有抗氧化活性作用的中华小苦荬多糖，以对DPPH和ABTS自由基的清除作用评价其抗氧化活性，该多糖具有抗氧化活性。因此，能够用于制备食品中的天然抗氧化剂。[0025] 本发明的有益效果：[0026] 本发明的多糖制备步骤简单，所用主要试剂为水、乙醇，以及中性蛋白酶等毒性较低试剂。并且获得多糖纯度高，且具有显著的抗氧化活性。当样品浓度为5mg/mL时，ICP‑2对DPPH自由基的清除效果为54.7％，对ABTS自由基的清除效果为100％。与阳性药Vc清除率(100％)相当。因此，本发明所述的多糖制备工艺绿色环保，应用前景广阔，具有成为天然抗氧化剂的潜力。[0027] 本发明方法工艺过程绿色环保，可保证未来应用在食品领域的安全性。附图说明[0028] 图1为ICP‑2的红外光谱；[0029] 图2为ICP‑2的1HNMR(600MHz,D2O)和13CNMR(150MHz,D2O)图谱；[0030] 图3为ICP‑2的HSQC(600MHz,D2O)图谱；[0031] 图4为ICP‑2的HMBC(600MHz,D2O)图谱；[0032] 图5为ICP‑2的单糖组成测试图；[0033] 图6为ICP‑2清除ABTS自由基的测试图；[0034] 图7为ICP‑2清除DPPH自由基的测试图。具体实施方式[0035] 本发明结合具体实施例作进一步的说明。但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。[0036] 实施例1[0037] 一种具有抗氧化活性的中华小苦荬多糖的制备方法，包括提取、分离、纯化过程，具体操作步骤如下：[0038] (1)取干燥后的中华小苦荬全草粉碎机粉碎，过80‑90目筛；[0039] (2)用90％乙醇回流提取，提取时间为2‑3h，提取次数为3次，确保单糖皂苷等小分子物质留在醇提液中；[0040] (3)将草取出风干后用蒸馏水在90‑100℃下回流加热2‑3h，提取2次；[0041] 将水提液减压蒸馏后去蛋白；去蛋白过程选择酶解法+Sevage试剂的方法联合去蛋白效果最佳。[0042] (4)将水提液减压蒸馏后粗多糖液配制成80mg/mL浓度的溶液，加入2.5％的中性蛋白酶搅拌均匀后放入50℃恒温水浴锅中1‑2h，再放入80‑90℃水浴锅中8min进行灭酶处理；[0043] (5)4000r/min离心后取上清液；[0044] (6)加入上清液体积1/4的Sevage试剂(二氯甲烷：正丁醇＝4:1,v/v)搅拌后离心35min取上清液；[0045] (7)将上述溶液减压蒸馏后，上样AB‑8大孔树脂进行脱色，用蒸馏水洗脱，用苯酚硫酸法跟踪测定多糖含量；[0046] (8)脱色后的粗多糖溶液减压蒸馏后，上样于DEAE‑52Cellulose色谱柱，分别使用蒸馏水、0.03MNaCl、0.06MNaCl洗脱得到三种粗多糖CICP‑1，CICP‑2，CICP‑3；[0047] (9)取CICP‑2洗脱下来的粗多糖经SephadexG‑200色谱柱进行纯化，用苯酚硫酸法跟踪记录多糖出现的流分并收集；[0048] (10)冻干后得到1个新多糖组分ICP‑2。[0049] 对上述制得的多糖ICP‑2进行检测，其红外光谱如图1所示，其余检测包括：[0050] ①单糖组成的测定[0051] 取待水解样品ICP‑220mg于100mL圆底烧瓶中，用少部分水溶解，加入三氟乙酸水解。在110℃油浴锅中反应3‑6h后，冷却至室温，加入无水甲醇多次旋蒸，除去三氟乙酸直至无酸味。取鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖标准糖配置成2mg/mL标准糖母液。取标准糖母液加水配成0.5mg/mL标准糖溶液。各取标准单糖溶液于1.5mLEP管中混合得0.5mg/mL的混标。在标准糖的混标和酸水解后的样品液100μL中加入配制好的0.6MNaOH水溶液，迅速混匀后加入PMP‑甲醇溶液，进行衍生，样品混匀后于80℃水浴中反应80‑100min。冷却至室温后加入0.3MHCl溶液调节pH值至中性。加入等体积氯仿混匀后离心，去除下层溶液，保留上层，重复3‑4次，直至氯仿层无颜色。衍生化后的样品及混标经0.45μm有机滤头进行过滤后，采用高效液相测谱进行分析。[0052] 色谱条件：[0053] 波长：254nm[0054] 流动相：0.05M磷酸盐缓冲液(pH＝6.80)：乙腈＝85:15(V/V)[0055] 柱温：30℃，[0056] 流速：0.8mL/min[0057] 色谱柱：WatersC18(4.6×150mm，5μm)[0058] 检测器：紫外检测器[0059] 进样量：20μL[0060] 将ICP‑2由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，摩尔百分比例为20.1％、14.67％、20.31％、6.98％、18.04％、19.91％。ICP‑2的单糖组成测试如图5所示。[0061] ②小苦荬多糖分子量测定[0062] 精密称取分子量分别为4000Da(T4)、10000Da(T10)、20000Da(T20)、40000Da(T40)、200000Da(T200)、500000Da(T500)的葡聚糖标准品1mg以及样品ICP‑21mg，溶于娃哈哈纯净水中制成5mg/mL的溶液。经0.45μm滤膜过滤后备用。称取一定量的KH2PO4溶解配成浓度为0.02mol/L，并用0.45μm滤膜过滤后超声20min进行示差折光高效液相色谱分析。[0063] 色谱条件：高效液相色谱仪[0064] 检测器：RID‑20A示差折光检测器；[0065] 色谱柱：ATSKgelG5000PWcolumn(I.D.＝7.5mm,L＝300mm)；[0066] 流动相：0.02mol/LKH2PO4；[0067] 柱温：室温[0068] 流速：0.6mL/min；[0069] 进样量：50μL；[0070] 根据T4，T10，T20，T40，T200，T500标准葡聚糖的分子量及其出峰时间可得标准回2归方程为：LgMr＝‑0.5796RT+12.9426(R ＝0.9948)。ICP‑2峰型为对称的尖锐峰型，表明为均质多糖，根据出峰时间带入回归方程中可计算分子量为12.3KDa。[0071] ③NMR谱图分析[0072] 取多糖样品ICP‑2(30mg)装入核磁管中，充分溶解于0.55mL的99.9％重水中，在核磁共振仪上采集分析一维和二维的核磁光谱数据，如图2所示。由ICP‑2的氢信号集中于3.0‑5.5ppm之间，碳信号集中在60‑110ppm之间，是典型的多糖信号。δ1.00‑1.24是鼠李糖甲基的氢信号，C谱中173.48、20.25ppm的碳信号、1.99ppm的氢信号、HSQC谱中的1.99/20.25ppm信号和HMBC谱中的1.99/173.48ppm信号表明ICP‑2中含有乙酰基，C谱中52.89ppm，170.89ppm的信号、H谱中3.73ppm和HMBC中的3.73/170.89ppm表明ICP‑2中有酯基(如图3、图4)。[0073] ④ABTS自由基清除能力[0074] 称量适量ABTS粉末溶于纯净水中得7mmol/LABTS溶液，再制备5mmol/L的K2S2O8溶液，分别取等量以上溶液于EP管中，在室温避光放置12‑16h，形成ABTS+储备液。称取适量ICP‑2于1.5mLEP管中得到10mg/mL的多糖储备液。配制0.005,0.02,0.08,0.3,0.8,2,5mg/mL的样品液。用移液枪移取100μL不同浓度的多糖样品溶液于96孔板中，加100μLABTS避光反应15min，于酶标仪波长734nm处测量吸光度得A1。同时，取100μL不同浓度的样品液和100μL水为样品本底组测得吸光度为A2。空白对照(A0)为100μLABTS和100μL水。每个样品及每个浓度平行做三组实验。清除率R计算公式为：[0075] R％＝[A0‑(A1‑A2)]/A0×100％[0076] 由图7可知，当浓度达到5mg/mL时，ICP‑2对ABTS自由基的清除效果为100％。[0077] ④DPPH自由基清除能力[0078] 称取适量DPPH粉末加入无水乙醇配置成2mmol/L的DPPH储备液。取DPPH储备液1mL于离心管中加入9mL无水乙醇稀释为0.2mmol/LDPPH溶液，锡纸包裹避光冷藏保存。移取100μL不同浓度的多糖样品液于96孔板中加100μLDPPH避光反应30min于酶标仪波长517nm处测量吸光度A1。同时，取100μL不同浓度的样品液和100μL无水乙醇为样品本底组测得吸光度为A2。空白对照(A0)为100μLDPPH和100μL水。每个样品及每个浓度平行做三组实验。清除率R计算公式为：[0079] R％＝[A0‑(A1‑A2)]/A0×100％(公式2)[0080] 由图6可知，当浓度达到5mg/mL时，ICP‑2对DPPH自由基的清除效果为54.7％。DPPH清除效果没有ABTS清除效果明显是因为DPPH粉末为醇溶性，而多糖为水提醇沉提取得来的，在醇溶液中容易析出，故只有部分多糖参与清除自由基反应。[0081] 本发明提供的中华小苦荬多糖的提取方法，制得的小苦荬多糖提取物纯度高并对其进行结构解析及体外抗氧化活性测试。

专利地区：辽宁

专利申请日期：2023-06-26

专利公开日期：2024-10-22

专利公告号：CN116751317B