含青蒿素类衍生物的组合物及在制备治疗白血病药物中的应用

专利名称：含青蒿素类衍生物的组合物及在制备治疗白血病药物中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202210085636.5

专利申请（专利权）人：沈阳药科大学
权利人地址：辽宁省本溪市高新技术产业开发区华佗大街26号

专利发明（设计）人：景永奎,张静仪,王悦桐,张真玮,赵临襄

专利摘要：本发明属于生物医药领域，具体涉及含青蒿素类衍生物的组合物及在制备治疗白血病药物中的应用。本发明的组合物为A组分、B组分和C组分按8‑40:1‑2:1‑80比例混合；其中，A组分为青蒿琥酯及其类似物中的一种或几种；类似物可为青蒿素、二氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚等；B组分为venetoclax及其类似物中的一种或几种；类似物可为navitoclax等；C组分为阿糖胞苷及其类似物中的一种或几种；类似物可为阿扎胞苷、地西他滨、吉西他滨等；本发明克服了现有技术青蒿琥酯与阿糖胞苷联用方案和venetoclax与阿糖胞苷联用方案由于其他抗凋亡蛋白反馈性上调产生的耐药，显著改善了venetoclax与阿糖胞苷联合方案对AML的治疗效果。

主权利要求：
1.一种含青蒿素类衍生物的组合物，其特征在于，组合物为A组分、B组分和C组分按8‑
40:1‑2:1‑80比例混合；其中，所述A组分为青蒿琥酯；所述B组分为venetoclax；所述C组分为阿糖胞苷。
2.一种权利要求1所述的含青蒿素类衍生物的组合物的应用，其特征在于：所述组合物在制备治疗急性髓细胞性白血病药物中的应用；
所述急性髓细胞性白血病为THP‑1或MOLM‑13细胞。
3.根据权利要求2所述的含青蒿素类衍生物的组合物的应用，其特征在于：所述组合物通过诱导Noxa降低Mcl‑1协同诱导白血病细胞凋亡，增强DNA损伤制备治疗急性髓细胞性白血病药物中的应用。
4.一种权利要求1所述的含青蒿素类衍生物的组合物的制剂，其特征在于：所述制剂活性成分以及药物上接受的载体混合，其中，活性成分为权利要求1所述的组合物，活性成分占制剂质量的0.01‑99％。
5.根据权利要求4所述的含青蒿素类衍生物的组合物的制剂，其特征在于：所述制剂剂型为片剂、胶囊、颗粒。
6.根据权利要求5所述的含青蒿素类衍生物的组合物的制剂，其特征在于所述制剂为将组合物中各组分混合后与药物上可接受到的载体混合制备制剂，或将组合物中各组分分别与药物上可接受到的载体制备制剂而后混合。 说明书 : 含青蒿素类衍生物的组合物及在制备治疗白血病药物中的
应用技术领域[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种含青蒿琥酯与venetoclax和阿糖胞苷的药物组合物及在制备治疗急性髓细胞性白血病药物中的应用。背景技术[0002] 急性髓性白血病(AML)是最具侵袭性的血液系统恶性肿瘤之一，老年AML患者主要采用去甲基化药物(HMAS)或低剂量阿糖胞苷(LDAC)进行治疗，患者预后极差，5年总体生存率不超过10％。针对年轻的AML患者则一直沿用40年前的“7+3”(柔红霉素+阿糖胞苷)诱导方案进行治疗，该治疗方案的缓解率在30‑80％之间，但由于复发原因，长期生存率和治愈率较低，治疗效果需要改善。[0003] 凋亡阻滞为AML的共同特征，抗凋亡蛋白Bcl‑2和Mcl‑1的异常表达提高了AML细胞的凋亡阈值，是AML发病和药物耐受的主要原因之一，Venetoclax是目前唯一被批准用于CLL和AML治疗的Bcl‑2家族抗凋亡蛋白小分子抑制剂，但单独应用在AML中的作用有限，临床研究中发现venetoclax改善了阿扎胞苷、地西他滨或低剂量阿糖胞苷对AML的治疗效果，该联合方案于2018年获批用于治疗老年不适宜强化治疗的AML患者，但该联合方案相比于阿糖胞苷单独用药，患者的中位生存期仅延长了4个月，最终由于耐药的出现导致治疗失败，治疗效果仍需进一步改善。[0004] 抗凋亡蛋白Mcl‑1被认为是介导venetoclax耐受的主要原因，Venetoclax通过抑制Bcl‑2释放Bim诱导细胞发生凋亡，但释放的Bim被Mcl‑1扣押导致venetoclax的耐受。Mcl‑1也可以转移到细胞核中与染色质结合来减少DNA损伤，并诱导p‑Chk1启动DNA损伤修复，Mcl‑1也参与阿糖胞苷的耐受过程。靶向抑制Mcl‑1有望改善venetoclax与阿糖胞苷联合方案对AML的治疗效果。细胞内Mcl‑1蛋白水平受Noxa和Bim调控，Noxa能够置换出Mcl‑1中的Bim并诱导Mcl‑1发生降解，提示诱导Noxa的药物可能通过降低Mcl‑1的蛋白水平靶向抑制Mcl‑1，增强venetoclax与阿糖胞苷联用治疗效果。[0005] 目前我国研究人员已总结出了青蒿琥酯与阿糖胞苷联用方案，同时临床已批准了venetoclax与阿糖胞苷联用方案，但这两种方案均由于其他抗凋亡蛋白的反馈性上调产生耐药，对AML的治疗效果有限。发明内容[0006] 为了克服现有的技术缺陷，本发明提供了一种含青蒿琥酯与venetoclax和阿糖胞苷的药物组合物及在制备治疗急性髓细胞性白血病药物中的应用。进一步的说组合物中青蒿琥酯通过诱导Noxa，与venetoclax联合协同诱导凋亡，降低Mcl‑1蛋白，克服Mcl‑1介导的阿糖胞苷耐受，增强阿糖胞苷诱导的DNA损伤作用，三种药物组合物能够诱导急性髓细胞白血病细胞凋亡及DNA损伤，改善venetoclax与阿糖胞苷联合方案对AML的治疗现状。[0007] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：[0008] 一种含青蒿素类衍生物的组合物，组合物为A组分、B组分和C组分按8‑40:1‑2:1‑80比例混合；其中，[0009] 所述A组分为青蒿琥酯及其类似物中的一种或几种；类似物可为青蒿素、二氢青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚等；[0010] 所述B组分为venetoclax及其类似物中的一种或几种；类似物可为navitoclax等；[0011] 所述C组分为阿糖胞苷及其类似物中的一种或几种；类似物可为阿扎胞苷、地西他滨、吉西他滨等；[0012] 优选，所述A组分为青蒿琥酯；所述B组分为venetoclax；所述C组分为阿糖胞苷。[0013] 青蒿琥酯结构式如Ⅰ所示。[0014][0015] Bcl‑2抑制剂venetoclax为式Ⅱ所示的化合物：[0016][0017] 阿糖胞苷为式Ⅲ所示的化合物：[0018][0019] 一种含青蒿素类衍生物的组合物的应用，所述组合物在制备治疗包括白血病和淋巴瘤在内的血液肿瘤药物中的应用。[0020] 所述组合物相互协调诱导白血病细胞凋亡及DNA损伤制备治疗急性髓细胞性白血病药物中的应用。[0021] 所述急性髓细胞性白血病为THP‑1或MOLM‑13细胞。[0022] 所述在制备治疗THP‑1药物时，组合物A组分、B组分和C组分按8：1：5比例混合；[0023] 所述在制备治疗MOLM‑13药物时，组合物A组分、B组分和C组分按40：2：1比例混合。[0024] 一种含青蒿素类衍生物的组合物的制剂，所述制剂活性成分以及药物上接受的载体混合，其中，活性成分为权利要求1所述的组合物，活性成分占制剂质量的0.01‑99％。[0025] 所述制剂剂型为片剂、胶囊、颗粒。[0026] 所述制剂为将组合物中各组分混合后与药物上可接受到的载体混合制备制剂，或将组合物中各组分分别与药物上可接受到的载体制备制剂而后混合。[0027] 进一步的说，在将本发明组合物制成同时给药的药剂的方案中，青蒿琥酯、Bcl‑2抑制剂venetoclax和阿糖胞苷可以含在同一种药物制剂如片剂或胶囊中，患者按照说明书指示进行服用，或将上述组合物中的三种成分制成一种控释的制剂，先后释放组合物中的成分，患者只需服用该控释的组合物制剂；在将本发明组合物制备成交叉给药的制剂方案中，可以将青蒿琥酯、Bcl‑2抑制剂venetoclax和阿糖胞苷分别做成不同的制剂，并采用本领域常规的方式将它们包装或结合在一起，然后患者按照药品说明书指示的交叉顺序服用，或者将该药物组合物制备成青蒿琥酯、Bcl‑2抑制剂venetoclax和阿糖胞苷交叉释放的控释制剂。[0028] 本发明所具有的优点：[0029] 本发明提供了青蒿琥酯、Bcl‑2抑制剂venetoclax和阿糖胞苷组合物，并在机制上阐明青蒿琥酯能够通过诱导Noxa，与venetoclax协同诱导细胞凋亡，克服venetoclax的耐受，同时下调Mcl‑1蛋白，克服阿糖胞苷诱导的p‑Chk1反馈性激活和DNA损伤修复过程，增强阿糖胞苷对白血病细胞的杀伤作用。本发明克服了现有技术青蒿琥酯与阿糖胞苷联用方案和venetoclax与阿糖胞苷联用方案由于其他抗凋亡蛋白反馈性上调产生的耐药，显著改善了venetoclax与阿糖胞苷联合方案对AML的治疗效果。附图说明[0030] 图1为本发明实施例提供的采用本发明组合物在THP‑1和MOLM‑13细胞中考察对AML细胞的生长抑制效果图；[0031] 图2为本发明实施例提供的采用本发明组合物在THP‑1和MOLM‑13细胞中考察对AML细胞的凋亡诱导效果图；[0032] 图3为本发明实施例提供的采用本发明组合物在THP‑1和MOLM‑13细胞中考察对AML细胞的杀伤效果图；[0033] 图4为本发明实施例提供的采用本发明组合物在THP‑1和MOLM‑13细胞中考察抑制集落形成效果图。[0034] 图5为本发明实施例提供的采用本发明组合物在NOD‑SCID小鼠体内考察抑制肿瘤生长效果图，其中，A为小鼠肿瘤图片,B为小鼠瘤重,C为小鼠体重。[0035] 图6为本发明实施例提供的采用本发明组合物在NOD‑SCID小鼠体内考察延长异种移植小鼠生存期图。[0036] 图7为本发明实施例提供的采用本发明组合物在THP‑1和MOLM‑13细胞中考察诱导促凋亡Noxa,下调抗凋亡Mcl‑1,抑制复制应激检查点激酶p‑Chk1,诱导DNA损伤蛋白□‑H2A.X蛋白效果图。。具体实施方式[0037] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。[0038] 本申请实施例中所用的细胞和药品如下：[0039] 细胞：人急性髓细胞性白血病细胞THP‑1购自American Type CultureCollection(ATCC)。人急性髓细胞性白血病细胞Molm‑13购自DSMZ‑DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(BraunschweigGermany)。药品：以下实施例中所用药物组合物均按下列方法所述来制备；青蒿琥酯购自Sigma，储存浓度10mM；venetoclax购自Selleck,储存浓度10mM；阿糖胞苷购自MedChemExpress，储存浓度20mM。[0040] 实施例1[0041] 试剂和方法：[0042] 准确称量青蒿琥酯和ABT‑199，分别溶解于二甲基亚砜,各自配成10mM的贮存液,在‑20℃下保存,使用时用乙醇稀释到适当的浓度。准确称量阿糖胞苷，溶于0.22μm滤膜过滤的PBS；而后再将青蒿琥酯、venetoclax和阿糖胞苷使用时用新鲜的培养基(1640培养基)稀释到合适的浓度。所有实验中，严格控制二甲基亚砜和乙醇的终浓度，二甲基亚砜终浓度不超过1‰，乙醇终浓度不超过1％，不影响细胞活性。[0043] 将THP‑1细胞和Molm‑13细胞培养于1640培养基，含10％灭活的胎牛血清，10mmol/LL‑glutamine,100U/mL青霉素,and100μg/mL链霉素，37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养。[0044] 将对数生长期细胞，按105密度接种于24孔板中，向细胞中加入不同的药物浓度处理(参见表1‑6)。72h后，通过台盼蓝染色法观察死亡细胞。将混匀的细胞按1:1(v/v)与台盼蓝染料混合，染色后，用光学显微镜及血球计数板计数正常细胞和蓝染死细胞(参见图1)。依照如下公式计算细胞生长抑制率(GI)，并求得半数生长抑制浓度(GI50：使细胞生长抑制率达50％时的药物浓度)。[0045] GI＝(对照孔细胞数‑加药孔细胞数)/对照孔细胞数×100％[0046] 用Compusyn软件计算药物组合物的协同指数(CI)。[0047] 表1不同浓度的青蒿琥酯和venetoclax的组合协同抑制THP‑1细胞生长实验[0048]青蒿琥酯(μM) Venetoclax(μM) 生长抑制率(％) 联合指数CI0.2 ‑‑ 10.29 ‑‑0.4 ‑‑ 17.65 ‑‑0.8 ‑‑ 31.80 ‑‑‑‑ 0.1 15.51 ‑‑‑‑ 0.5 22.96 ‑‑‑‑ 1 40.82 ‑‑0.2 0.1 35.52 0.470.2 0.5 49.58 0.580.2 1 78.82 0.490.4 0.1 42.02 0.340.4 0.5 55.83 0.390.4 1 85.41 0.420.8 0.1 59.13 0.120.8 0.5 64.83 0.100.8 1 88.14 0.11[0049] 由表1可见，急性髓细胞性白血病细胞株THP‑1细胞用青蒿琥酯0.2‑0.8μM，与venetoclax0.1‑1μM联合处理72h。青蒿琥酯和venetoclax单独用药时，抑制细胞生长比例均＜50％。青蒿琥酯的加入明显增强了venetoclax的抑制细胞生长的作用，用Compusyn软件计算两药的联合指数，联合指数＞1表示两种化合物为拮抗作用，＜1为协同作用。青蒿琥酯与venetoclax的联合指数均＜0.6，显示两个化合物有协同作用。0.8μM的青蒿琥酯与0.1μMvenetoclax联合应用，抑制THP‑1细胞生长比例达到59％，CI＝0.12，显示强协同抑制细胞生长作用。[0050] 表2不同浓度的青蒿琥酯和venetoclax的组合协同抑制MOLM‑13细胞生长实验[0051] 青蒿琥酯(μM) Venetoclax(μM) 生长抑制率(％) 联合指数CI0.1 ‑‑ 7.89 ‑‑0.2 ‑‑ 13.61 ‑‑0.4 ‑‑ 27.83 ‑‑‑‑ 0.0025 29.57 ‑‑‑‑ 0.005 36.02 ‑‑‑‑ 0.01 45.02 ‑‑0.1 0.0025 60.6 0.110.1 0.005 62.06 0.110.1 0.01 66.79 0.080.2 0.0025 66.49 0.150.2 0.005 69.9 0.130.2 0.01 74.24 0.080.4 0.0025 73.99 0.180.4 0.005 78.11 0.150.4 0.01 84.03 0.07[0052] 由表2可见，急性髓细胞性白血病细胞株MOLM‑13细胞对青蒿琥酯和venetoclax的敏感性强于THP‑1细胞，用青蒿琥酯0.1‑0.4μM，与venetoclax0.0025‑0.01μM联合处理72h。青蒿琥酯和venetoclax单独用药时，抑制细胞生长比例均＜50％。青蒿琥酯的加入明显增强了venetoclax的抑制细胞生长的作用，用Compusyn软件计算两药的联合指数，青蒿琥酯与venetoclax的联合指数均＜0.2，显示两个化合物有非常强的协同作用。0.2μM的青蒿琥酯与0.01μMvenetoclax联合应用，抑制MOLM‑13细胞生长比例达到74％，CI＝0.08，显示强协同抑制细胞生长作用。[0053] 根据试验发现，青蒿琥酯与venetoclax通过协同诱导细胞发生凋亡，发挥协同杀伤AML细胞的作用，但在体内动物实验水平作用有限，因而需要寻找新的联合方案。[0054] 表3不同浓度的青蒿琥酯和阿糖胞苷的组合联合抑制THP‑1细胞生长实验[0055][0056][0057] 由表3可见，THP‑1细胞用青蒿琥酯0.2‑0.8μM，与阿糖胞苷0.25‑1μM联合处理72h。青蒿琥酯和阿糖胞苷单独用药时，抑制细胞生长比例均＜50％。青蒿琥酯不能明显增强阿糖胞苷抑制细胞生长的作用，用Compusyn软件计算两药的联合指数，联合指数＞1，显示两个化合物有拮抗作用。0.8μM的青蒿琥酯与0.5μMvenetoclax联合应用，抑制THP‑1细胞生长比例为49％，CI＝1.23，显示拮抗作用。[0058] 表4不同浓度的青蒿琥酯和阿糖胞苷的组合联合抑制MOLM‑13细胞生长实验[0059] 青蒿琥酯(μM) 阿糖胞苷(μM) 生长抑制率(％) 联合指数CI0.1 ‑‑ 21.73 ‑‑0.2 ‑‑ 35.35 ‑‑0.4 ‑‑ 46.44 ‑‑‑‑ 0.00125 3.74 ‑‑‑‑ 0.0025 7.36 ‑‑‑‑ 0.005 13.94 ‑‑0.1 0.00125 17.24 1.750.1 0.0025 26.97 0.950.1 0.005 24.81 1.310.2 0.00125 37.64 0.840.2 0.0025 40.47 0.820.2 0.005 44.68 0.730.4 0.00125 48.17 0.980.4 0.0025 50.94 0.88[0060] 由表4可见，MOLM‑13细胞用青蒿琥酯0.1‑0.4μM，与阿糖胞苷0.00125‑0.005μM联合处理72h。青蒿琥酯和阿糖胞苷单独用药时，抑制细胞生长比例均＜50％。青蒿琥酯不能明显增强阿糖胞苷抑制细胞生长的作用，用Compusyn软件计算两药的联合指数，联合指数＞0.7，部分剂量下协同指数>1，显示两个化合物没有明显的协同作用。0.2μM的青蒿琥酯与0.005μM阿糖胞苷联合应用，抑制THP‑1细胞生长比例为45％，CI＝0.73，显示弱协同抑制细胞生长作用。[0061] 由上述实验数据表明，青蒿琥酯与阿糖胞苷在AML细胞水平不能发挥明显的协同作用。[0062] 表5不同浓度的venetoclax和阿糖胞苷的组合协同抑制THP‑1细胞生长实验[0063]Venetoclax(μM) 阿糖胞苷(μM) 生长抑制率(％) 联合指数CI0.1 ‑‑ 8.52 ‑‑0.5 ‑‑ 20.81 ‑‑1 ‑‑ 29.66 ‑‑‑‑ 0.25 19.84 ‑‑‑‑ 0.5 29.99 ‑‑‑‑ 1 43.5 ‑‑0.1 0.25 37.61 0.510.1 0.5 49.82 0.520.1 1 61.22 0.490.5 0.25 43.18 0.570.5 0.5 53.25 0.530.5 1 67.52 0.411 0.25 52.43 0.631 0.5 59.68 0.561 1 72.68 0.41[0064] 由表5可见，THP‑1细胞用venetoclax0.1‑1μM，与阿糖胞苷0.25‑1μM联合处理72h。Venetoclax和阿糖胞苷单独用药时，抑制细胞生长比例均＜50％。Venetoclax的加入能明显增强阿糖胞苷抑制细胞生长的作用，用Compusyn软件计算两药的联合指数，联合指数<0.6，显示两个化合物有协同抑制细胞生长的作用。0.1μM的venetoclax与0.5μM阿糖胞苷联合应用，抑制THP‑1细胞生长比例为50％，CI＝0.52，显示协同抑制细胞生长作用。[0065] 表6不同浓度的venetoclax和阿糖胞苷的组合协同抑制MOLM‑13细胞生长实验[0066]Venetoclax(μM) 阿糖胞苷(μM) 生长抑制率(％) 联合指数CI0.0025 ‑‑ 20.27 ‑‑0.005 ‑‑ 26.35 ‑‑0.01 ‑‑ 35.98 ‑‑‑‑ 0.00125 9.2 ‑‑‑‑ 0.0025 11.28 ‑‑‑‑ 0.005 22.3 ‑‑0.0025 0.00125 43.63 0.20.0025 0.0025 56.27 0.130.0025 0.005 60.96 0.150.005 0.00125 48.8 0.240.005 0.0025 61.88 0.130.005 0.005 67.83 0.120.01 0.00125 62.64 0.170.01 0.0025 71.64 0.10.01 0.005 79.11 0.07[0067] 由表6可见，MOLM‑13细胞用venetoclax0.0025‑0.01μM，与阿糖胞苷0.00125‑0.005μM联合处理72h。Venetoclax和阿糖胞苷单独用药时，抑制细胞生长比例均＜50％。Venetoclax的加入能明显增强阿糖胞苷抑制细胞生长的作用，用Compusyn软件计算两药的联合指数，联合指数<0.3，显示两个化合物有较强的协同抑制细胞生长的作用。0.01μM的venetoclax与0.005μM阿糖胞苷联合应用，抑制THP‑1细胞生长比例为79％，CI＝0.07，显示强协同抑制细胞生长作用。[0068] 虽然阿糖胞苷与venetoclax联合方案已经被批准应用于老年AML患者的治疗，但临床治疗作用有限，因而仍需要寻找新的联合方案。[0069] 在两种AML细胞株中，青蒿琥酯与venetoclax联合和venetoclax与阿糖胞苷联合能协同抑制AML细胞生长，青蒿琥酯与阿糖胞苷联合不能发挥明显的协同作用。根据以上试验，进一步采用青蒿琥酯与venetoclax和阿糖胞苷三药浓度进行联合，考察对AML细胞的杀伤作用。[0070] 而后根据上述单独物质以及两两组合的效果设置各实验组，并按照上述方式对AML细胞的生长抑制进行检测，参见图1。[0071] 对于THP‑1细胞各实验分组如下：(1)空白对照组；(2)青蒿琥酯组(0.8μM)；(3)Venetoclax组(0.1μM)；(4)阿糖胞苷组(0.5μM)；(5)青蒿琥酯(0.8μM)+venetoclax(0.1μM)组；(6)青蒿琥酯(0.8μM)+阿糖胞苷(0.5μM)组；(7)Venetoclax(0.1μM)+阿糖胞苷(0.5μM)组；(8)青蒿琥酯(0.8μM)+venetoclax(0.1μM)+阿糖胞苷(0.5μM)组。[0072] 对于MOLM‑13细胞各实验分组如下：(1)空白对照组；(2)青蒿琥酯组(0.2μM)；(3)Venetoclax组(0.01μM)；(4)阿糖胞苷组(0.005μM)；(5)青蒿琥酯(0.2μM)+venetoclax(0.01μM)组；(6)青蒿琥酯(0.2μM)+阿糖胞苷(0.005μM)组；(7)Venetoclax(0.01μM)+阿糖胞苷(0.005μM)组；(8)青蒿琥酯(0.2μM)+venetoclax(0.01μM)+阿糖胞苷(0.005μM)组。[0073] 由图1可见，在THP‑1细胞中不同实验组对AML细胞的生长抑制作用，青蒿琥酯+venetoclax组和venetoclax+阿糖胞苷组能抑制70％和59％的细胞生长，活性好于任意单独用药组(青蒿琥酯25％，venetoclax31％，阿糖胞苷38％)，青蒿琥酯与阿糖胞苷联合抑制44％的细胞生长，没有明显增强阿糖胞苷或青蒿琥酯的生长抑制作用，而青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组能抑制85％的细胞生长,活性好于任意两药联合组。[0074] 由于MOLM‑13细胞对青蒿琥酯、venetoclax和阿糖胞苷比THP‑1细胞更敏感，各组效果分别为青蒿琥酯+venetoclax组和venetoclax+阿糖胞苷组能抑制71％和70％的细胞生长，活性好于任意单独用药组(青蒿琥酯17％，venetoclax38％，阿糖胞苷26％)，青蒿琥酯与阿糖胞苷联合抑制35％的细胞生长，没有明显增强阿糖胞苷或青蒿琥酯的生长抑制作用，青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组能抑制92％的细胞生长,活性好于任意两药联合组。提示青蒿琥酯能够明显增强venetoclax与阿糖胞苷联合方案对AML细胞的生长抑制作用。[0075] 实施例2[0076] 取对数生长期的THP‑1细胞和Molm‑13细胞，分别按105密度接种于6孔板中，再向不同THP‑1和MOLM‑13细胞中加入不同的药物单独或联合处理24h或12h。THP‑1细胞实验分组如下(1)空白对照组；(2)青蒿琥酯组(0.8μM)；(3)Venetoclax组(0.1μM)；(4)阿糖胞苷组(8μM)；(5)青蒿琥酯(0.8μM)+venetoclax(0.1μM)组；(6)青蒿琥酯(0.8μM)+阿糖胞苷(8μM)组；(7)Venetoclax(0.1μM)+阿糖胞苷(8μM)组；(8)青蒿琥酯(0.8μM)+venetoclax(0.1μM)+阿糖胞苷(8μM)组。[0077] MOLM‑13细胞实验分组如下(1)空白对照组；(2)青蒿琥酯组(0.2μM)；(3)Venetoclax组(0.01μM)；(4)阿糖胞苷组(0.08μM)；(5)青蒿琥酯(0.2μM)+venetoclax(0.01μM)组；(6)青蒿琥酯(0.2μM)+阿糖胞苷(0.08μM)组；(7)Venetoclax(0.01μM)+阿糖胞苷(0.08μM)组；(8)青蒿琥酯(0.2μM)+venetoclax(0.01μM)+阿糖胞苷(0.08μM)组。采用AV‑PI试剂盒检测细胞凋亡情况(参见图2)；[0078] 结果如图所示，在THP‑1细胞中，青蒿琥酯+venetoclax组能诱导28％的细胞发生凋亡，活性好于任意单独用药组(青蒿琥酯4％，venetoclax5％)，青蒿琥酯+阿糖胞苷(8％)和venetoclax+阿糖胞苷组(9％)不能明显诱导细胞发生凋亡，青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组能诱导38％的细胞发生凋亡,活性好于任意两药联合组。在MOLM‑13细胞中，venetoclax单独能诱导25％的细胞发生凋亡，与青蒿琥酯或阿糖胞苷联合凋亡率增加至43％或45％，活性好于任意单独用药组(青蒿琥酯11％，venetoclax25％，阿糖胞苷14％)，青蒿琥酯与阿糖胞苷联合能够诱导15％的细胞凋亡，没有明显增强阿糖胞苷或青蒿琥酯的凋亡诱导作用，青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组能诱导59％的细胞发生凋亡,活性好于任意两药联合组。提示青蒿琥酯能够明显增强venetoclax与阿糖胞苷联合方案对AML细胞的凋亡诱导作用。[0079] 实施例3[0080] 取对数生长期的THP‑1细胞和Molm‑13细胞，分别按105密度接种于6孔板中，向THP‑1和MOLM‑13细胞中加入不同的药物单独或联合处理24h或12h。THP‑1细胞实验分组如下(1)空白对照组；(2)青蒿琥酯组(0.8μM)；(3)Venetoclax组(0.1μM)；(4)阿糖胞苷组(8μM)；(5)青蒿琥酯(0.8μM)+venetoclax(0.1μM)组；(6)青蒿琥酯(0.8μM)+阿糖胞苷(8μM)组；(7)Venetoclax(0.1μM)+阿糖胞苷(8μM)组；(8)青蒿琥酯(0.8μM)+venetoclax(0.1μM)+阿糖胞苷(8μM)组。[0081] MOLM‑13细胞实验分组如下(1)空白对照组；(2)青蒿琥酯组(0.2μM)；(3)Venetoclax组(0.01μM)；(4)阿糖胞苷组(0.08μM)；(5)青蒿琥酯(0.2μM)+venetoclax(0.01μM)组；(6)青蒿琥酯(0.2μM)+阿糖胞苷(0.08μM)组；(7)Venetoclax(0.01μM)+阿糖胞苷(0.08μM)组；(8)青蒿琥酯(0.2μM)+venetoclax(0.01μM)+阿糖胞苷(0.08μM)组。采用PI单染法检测细胞周期变化(参见图3)。[0082] 结果如图所示，在THP‑1细胞中，青蒿琥酯+venetoclax组和venetoclax+阿糖胞苷组能诱导26％和19％的Sub‑G1期细胞增加，活性好于任意单独用药组(青蒿琥酯4％，venetoclax4％，阿糖胞苷8％)，青蒿琥酯+阿糖胞苷组不能明显诱导Sub‑G1期细胞比例增加，青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组能诱导32％的Sub‑G1期细胞比例增加,活性好于任意两药联合组。在MOLM‑13细胞中，venetoclax单独能诱导33％的Sub‑G1期细胞比例增加，与青蒿琥酯和阿糖胞苷联合Sub‑G1期细胞比例增加至45％和40％，活性好于任意单独用药组(青蒿琥酯9％，venetoclax33％，阿糖胞苷11％)，青蒿琥酯与阿糖胞苷联合能够诱导14％的Sub‑G1期细胞比例增加，没有明显增强阿糖胞苷或青蒿琥酯的作用，青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组能诱导51％的Sub‑G1期细胞比例增加,活性好于任意两药联合组。提示青蒿琥酯能够明显增强venetoclax与阿糖胞苷联合诱导AML细胞发生DNA断裂的作用。以上结果证实青蒿琥酯能够明显增强venetoclax与阿糖胞苷联合对AML细胞的杀伤作用。[0083] 实施例4[0084] 在THP‑1和MOLM‑13细胞中采用软琼脂集落形成试验考察对单细胞增殖潜力的影响。[0085] 取受试药物20μL混入软琼脂底层，分别取对数生长期的THP‑1细胞和Molm‑13细胞各5000个混入软琼脂上层，14天后在解刨显微镜下计数直径大于75μm(50个细胞以上)的集落(参见图4)。[0086] THP‑1细胞实验分组如下(1)空白对照组；(2)青蒿琥酯组(0.8μM)；(3)Venetoclax组(0.1μM)；(4)阿糖胞苷组(0.5μM)；(5)青蒿琥酯(0.8μM)+venetoclax(0.1μM)组；(6)青蒿琥酯(0.8μM)+阿糖胞苷(0.5μM)组；(7)Venetoclax(0.1μM)+阿糖胞苷(0.5μM)组；(8)青蒿琥酯(0.8μM)+venetoclax(0.1μM)+阿糖胞苷(0.5μM)组。[0087] MOLM‑13细胞实验分组如下(1)空白对照组；(2)青蒿琥酯组(0.2μM)；(3)Venetoclax组(0.01μM)；(4)阿糖胞苷组(0.005μM)；(5)青蒿琥酯(0.2μM)+venetoclax(0.01μM)组；(6)青蒿琥酯(0.2μM)+阿糖胞苷(0.005μM)组；(7)Venetoclax(0.01μM)+阿糖胞苷(0.005μM)组；(8)青蒿琥酯(0.2μM)+venetoclax(0.01μM)+阿糖胞苷(0.005μM)组。实验结果如图所示，青蒿琥酯单独应用不能抑制集落形成；Venetoclax和阿糖胞苷单独应用抑制不超过30％的集落形成，抑制作用有限；青蒿琥酯+venetoclax组和venetoclax+阿糖胞苷组约抑制70％的集落形成，作用好于任意单独用药组；青蒿琥酯与阿糖胞苷联合约抑制50％的集落形成，没有明显增强阿糖胞苷对集落形成的抑制作用；青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组约抑制90％的集落形成，作用好于任意两药联合组。[0088] 实施例5[0089] 为考察青蒿琥酯与venetoclax和阿糖胞苷联合的体内抗AML作用：[0090] 40只雌性NOD‑SCID小鼠右侧腋皮下接种MOLM‑13细胞5×106个/只。当肿瘤体积达2到100mm左右，随机分为8组，(1)空白对照组；(2)青蒿琥酯组(100mg/kg)；(3)Venetoclax组(100mg/kg)；(4)阿糖胞苷组(50mg/kg)；(5)青蒿琥酯(100mg/kg)+venetoclax(100mg/kg)组；(6)青蒿琥酯(100mg/kg)+阿糖胞苷(50mg/kg)组；(7)Venetoclax(100mg/kg)+阿糖胞苷(50mg/kg)组；(8)青蒿琥酯(100mg/kg)+venetoclax(100mg/kg)+阿糖胞苷(50mg/kg)组。青蒿琥酯溶于10％(5％NaHCO3)+90％生理盐水，腹腔注射给药，每天给药1次，连续给药10天；Venetoclax溶于10％乙醇+30％PEG400+60％Phosal50PG，口服给药，每天给药1次，连续给药10天；阿糖胞苷溶于生理盐水，腹腔注射给药，每天给药1次，连续给药10天。[0091] 由图5可见，青蒿琥酯组抑瘤作用相对较弱，抑瘤率为22.9％。Venetoclax和阿糖胞苷能够有效抑制肿瘤生长，抑瘤率分别为64.2％和44.8％。青蒿琥酯+阿糖胞苷组的抑瘤率为44.8％，与阿糖胞苷组抑瘤率相同，提示青蒿琥酯不能增强阿糖胞苷的抑瘤作用。青蒿琥酯+venetoclax组和venetoclax+阿糖胞苷组的抑瘤率分别为68.2％和75％，均没有明显增强venetoclax的抑瘤作用。青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组抑瘤率为92％，抑瘤作用优于任意两药联合组。青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组小鼠体重在试验过程中没有明显改变。[0092] 实施例6[0093] 为模拟真实AML模型，将35只雌性NOD‑SCID小鼠经尾静脉接种MOLM‑13细胞2×106个/只。三天后，将小鼠按体重随机分为5组，分别为(1)空白对照组；(2)Venetoclax(100mg/kg)组；(3)青蒿琥酯(100mg/kg)+venetoclax(100mg/kg)组；(4)Venetoclax(100mg/kg)+阿糖胞苷(50mg/kg)组；(5)青蒿琥酯(100mg/kg)+venetoclax(100mg/kg)+阿糖胞苷(50mg/kg)组。青蒿琥酯溶于10％(5％NaHCO3)+90％生理盐水，腹腔注射给药；Venetoclax溶于10％乙醇+30％PEG400+60％Phosal50PG，口服给药；阿糖胞苷溶于生理盐水，腹腔注射给药。青蒿琥酯和venetoclax每周给药5天，连续给药4周；阿糖胞苷连续给药7天。记录小鼠的体重和存活时间，用Kaplan‑Meier法绘制小鼠的存活曲线。THP‑1细胞异种移植模型及给药方案与MOLM‑13细胞方案相同(参见图6)。[0094] 由图6可见，Venetoclax组、青蒿琥酯+venetoclax组、venetoclax+阿糖胞苷组和青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组与对照组相比均显著延长异种移植小鼠生存期，青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组相比venetoclax组、青蒿琥酯+venetoclax组和venetoclax+阿糖胞苷组生存期进一步延长，ILS％达118.8％。在尾静脉异种移植THP‑1细胞模型中，青蒿琥酯+venetoclax组、venetoclax+阿糖胞苷组和青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组与对照组相比均显著延长异种移植小鼠生存期，青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组相比venetoclax组、青蒿琥酯+venetoclax组和venetoclax+阿糖胞苷组生存期进一步延长，ILS％达45.1％。以上结果证实，在体内青蒿琥酯能够有效增强venetoclax和阿糖胞苷联合方案的抗AML作用。[0095] 实施例7[0096] 取对数生长期的THP‑1细胞和Molm‑13细胞，分别按105密度接种于6孔板中，向THP‑1和MOLM‑13细胞中加入不同的药物单独或联合处理24h或12h，THP‑1细胞实验分组如下(1)空白对照组；(2)青蒿琥酯组(0.8μM)；(3)Venetoclax组(0.1μM)；(4)阿糖胞苷组(8μM)；(5)青蒿琥酯(0.8μM)+venetoclax(0.1μM)组；(6)青蒿琥酯(0.8μM)+阿糖胞苷(8μM)组；(7)Venetoclax(0.1μM)+阿糖胞苷(8μM)组；(8)青蒿琥酯(0.8μM)+venetoclax(0.1μM)+阿糖胞苷(8μM)组。MOLM‑13细胞实验分组如下(1)空白对照组；(2)青蒿琥酯组(0.2μM)；(3)Venetoclax组(0.01μM)；(4)阿糖胞苷组(0.08μM)；(5)青蒿琥酯(0.2μM)+venetoclax(0.01μM)组；(6)青蒿琥酯(0.2μM)+阿糖胞苷(0.08μM)组；(7)Venetoclax(0.01μM)+阿糖胞苷(0.08μM)组；(8)青蒿琥酯(0.2μM)+venetoclax(0.01μM)+阿糖胞苷(0.08μM)组。采用western‑blot技术对青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷三药联合进行机制研究，在THP‑1和MOLM‑13细胞中考察了凋亡相关蛋白、DNA损伤蛋白和复制应激检查点激酶(参见图7)。[0097] 实验结果如图所示，以青蒿琥酯为基础的联合方案诱导了Noxa的上调，Noxa能够通过与Mcl‑1结合发挥间接抑制Mcl‑1的作用，而单独Noxa的上调并不足以诱导细胞发生凋亡以及DNA损伤，需同时抑制Bcl‑2，Venetoclax与青蒿琥酯联合能协同诱导PARP和caspase‑3的裂解以及γ‑H2A.X的上调，在青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组中进一步增加，并伴随Mcl‑1下调。阿糖胞苷是AML治疗的基石，阿糖胞苷能够掺入DNA，抑制DNA的合成，使细胞发生周期阻滞并诱导DNA损伤发挥抗肿瘤作用，但阿糖胞苷处理会同时诱导复制应激检查点激酶Chk的磷酸化激活，启动DNA损伤修复过程，进而以阿糖胞苷为基础的联合方案诱导p‑Chk1的上调，青蒿琥酯和venetoclax联合诱导caspase以依赖的Mcl‑1的下调，从而克服了阿糖胞苷诱导的p‑Chk1的上调，与阿糖胞苷组、青蒿琥酯+阿糖胞苷组和venetoclax+阿糖胞苷组相比，青蒿琥酯+venetoclax+阿糖胞苷组的p‑Chk1和Mcl‑1水平更低。以上结果证实，青蒿琥酯通过诱导Noxa上调，增强venetoclax的凋亡诱导作用，同时降低Mcl‑1的蛋白水平，进而克服阿糖胞苷诱导的p‑Chk1的激活，增强阿糖胞苷DNA损伤作用。[0098] 本发明THP‑1和MOLM‑13细胞的基础抗凋亡蛋白表达水平不同，MOLM‑13细胞高表达Bcl‑2同时低表达Mcl‑1和Bim，对venetoclax和阿糖胞苷敏感；THP‑1细胞高表达Bcl‑2、Mcl‑1和Bim，对venetoclax和阿糖胞苷相对耐受，因此，本发明选择不同浓度的青蒿琥酯、venetoclax和阿糖胞苷处理两种细胞，在两种细胞中均发现三药联合产生了比任意两药联合更强的杀伤AML细胞的作用。[0099] 综上所述，本发明将三药组合联用与单独的青蒿琥酯、venetoclax、阿糖胞苷或任意两种药物组合相比，青蒿琥酯既通过诱导Noxa，协同venetoclax诱导凋亡，又下调Mcl‑1的蛋白水平克服了阿糖胞苷的p‑Chk1耐受机制，使三药联合产生了比任意两药联合更强的协同杀伤AML细胞的作用。

专利地区：辽宁

专利申请日期：2022-01-25

专利公开日期：2024-11-05

专利公告号：CN116531395B