GhBC1基因及其相关生物材料在调控植物油脂积累中的应用

专利名称：GhBC1基因及其相关生物材料在调控植物油脂积累中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410309136.4

专利申请（专利权）人：安阳工学院
权利人地址：河南省安阳市开发区黄河大道西段

专利发明（设计）人：发明人:崔宇鹏,郭可栋,张欣杰,齐贺,史珍琪,彭星雨

专利摘要：本发明提供了GhBC1基因及其相关生物材料在调控植物油脂积累中的应用，属于生物技术领域。本发明的GhBC1基因或与GhBC1基因相关的生物材料能够调控植物油脂积累，所述GhBC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。GhBC1基因可成功在除棉花之外的植物中过表达，并可调控植物油分含量以及脂肪酸组分的组成，为研究棉花BC参与油脂生物合成的调控机理提供了新的理论基础。

主权利要求：
1.GhBC1基因或与GhBC1基因相关的生物材料在调控植物油脂积累中的应用，其特征在于，所述GhBC1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；
所述调控植物油脂积累的方法为：将GhBC1基因导入植物体内，使GhBC1基因过表达；
所述调控植物油脂积累为调控植物脂肪酸组分水平；
所述植物为棉花、拟南芥；
所述与GhBC1基因相关的生物材料为：A1)GhBC1基因编码的蛋白质；
A2)包含GhBC1基因的重组载体；
A3)包含GhBC1基因的重组微生物；
A4)包含A1)所述蛋白质的重组微生物；
A5)包含A2)所述重组载体的重组微生物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GhBC1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。 说明书 : GhBC1基因及其相关生物材料在调控植物油脂积累中的应用技术领域[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及GhBC1基因及其相关生物材料在调控植物油脂积累中的应用。背景技术[0002] 棉花是重要的经济作物和油料作物。棉籽作为其最主要的副产品在棉花生产中的作用日益凸显。其产量为皮棉产量的1.5～2倍。去壳后的棉仁占种子重量的55％～60％，其中油分含量占30％～40％。棉籽中含有丰富的脂肪酸和蛋白质，被广泛应用于加工食用油、工业原料和生物柴油。一直以来棉花育种研究主要集中在纤维的产量与品质研究方面，而对提高棉籽的研究严重滞后。因此，通过转基因手段研究油分相关基因并提高棉籽油分含量及改良脂肪酸组分有重要意义。[0003] 脂质合成代谢在植物的生长、发育和繁殖中起着重要作用，存在于植物的整个生命过程中。植物油主要存在于植物的种子中，是人类日常生活中食用油的主要来源，在食品、饲料、制药、生物能源等行业中也有广泛的应用。迄今为止，已经从生物体中分离出200多种脂肪酸。脂肪酸是植物细胞的基本成分之一。脂肪酸的从头合成是细胞膜和储存脂质的生物生产所必需的基本过程。乙酰辅酶A(acetyl‑CoA)生产丙二酰辅酶A是脂肪酸生物合成的第一步，随后由丙二酰辅酶A衍生的两个碳单元依次缩合。油脂合成首先需要脂肪酸在质体中合成，转运到胞质中形成脂酰基池，才能用于内质网的油脂合成。油脂合成受脂肪酸产生的限制，反过来，脂肪酸的生物合成受到乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)活性的调控。异质型乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)是各种脂肪酸从头合成的限速酶和关键酶，它由生物素羧化酶(BC)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)以及羧基转移酶(CT)的2个亚基α‑CT和β‑CT组成。其中BC是连接ACCase另外三个亚基的纽带和桥梁。目前，虽然对油脂合成途径有了认知，然而有关棉花BC参与油脂生物合成的调控机理仍知之甚少。发明内容[0004] 本发明的目的在于提供GhBC1基因及其相关生物材料在调控植物油脂积累中的应用。[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：[0006] 本发明提供了GhBC1基因或与GhBC1基因相关的生物材料在调控植物油脂积累中的应用，所述GhBC1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。[0007] 优选的，所述与GhBC1基因相关的生物材料包括：[0008] A1)GhBC1基因编码的蛋白质；[0009] A2)包含GhBC1基因的重组载体；[0010] A3)包含GhBC1基因的重组微生物；[0011] A4)包含A1)所述蛋白质的重组微生物；[0012] A5)包含A2)所述重组载体的重组微生物。[0013] 优选的，所述GhBC1基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。[0014] 优选的，所述调控植物油脂积累的方法为：将GhBC1基因导入植物体内，使GhBC1基因过表达。[0015] 优选的，所述植物包括棉花、拟南芥。[0016] 本发明提供了GhBC1基因及其相关生物材料在调控植物油脂积累中的应用。本发明从陆地棉材料中棉所24中克隆出棉花GhBC1(ID：GH_A02G1009)基因，成功构建种子特异启动子驱动的重组表达载体并转化拟南芥。2个转基因拟南芥T3代株系与野生对照植株相比，表达量显著增加，油份含量分别提高了9.5％和11.4％，脂肪酸组分中C18:1d9+C18:1d11和C20:1d11水平显著增加，而C16:0、C18:0和C18:2水平显著下降。表明，GhBC1基因可成功在除棉花之外的植物中过表达，并可调控植物油分含量以及脂肪酸组分的组成。本发明为研究棉花BC参与油脂生物合成的调控机理提供了新的理论基础。附图说明[0017] 图1为GhBC1基因扩增产物的电泳结果图。[0018] 图2为转基因植物T0代在含卡那霉素MS培养基上的筛选结果。[0019] 图3为转基因植物T1代的PCR筛选结果。其中，泳道1～2为假阳性植株，没有扩增出目的条带，泳道3～8为阳性植株，在795bp附近获得了目的条带，初步证明该基因的种子特异性表达载体转化成功。[0020] 图4为转基因植物不同组织中的GhBC1基因表达量。[0021] 图5为转基因株系OE1、OE2和野生型株系(WT)角果中的GhBC1基因表达量。[0022] 图6为转基因株系OE1、OE2和野生型株系(WT)种子中的油分含量测定结果。[0023] 图7为转基因株系OE1、OE2和野生型株系(WT)种子中的脂肪酸组分分析结果。具体实施方式[0024] 本发明实施例中所用试剂盒和生物材料的来源如下：[0025] 植物总RNA提取试剂盒(DP432)购自天根生化(科技)北京有限公司；RNA反转录试剂盒TransScriptOne‑StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix(AT311‑02)、荧光定量酶TransStartTopGreenqPCRSuperMix(AQ131‑04)、克隆载体pEASY‑T5ZeroCloningKit(CT501‑01)和质粒提取试剂盒EasyPureHiPurePlasmidMiniPrepKit(EM111‑01)购自于北京全式金生物技术有限公司；高保真PCR扩增酶KOD‑Plus‑Neo(KOD‑401)购自TOYOBO生物公司；DNAFragmentPurificationKitver4.0胶回收试剂盒和DNAPurificationKitPCR产物纯化试剂盒均购自TaKaRa生物公司；infusion连接酶购于诺唯赞生物技术有限公司；大肠杆菌感受态菌体DH5α购自上海生工生物工程股份有限公司；农杆菌感受态LBA4404购自北京博迈德基因技术有限公司；限制性内切酶XbaI和SacI均购自NEB公司。[0026] 本发明实施例中所用药品的来源如下：[0027] 琼脂糖购于北京全式金生物技术有限公司；蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯；氨苄青霉素(IA0340)、卡那霉素(YZ‑130556)、利福平(IR0110)，链霉素(IS0360)等购自北京索莱宝科技有限公司。[0028] 本发明实施例中所用仪器的厂家信息如下：[0029] PCR扩增仪(BIO‑RAD)、电泳设备(BIO‑RAD)、荧光定量PCR仪(ABI7500)、凝胶成像系统(BIO‑RAD)、高速离心机(HettichMIKRO200R)、酶标仪(BIO‑TECKC4)、真空冷冻干燥仪(ALPHAI‑5)、种子含油量核磁共振测定仪(NMI20‑Analyst)和岛津脂肪酸成分分析气相色谱仪器(GC‑2030)；拟南芥种子油分测定仪器为纽迈核磁共振仪器(NMI20‑Analyst)。[0030] 本发明实施例中提到的但未列出的各种试剂均按《分子克隆实验指南》第三版上的方法配制，生化试剂为分析纯或以上级。[0031] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0032] 实施例1[0033] 本实施例提供了GhBC1基因的克隆方法，具体过程如下：[0034] 用本地Blast方法从cottonfunctionalgenomicdatabase(https://cottonfgd.org/)中调取GH_A02G1009(GhBC1)基因的CDS全长序列，利用primer5.0软件设计引物序列。采用PCR(PolymeraseChainReaction)技术从陆地棉中棉所24的胚珠中克隆出完整开放阅读框ORF。[0035] 具体克隆过程如下：[0036] 1、试验材料中棉所24种植于安阳工学院试验基地，按一般大田管理。所取组织为开花后3和5天的胚珠，所取材料迅速放入液氮中冷冻，保存于‑80℃冰箱备用。植物总RNA提取采用天根公司试剂盒。[0037] 2、将1000ngRNA反转录为cDNA，将反转录产物cDNA溶液稀释5倍作为PCR反应模板。以提取的各时期棉花胚珠混合总RNA为模板，利用全式金反转录试剂盒将其反转录为cDNA，cDNA合成体系如表1所示。[0038] 表1cDNA合成体系[0039][0040][0041] 备注：先在PCR仪器内42℃温育30min，最后85℃，5s失活。保存4℃备用。[0042] 3、primer5.0软件设计得到的引物序列如下：[0043] GhBC1‑F：5′‑ATGGGTATTTGCTATTGTAG‑3’(SEQIDNO.1)[0044] GhBC1‑R：5′‑CTAAGCAGTTGCACTTGTTAATTC‑3’(SEQIDNO.2)[0045] 采用上述引物以反转录所得到的cDNA为模板对棉花GhBC1基因进行PCR扩增。目的基因扩增体系如表2所示。[0046] 表2目的基因扩增体系[0047]10×PCRBufferforKOD‑PLUS‑Neo 5μlKOD‑Plus‑Neo 1μl模板 2μl正向引物GhBC1‑F(10μM) 2μl反向引物GhBC1‑R(10μM) 2μl2mMdNTPs 5μl25mMMgSO4 3μlddH2O 30μl总体积 50μl[0048] PCR反应条件如表3所示。[0049] 表3PCR反应条件[0050] Step1 Predenature 94℃，2minStep2 Denature 98℃，10sStep3 Annealing 57℃，30sStep4 Estension 68℃，45sStep5 Estension 68℃，5min[0051] 备注：从Step2到Step4进行30次循环扩增。[0052] 4、反应结束后4℃保存，用0.8％的琼脂糖电泳进行检测，得到大小为1647bp的PCR扩增产物，如图1所示。[0053] 5、利用TaKaRaMiniBESTDNAFragmentPurificationKitver4.0进行PCR扩增产物的纯化回收。将回收的产物连接至克隆载体pEASY‑T5克隆载体并转化大肠杆菌感受态DH5α。37℃过夜培养，从kan抗性LB培养基上挑取单克隆到含有kan的500μlLB培养基中37℃摇菌过夜培养。菌液PCR验证，送含有目的基因片段大小条带的菌液测序，测序结果如SEQIDNO.3：[0054] ATGGGTATTTGCTATTGTAGGCATTTTCTGTTTTTCTCAATGGCAATGGATGCTTCACTGACTATGTGCAAATCGGTCACATCACCTCCTGGCTTATTCTTGGGGAGAAGTAGAGTTATTAGGAGTTCCCAGTGTACCTTTATGGTGGGAAGCAGGATCAACTTTCCTAGGCAGAAAGCTCAGTCAACCCAAGTTAAATGTAAATCTAGCAGGTGTGGAGTAGCTCTTGGTGCTAAATGCCGTGCTGAGAAAATTTTGGTGGCAAATAGAGGAGAAATTGCTGTTCGTGTTATCCGAACAGCTCATGAGATGGGAATACCATGTGTTGCTGTTTACTCTACAATTGATAAGGATGCACTTCATGTGAAGCTGGCTGATGAATCAGTTTGCATAGGCGAAGCACCAAGCAGTCAATCGTATTTATTGATTCCAAATGTCCTATCTGCTGCAATTAGCCGTAACTGTACTATGCTTCATCCTGGGTATGGTTTCCTTGCTGAGAATGCGGTTTTTGTAGAAATGTGCAGAGATCACAGGATCAACTTTATTGGGCCTAACCCTGACAGTATTCGTGTTATGGGTGACAAATCAACTGCACGAGAAACAATGAAGAACGCGGGTGTTCCTACTGTTCCGGGAAGTGATGGATTGTTACAGAGTACAGAGGAAGCAATCAAGCTTGCCCATGAGATTGGCTTTCCTGTGATGATCAAGGCCACAGCCGGTGGTGGAGGGCGTGGAATGCGTCTTGCTAAAGAGCCTGATGAGTTTGTGAAGTTACTGCAGCAAGCCAAAAGTGAAGCTGCAGCTGCATTTGGAAATGATGGAGTTTATTTGGAGAAGTACATCCAAAATCCAAGGCACATTGAGTTCCAGGTTCTTGCGGATAAATATGGTAATGTTGTTCACTTTGGTGAGCGAGACTGCAGCATCCAGAGACGTAATCAAAAACTTCTTGAAGAGGCTCCTTCTCCAGCATTGACACCAGAGTTGCGGAAGGCCATGGGTGATGCAGCAGTAGCTGCAGCAGCATCTATTGGTTACATTGGTGTAGGAACTGTTGAGTTCCTATTGGATGAAAGAGGTTCCTTCTACTTCATGGAAATGAACACTAGAATCCAGGTGGAGCATCCTGTAACTGAAATGATTTCCTCTGTTGACTTGATTGAAGAACAAATTCGTGTAGCTATGGGGGAAAAACTGCGCTACAAACAGGAAGATATTGTGCTCAGAGGGCATTCCATTGAATGTCGTATCAATGCAGAAGATGCATTTAAAGGGTTCAGACCCGGACCAGGGAGAATAACATCGTACTTGCCATCTGGAGGCCCATTTGTTCGAATGGATAGCCATGTTTATTCTGATTATGTAGTTCCTCCAAGCTATGATTCATTACTTGGAAAGCTTATTGTATGGGCTCCAACAAGGGAAAAAGCAATTGAGCGCATGAAAAGGGCTCTTGATGACACTGTAATTACAGGGGTTCCTACAACAATTGAATACCATAAACTCATCCTTGATATTGAGGACTTCAGAAACGGAATAGTTGACACTGCTTTCATTCCAAAACATGAAGAAGAGTTGGCAGCACCACAGAAAATGTTAGTAGCAAGCCCAACCAAAGAATTAACAAGTGCAACTGCTTAG。[0055] 目的基因编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQIDNO.4：[0056] MGICYCRHFLFFSMAMDASLTMCKSVTSPPGLFLGRSRVIRSSQCTFMVGSRINFPRQKAQSTQVKCKSSRCGVALGAKCRAEKILVANRGEIAVRVIRTAHEMGIPCVAVYSTIDKDALHVKLADESVCIGEAPSSQSYLLIPNVLSAAISRNCTMLHPGYGFLAENAVFVEMCRDHRINFIGPNPDSIRVMGDKSTARETMKNAGVPTVPGSDGLLQSTEEAIKLAHEIGFPVMIKATAGGGGRGMRLAKEPDEFVKLLQQAKSEAAAAFGNDGVYLEKYIQNPRHIEFQVLADKYGNVVHFGERDCSIQRRNQKLLEEAPSPALTPELRKAMGDAAVAAAASIGYIGVGTVEFLLDERGSFYFMEMNTRIQVEHPVTEMISSVDLIEEQIRVAMGEKLRYKQEDIVLRGHSIECRINAEDAFKGFRPGPGRITSYLPSGGPFVRMDSHVYSDYVVPPSYDSLLGKLIVWAPTREKAIERMKRALDDTVITGVPTTIEYHKLILDIEDFRNGIVDTAFIPKHEEELAAPQKMLVASPTKELTSATA。[0057] 将测序正确的克隆载体命名为pEASY‑GhBC1。[0058] 实施例2[0059] 本实施例提供了一种调控植物油分积累的方法，具体过程如下：[0060] 1、重组表达载体的构建[0061] 1.1选用p2301Mα质粒载体，该质粒载体为本实验室改造并保存，改造过程记载于文献“刘正杰,张园,王彦霞,等.陆地棉异质型ACCase基因的种子特异表达载体构建与遗传转化[J].分子植物育种,2011,93):8.DOI:10.3969/mpb.009.000270.”。该质粒载体的浓度经检测为189ng/μl，琼脂糖凝胶电泳检测，没有蛋白污染，达到试验要求。用限制性内切酶XbaI和SacI酶切植物特异启动子表达载体p2301Mα，回收载体骨架。[0062] 1.2根据p2301Mα质粒载体上的多克隆位点，设计XbaI‑SacI为插入位点，并合成引物。引物序列如下：[0063] GhBC1‑XbaI‑F：5′‑GCTCTAGAATGGGTATTTGCTATTGTAG‑3’(划线部分含有限制性内切酶XbaI的识别序列)(SEQIDNO.5)[0064] GhBC1‑SacI‑R：5′‑CGAGCTCCTAAGCAGTTGCACTTGTTAATTC‑3’(划线部分含有限制性内切酶SacI的识别序列)(SEQIDNO.6)[0065] 使用KOD‑Plus‑Neo高保真酶扩增得到含有XbaI和SacI酶切位点的GhBC1目的基因序列，反应体系如表4所示。[0066] 表4反应体系[0067]25mMMgSO4 3μl10×PCRBufferforKOD‑PLUS‑Neo 5μlKOD‑Plus‑Neo 1μl模板 1μl正向引物GhBC1‑XbaI‑F(10μM) 2μl反向引物GhBC1‑SacI‑R(10μM) 2μl2mMdNTPs 5μlddH2O 31μl总体积 50μl[0068] PCR反应所需条件设置为：94℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸45s，30个循环；68℃延伸5min。回收纯化含XbaI和SacI酶切位点的GhBC1扩增产物，并用限制性内切酶XbaI和SacI酶切该回收产物。[0069] 1.3将1.1回收的载体骨架和1.2酶切后的回收产物连接，构成植物特异启动子表达载体p2301Mα‑GhBC1。将连接产物采用热激法转化大肠杆菌DH5α，37℃培养箱倒置过夜培养，挑阳性克隆测序；将测序结果正确的重组表达载体命名为p2301Mα‑GhBC1/DH5α。[0070] 2、重组微生物的构建[0071] 2.1取100μl冰上融化的农杆菌LBA4404感受态细胞，无菌条件下，向感受态细胞中加入p2301Mα‑GhBC1/DH5α2μg，轻轻混匀，冰水浴中静置5分钟；[0072] 2.2将离心管置于液氮中速冻5分钟；[0073] 2.3然后快速将离心管置于37℃水浴中孵育5分钟，将离心管放回冰水浴中，冰浴5分钟；[0074] 2.4取100μl菌液涂在含有卡那霉素、链霉素和利福平的LB筛选培养基上，28℃培养2.5d，挑选阳性克隆，在LB液体培养基上28℃培养48h，得到重组农杆菌，转移至终浓度在15％甘油中，‑20℃保存备用。[0075] 3、转基因植物的构建[0076] 以哥伦比亚型拟南芥为受体，利用花浸蘸法接种重组农杆菌进行遗传转化，收获T0代转基因种子，在含有卡那霉素(50mg/L)MS培养基上筛选阳性转化子，如图2所示，箭头所指处为阳性转化子，选择阳性转化子培养，获得T1代抗性植株，开花成熟后采集种子。[0077] 待T1代抗性植株移栽40天后，取拟南芥植株叶片提取DNA，PCR扩增抗性标记NPTII，进一步筛选阳性拟南芥植株(抗性标记NPTII基因和目的基因GhBC1均在载体T‑DNA区域，由于拟南芥中BC基因与棉花中BC基因存在同源性，扩增时容易出现假阳性等问题，因此扩增NPTII基因更能够说明GhBC1基因被转化成功)。[0078] 结果见图3。其中，泳道1～2为假阳性植株，没有扩增出目的条带，泳道3～8为阳性植株，在795bp附近获得了目的条带，初步证明该基因的种子特异性表达载体转化成功。[0079] 4、转基因植物中油分含量的测定[0080] 结合图3的测定结果，舍弃假阳性植株，在T1代阳性抗性植株移栽45天后，分别提取T1代抗性植株的角果、叶片与茎的RNA，并合成cDNA，设计特异性引物(GhBC1‑QRT‑F：TCCTTGCTGAGAATGCGGTT(SEQIDNO.7)和GhBC1‑QRT‑R：CCGGAACAGTAGGAACACCC(SEQIDNO.8))，以不同组织部位的cDNA为模板，进行荧光定量PCR，内参引物分别为AtactinqF：CCATGAACCCACCTATAACTCC(SEQIDNO.9)和AtactinqR：TACTCTGCCTTTGCGATCCAC(SEQIDNO.10)。结果见图4。由结果可知，T1转化植株中GhBC1基因只能在角果中有较高的表达量，而在叶片与茎中GhBC1基因表达量很微弱或不表达。说明在拟南芥中转化的GhBC1基因能达到种子特异性表达的效果。[0081] 分别收获T1代单株种子，取100粒种子布在MS+Kan(50mg/L)培养基上，待幼苗子叶完全展开后，统计黄绿苗分离比，并进行卡方检验，将符合绿苗：黄苗＝3:1分离的植株初步预测为单拷贝插入株系，将单拷贝插入株系分别收获种子用于后续分析。[0082] 检测各株系角果中的GhBC1基因表达量，与野生型(WT)进行对比，挑选出表达量较高的2个单拷贝的T3代株系，分别命名为GhBC1OE1和OE2。GhBC1基因表达量如图5所示。每个株系移栽20棵植株，成熟后收获T3代种子提取总脂肪酸，使用纽迈核磁共振仪器(NMI20‑Analyst)，测定2个GhBC1转基因T3代拟南芥株系(OE1、OE2)和野生型拟南芥(WT)的种子油分含量。每个株系油分测定3个重复，取平均值，结果见图6。由结果可知，野生型拟南芥种子的3次平均油分含量为25.89％；而GhBC1转基因T3代OE1的3次平均油分含量为28.40％；GhBC1转基因T3代OE2的3次平均油分含量为28.80％；与对照株相比，GhBC1基因过表达后，其种子平均油分含量增加了9.5％和11.4％，表明GhBC1基因可调控拟南芥种子含油量。[0083] 5、转基因植物中脂肪酸组分的测定[0084] 使用气相色谱仪(GC‑2030,Shimadzu,Japan)分析GhBC1转基因拟南芥种子及对照样品的脂肪酸组分，气相色谱仪配备火焰离子化检测器(FID)和SH‑Rtx‑65毛细管柱(30m×0.25mm×0.50μm)。样品(1μl)，包括脂肪酸和正己烷溶液，在280℃下以30:1的分流模式注入。由Studentt‑test法计算所有脂肪酸组分数据的显著性。p<0.05(*)与对照组比较，差异有统计学意义。结果见图7，由结果可知，与对照相比，GhBC1转基因株系种子中C18:1d9+C18:1d11和C20:1d11水平显著增加，而C16:0、C18:0和C18:2水平显著下降。这些结果表明GhBC1基因过表达可改变种子中脂肪酸组分水平。[0085] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

专利地区：河南

专利申请日期：2024-03-18

专利公开日期：2024-10-22

专利公告号：CN118127042B