一种基于工农业废弃物的土壤改良剂及其制备方法

专利名称：一种基于工农业废弃物的土壤改良剂及其制备方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310515447.1

专利申请（专利权）人：承德市农林科学院
权利人地址：河北省承德市高新区冯营子镇

专利发明（设计）人：张婷,郑然,张玲,张莹莹,李新畅,李海燕,石爱丽,任杰,任美伶

专利摘要：本发明提供了一种基于工农业废弃物的土壤改良剂及其制备方法，包括如下步骤：步骤1，植物促生菌筛选，将获得的固氮菌落点接至有机磷固体培养基和无机磷固体培养基上，置于25℃恒温培养3d，观察各菌株在磷固体培养基上的生长状态及产生透明圈情况，将能够在磷固体培养基上产生透明圈的菌株继续转接至相应的磷固体培养基上。本发明通过将农林废弃物与工业固体废弃物相结合，制备栽培基质和土壤改良剂，一方面可以丰富农林废弃物中营养物质的含量，另一方面还可以弥补工业废弃物中营养元素单一的缺点，通过添加具有固氮溶磷功能的植物促生菌，更好地释放了废弃物中的营养物质和矿质元素，为植物生长提供全面的营养。

主权利要求：
1.一种基于工农业废弃物的土壤改良剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、植物促生菌筛选，样品采集及处理，采集自然发酵腐熟物、林下腐殖质，于密封袋中保存，低温送至实验室备用；称取10g样品装入90mL无菌水中，于恒温振荡培养箱中充‑4 ‑5 ‑6分振荡混匀20min后，取菌悬液进行梯度稀释，稀释浓度为10 、10 、10 ，吸取100μL菌悬液涂布于LB固体培养基上，每个梯度重复三次，置于25℃恒温培养箱中培养3d，挑取不同形态的单菌落进行划线培养，纯化三次以上直至获得纯菌，并进行标号，保存菌种，将获得的单菌落点接在无氮固体培养基置于25℃恒温培养箱中培养3d，观察各菌株生长情况，将能够在无氮培养基上生长的菌株继续转接至无氮固体培养基上，连续转接三次以上，筛选出能够在无氮培养基上稳定生长的菌株，获得固氮菌；促生菌筛选，将获得的固氮菌落点接至有机磷固体培养基和无机磷固体培养基上，置于25℃恒温培养3d，观察各菌株在磷固体培养基上的生长状态及产生透明圈情况，将能够在磷固体培养基上产生透明圈的菌株继续转接至相应的磷固体培养基上，连续转接三次以上，筛选出能够在磷固体培养基上稳定生长且能够产生明显透明圈的菌株，获得溶磷菌；
步骤2、对筛选获得的固氮溶磷菌进行液体发酵培养，取培养完的发酵液进行植物激素的测定，确定促生菌株的促生活性；
步骤3、促生菌促生效果测定，确定各菌株的促生效果；
步骤4、促生菌耐受性测试，挑取获得的促生菌单菌落于LB液体培养基中活化培养18h后，按1%接种量转接至新的LB液体培养基中，振荡培养18h后获得各菌株发酵种子液；制备不同浓度梯度的粉煤灰LB液体培养基，其中，粉煤灰LB液体培养基的浓度梯度分别为0、
10％、20％、30％、40％，高压灭菌冷却后，按1%接种量接种上述发酵种子液，以接种等量无菌水为空白对照，于25℃恒温振荡培养箱中培养48h；培养完成后，取各浓度梯度菌悬液100μL涂布于固体培养基上，每个浓度设置三个平行，25℃倒置培养48h，观察各个固体培养基上菌落生长情况；另外将培养液静置3min，取各浓度梯度培养液上清部分，以接种等量无菌水的空白组做对照，在600nm下测定各处理组OD值，记录各梯度菌株生长情况；
步骤5、促生菌剂制备，将筛选获得的具有固氮和溶磷功能的促生菌株，培养后制备促生菌剂；挑取促生菌单菌落接种至LB液体培养基中，25℃振荡培养20h，按1%接种量转接至新的LB液体培养基中，振荡培养18h后，取发酵液于600nm下测定各菌液OD值，使OD值在08
.6‑0.8之间；用无菌水或缓冲液调整各菌液浓度至10CUF/mL，即为促生菌剂，于4℃冷藏保存，备用；
步骤6、固体废弃物复配，以发酵后的食用菌废菌渣、粉煤灰、蛭石为原料，按不同比例进行混合，混合比例为：①粉煤灰：食用菌废菌渣：蛭石＝2:3:3；②粉煤灰：食用菌废菌渣：蛭石＝3:3:1；③粉煤灰：食用菌废菌渣：蛭石＝4:3:2；加入木醋液调整混合基质pH值至弱酸性或中性，搅拌均匀，静置3‑4h，使混合基质与木醋液充分混合，备用；按1%接种量将上述步骤5中获得的促生菌剂加入混合基质中，搅拌均匀，静置3‑4h使混合基质充分吸附促生菌剂，得到土壤改良剂。 说明书 : 一种基于工农业废弃物的土壤改良剂及其制备方法技术领域[0001] 本发明涉及土壤改良剂技术领域，具体涉及一种基于工农业废弃物的土壤改良剂及其制备方法。背景技术[0002] 植物促生菌能够促进植物生长、提高作物产量，具有诱导植物产生系统抗性来抵御生物和非生物胁迫作用。植物促生菌之所以能够促进植物生长，是因为它们具有固氮、溶磷、解钾、产铁载体以及分泌植物激素等功能，其促生作用主要表现在促进种子萌发、促进植物生长以及提高作物产量和品质等方面。[0003] 随着经济的发展，农业和工业废弃物综合利用问题已成为世界各国普遍需要解决的重大课题。目前对于农业废弃物的利用主要包括废弃物肥料化、能源化、饲料化、基质化和原料化几种方式。其中肥料化利用可以大量、快速的对废弃物资源进行无害化处理，并转化成可利用的优质有机肥源，这是农业废弃物资源化利用的优先选择。工业废弃物的综合利用是可持续发展的必然趋势，但目前对于工业废弃物的综合利用率相对较低，造成了严重的环境污染和资源浪费。[0004] 目前在我国废弃物处理中，大部分是将农林废弃物和工业固体废弃物分开处理。在用作肥料、基质和土壤改良剂的时侯，农林废弃物和工业固体废弃物分别表现出一定的优势，但也存在着不足之处。农林废弃物进行充分发酵后产生的有机质等营养物质较多，但缺少植物生长所需要的矿质元素；工业固体废弃物中含有丰富的矿质元素，但其有机营养成分含量极低，对于工业固体废弃物中的无机营养物质多数以难溶的化合物形式存在，不利于植物吸收利用的问题，通过添加具有固氮溶磷功能的植物促生菌，更好地释放了废弃物中的营养物质和矿质元素，为植物生长提供全面的营养。[0005] 工业固体废弃物中的无机营养物质多数以难溶的化合物形式存在，不利于植物吸收利用。发明内容[0006] 为克服现有技术所存在的缺陷，现提供一种基于工农业废弃物的土壤改良剂及其制备方法，以解决在的问题。[0007] 为实现上述目的，提供一种基于工农业废弃物的土壤改良剂，包括粉煤灰2‑4份、食用菌废菌渣3份、蛭石1‑3份。[0008] 粉煤灰2份、食用菌废菌渣3份、蛭石3份。[0009] 粉煤灰3份、食用菌废菌渣3份、蛭石1份。[0010] 粉煤灰4份、食用菌废菌渣3份、蛭石2份。[0011] 一种基于工农业废弃物的土壤改良剂的制备方法，包括如下步骤：[0012] 步骤1，植物促生菌筛选，将获得的固氮菌落点接至有机磷固体培养基和无机磷固体培养基上，置于25℃恒温培养3d，观察各菌株在磷固体培养基上的生长状态及产生透明圈情况，将能够在磷固体培养基上产生透明圈的菌株继续转接至相应的磷固体培养基上，连续转接三次以上，筛选出能够在磷固体培养基上稳定生长且能够产生明显透明圈的菌株，获得溶磷菌；[0013] 步骤2，对筛选获得的固氮溶磷菌进行液体发酵培养，取培养完的发酵液进行植物激素的测定，确定促生菌株的促生活性；[0014] 步骤3，促生菌促生效果测定，确定各菌株的促生效果；[0015] 步骤4，促生菌耐受性测试，挑取获得的促生菌单菌落于LB液体培养基中活化培养18h后，按1％接种量转接至新的LB液体培养基中，振荡培养18h后获得各菌株发酵种子液，制备培养液，将培养液静置3min，取各浓度梯度培养液上清部分，以接种等量无菌水的空白组做对照，在600nm下测定各处理组OD值，记录各梯度菌株生长情况；[0016] 步骤5，制备促生菌剂，将筛选获得的具有固氮和溶磷功能的促生菌株，培养后制备促生菌剂，于4℃冷藏保存，备用；[0017] 步骤6，固体废弃物复配，以发酵后的食用菌废菌渣、粉煤灰、蛭石为原料，按不同比例进行混合，加入木醋液调整混合基质pH值至弱酸性或中性，搅拌均匀，静置3‑4h，使混合基质与木醋液充分混合，备用，按1％接种量将上述步骤4中获得的促生菌剂按5％的接种量加入混合基质中，搅拌均匀，静置3‑4h使混合基质充分吸附促生菌剂，即获得混合基质。[0018] 步骤1中还包括样品采集及处理，采集自然发酵腐熟物、林下腐殖质等样品，于密封袋中保存，低温送至实验室备用，称取10g样品装入90mL无菌水中，于恒温振荡培养箱中充分振荡混匀20min后，取菌悬液进行梯度稀释，稀释浓度为10‑4、10‑5、10‑6，吸取100μL菌悬液涂布于LB固体培养基上，每个梯度重复三次，置于25℃恒温培养箱中培养3d，挑取不同形态的单菌落进行划线培养，纯化三次以上直至获得纯菌，并进行标号，保存菌种。[0019] 步骤1中还包括将获得的单菌落点接在无氮固体培养基置于25℃恒温培养箱中培养3d，观察各菌株生长情况，将能够在无氮培养基上生长的菌株继续转接至无氮固体培养基上，连续转接三次以上，筛选出能够在无氮培养基上稳定生长的菌株，获得固氮菌。[0020] 步骤3中促生菌促生效果测定，以三色堇、矮牵牛花卉种子为例，采用菌悬液浸种法测定各促生菌对其种子萌发及生根情况的影响，确定各菌株的促生效果。[0021] 步骤4中制备培养液方式为：制备不同浓度梯度的粉煤灰LB液体培养基，粉煤灰LB液体培养基的浓度梯度分别为0、10％、20％、30％、40％，高压灭菌冷却后，按1％接种量接种上述发酵种子液，以接种等量无菌水为空白对照，于25℃恒温振荡培养箱中培养48h，培养完成后，取各浓度梯度菌悬液100μL涂布于固体培养基上，每个浓度设置三个平行，25℃倒置培养48h，观察各个固体培养基上菌落生长情况；[0022] 步骤5中还包括挑取促生菌单菌落接种至LB液体培养基中，25℃振荡培养20h，按1％接种量转接至新的LB液体培养基中，振荡培养18h后，取发酵液于600nm下测定各菌液OD值，使OD值在0.6‑0.8之间，用无菌水或缓冲液调整各菌液浓度至108CUF/mL，即为促生菌剂。[0023] 本发明的有益效果在于：[0024] 1、通过将农林废弃物与工业固体废弃物相结合，制备栽培基质和土壤改良剂，一方面可以丰富农林废弃物中营养物质的含量，另一方面还可以弥补工业废弃物中营养元素单一的缺点。[0025] 2、对于工业固体废弃物中的无机营养物质多数以难溶的化合物形式存在，不利于植物吸收利用的问题，通过添加具有固氮溶磷功能的植物促生菌，更好地释放了废弃物中的营养物质和矿质元素，为植物生长提供全面的营养。附图说明[0026] 图1为本发明固氮溶磷培养基生长情况图。[0027] 图2为本发明F3菌株发酵液IAA检测结果图。[0028] 图3为本发明F5菌株发酵液IAA检测色谱图。[0029] 图4为本发明F6菌株发酵液IAA检测色谱图。[0030] 图5为本发明F3菌株发酵液GA3检测结果图。[0031] 图6为本发明F5菌株发酵液GA3检测结果图。[0032] 图7为本发明F6菌株发酵液GA3检测结果图。[0033] 图8为本发明种子萌发试验结果图。[0034] 图9为本发明粉煤灰耐受性试验结果图。[0035] 图10为本发明F6不同粉煤灰浓度菌株涂布生长情况图。[0036] 图11、图12为本发明幼苗生长情况图。具体实施方式[0037] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。[0038] 参照图1至图12所示，本发明提供了一种基于工农业废弃物的土壤改良剂，包括粉煤灰2‑4份、食用菌废菌渣3份、蛭石1‑3份。[0039] 本实施的粉煤灰2份、食用菌废菌渣3份、蛭石3份。[0040] 本实施的粉煤灰3份、食用菌废菌渣3份、蛭石1份。[0041] 本实施的粉煤灰4份、食用菌废菌渣3份、蛭石2份。[0042] 一种基于工农业废弃物的土壤改良剂的制备方法，包括如下步骤：[0043] 步骤1，植物促生菌筛选，样品采集及处理，采集自然发酵腐熟物、林下腐殖质等样品，于密封袋中保存，低温送至实验室备用。称取10g样品装入90mL无菌水中，于恒温振荡培养箱中充分振荡混匀20min后，取菌悬液进行梯度稀释，稀释浓度为10‑4、10‑5、10‑6，吸取100μL菌悬液涂布于LB固体培养基上，每个梯度重复三次，置于25℃恒温培养箱中培养3d，挑取不同形态的单菌落进行划线培养，纯化三次以上直至获得纯菌，并进行标号，保存菌种，将获得的单菌落点接在无氮固体培养基置于25℃恒温培养箱中培养3d，观察各菌株生长情况，将能够在无氮培养基上生长的菌株继续转接至无氮固体培养基上，连续转接三次以上，筛选出能够在无氮培养基上稳定生长的菌株，获得固氮菌。促生菌筛选，将获得的固氮菌落点接至有机磷固体培养基和无机磷固体培养基上，置于25℃恒温培养3d，观察各菌株在磷固体培养基上的生长状态及产生透明圈情况，将能够在磷固体培养基上产生透明圈的菌株继续转接至相应的磷固体培养基上，连续转接三次以上，筛选出能够在磷固体培养基上稳定生长且能够产生明显透明圈的菌株，获得溶磷菌。[0044] 步骤2，菌株促生活性测定，对筛选获得的固氮溶磷菌进行液体发酵培养，取培养完的发酵液进行植物激素的测定，确定促生菌株的促生活性，生长素吲哚乙酸(IAA)主要由嫩芽、嫩叶和发育中的种子合成，低浓度时能够促进发芽和生根。赤霉素(GA)由嫩芽、幼根和未成熟的种子合成，能够促进种子萌发和细胞伸长。[0045] 步骤3，促生菌促生效果测定，以三色堇、矮牵牛花卉种子为例，采用菌悬液浸种法测定各促生菌对其种子萌发及生根情况的影响，确定各菌株的促生效果。[0046] 步骤4，促生菌耐受性测试，挑取获得的促生菌单菌落于LB液体培养基中活化培养18h后，按1％接种量转接至新的LB液体培养基中，振荡培养18h后获得各菌株发酵种子液。制备不同浓度梯度(0、10％、20％、30％、40％)的粉煤灰LB液体培养基，高压灭菌冷却后，按1％接种量接种上述发酵种子液，以接种等量无菌水为空白对照，于25℃恒温振荡培养箱中培养48h。培养完成后，取各浓度梯度菌悬液100μL涂布于固体培养基上，每个浓度设置三个平行，25℃倒置培养48h，观察各个固体培养基上菌落生长情况。另外将培养液静置3min，取各浓度梯度培养液上清部分，以接种等量无菌水的空白组做对照，在600nm下测定各处理组OD值，记录各梯度菌株生长情况。[0047] 步骤5，促生菌剂制备，将筛选获得的具有固氮和溶磷功能的促生菌株，培养后制备促生菌剂。挑取促生菌单菌落接种至LB液体培养基中，25℃振荡培养20h，按1％接种量转接至新的LB液体培养基中，振荡培养18h后，取发酵液于600nm下测定各菌液OD值，使OD值在0.6‑0.8之间。用无菌水或缓冲液调整各菌液浓度至108CUF/mL，即为促生菌剂，于4℃冷藏保存，备用。[0048] 步骤6，固体废弃物复配，以发酵后的食用菌废菌渣、粉煤灰、蛭石为原料，按不同比例进行混合，混合比例为：①粉煤灰：食用菌废菌渣：蛭石＝2:3:3；②粉煤灰：食用菌废菌渣：蛭石＝3:3:1；③粉煤灰：食用菌废菌渣：蛭石＝4:3:2。加入木醋液调整混合基质pH值至弱酸性或中性，搅拌均匀，静置3‑4h，使混合基质与木醋液充分混合，备用。按1％接种量将上述1.4步骤中获得的促生菌剂按5％的接种量加入混合基质中，搅拌均匀，静置3‑4h使混合基质充分吸附促生菌剂，即获得混合基质，也就是土壤改良剂。[0049] 试验结果：[0050] 促生菌筛选结果：[0051] 共筛选出4株具有固氮溶磷功能的菌株，其中2株具有固氮功能，1株具有溶解无机磷菌功能。在选择培养基上生长情况及透明圈产生情况如图1。确定F3为泛菌Pantoeacoffeiphila，F5为嗜冷假单胞菌Pseudomonaspsychrophila，F6为根瘤菌Rhizobiumpusense。[0052] 菌株促生活性检测结果：[0053] 菌株促生活性检测结果显示(图2‑图7)，菌株均具有不同程度分泌吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA3)的能力。经计算，F3、F5、F6菌株发酵液中IAA含量分别为0.836ng/mL、0.067ng/mL、0.129ng/mL，GA3含量分别为0.018ng/mL、0.034ng/mL、0.022ng/mL。[0054] 促生菌促生效果：[0055] 以不同浓度促生菌菌悬液浸泡处理三色堇及矮牵牛种子，记录种子生根发芽情况，结果见表1。当F3泛菌菌悬液浓度为108CFU/mL时三色堇和矮牵牛种子萌发率均达90％以上。[0056] 表1种子萌发率[0057][0058] 注：F3、F5、F6菌液浓度为1010CFU/mL；‑1、‑2分别表示菌液浓度为109、108CFU/mL。[0059] 注：泛、嗜、根菌液浓度为1010CFU/mL；1、2分别表示菌液浓度为109、108CFU/mL。[0060] 促生菌耐受性测试结果：[0061] 促生菌耐受性测试结果如图9、图10所示，促生菌能够在粉煤灰存在的条件下正常生长，但对于不同浓度梯度表现出不同的生长情况。F3菌株随着粉煤灰添加量增多，呈现出先促进后抑制的生长情况，10％浓度下生长最好，40％浓度下几乎不生长。F5菌株在20％浓度下生长最好，浓度为40％时几乎不生长。F6与对照相比，添加粉煤灰后均表现出抑制作用，且浓度越大抑制效果越明显，但40％浓度时也能生长。涂布培养后结果显示不同浓度粉煤灰对各菌株的影响一致。[0062] 混合基质理化性质：[0063] 测定三种混合基质氮磷钾、钙镁硅和有机质含量，结果见表3。[0064] 表2不同配比养分含量测定结果[0065][0066] 应用效果研究：[0067] 对种子萌发的影响[0068] 以加入促生菌剂的三种复合物作为基质，进行三色堇和矮牵牛播种试验。各处理组发芽情况及幼苗生长情况见表3、表4和图11。三种配比中，配比①中三色堇发芽率相对较高，平均发芽率达89.03％，其中添加F6根瘤菌的处理组，发芽率最高，达96.7％。配比③中矮牵牛发芽率相对较高，平均发芽率达72.06％，其中添加F3泛菌的处理组，发芽率最高为86.7％。三色堇在配比①添加F3泛菌的处理组中根系活力最高，为235.06μg/h/g鲜重，在配比③不添加促生菌的对照组中，叶绿素含量最高，达5.24mg/g鲜重。[0069] 表3矮牵牛种子萌发情况表[0070][0071] 表4三色堇幼苗生长指标测定结果[0072][0073] 对花卉生长的影响，见图11、12。[0074] 本发明中涉及到电路和电子元器件以及模块均为现有技术，本领域技术人员完全可以实现，无需赘言，本发明保护的内容也不涉及对于内部结构和方法的改进。[0075] 需要说明的是，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。[0076] 以上结合附图实施例对本发明进行了详细说明，本领域中普通技术人员可根据上述说明对本发明做出种种变化例。因而，实施例中的某些细节不应构成对本发明的限定，本发明将以所附权利要求书界定的范围作为保护范围。

专利地区：河北

专利申请日期：2023-05-09

专利公开日期：2024-11-05

专利公告号：CN116573974B