产麦香融合魏斯氏菌及其在麦香型白酒中的应用

专利名称：产麦香融合魏斯氏菌及其在麦香型白酒中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410884891.5

专利申请（专利权）人：黄淮学院,河南省隋唐酒业有限公司
权利人地址：河南省驻马店市驿城区开源大道6号黄淮学院

专利发明（设计）人：郭红伟,任璐,林志畅,闫嫚嫚,闫可欣,陈雨欣,刘军和,雷亚伟,武红亚

专利摘要：本发明属于融合魏斯氏菌的筛选及应用技术领域，尤其涉及一株产麦香融合融合魏斯氏菌Weissella confusa及其在麦香型白酒中应用，其分离自麦香型发酵酒醅中，其于2024年5月28日送交中国武汉的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏号为CCTCC M 20241086，本发明通过研究微生物与产麦香物质的关系，对于改进麦香型白酒的生产工艺、提高白酒香气和口感等品质特性、掌握酿造过程中的作用机制、优化酿造工艺有重要意义。

主权利要求：
1.融合魏斯氏菌Weissellaconfusa，其分离自麦香型发酵酒醅中，其于2024年5月28日送交中国武汉的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏号为CCTCCM20241086。
2.如权利要求1所述的融合魏斯氏菌Weissellaconfusa，其特征在于：该融合魏斯氏菌Weissellaconfusa的16SrDNA的核苷酸序列表如SEQIDNO：1所示。
3.如权利要求1所述的融合魏斯氏菌Weissellaconfusa的应用，其特征在于：其用于白酒酿造过程中产麦香融合口感，提高麦香型白酒的麦香风味。 说明书 : 产麦香融合魏斯氏菌及其在麦香型白酒中的应用技术领域[0001] 本发明属于融合魏斯氏菌的筛选及应用技术领域，尤其涉及一株产麦香融合魏斯氏菌Weissellaconfusa及其在麦香型白酒中的应用。背景技术[0002] 麦香型白酒是一种以小麦为原料酿造的白酒，具有独特的香气和浓郁的口感。麦香型白酒的酿造工艺包括小麦的浸泡、初蒸、闷水、复蒸等步骤，麦香型白酒的香气清新、芳香，口感醇厚、柔和，非常适合现代人的口感。麦香型白酒中的麦香主要来源于小麦原料本身及其在酿造过程中的转化。这种麦香具有清新、自然的特性，为白酒增添了丰富的口感和香气。值得注意的是，麦香型白酒的质量和口感与酿酒微生物的代谢活动密切相关。优质的麦香型白酒，其麦香味道会更为浓郁、持久，与酒体的其他香气相互融合，形成独特而和谐的风味。研究微生物与产麦香物质的关系，对于改进麦香型白酒的生产工艺、提高白酒香气和口感等品质特性、掌握酿造过程中的作用机制、优化酿造工艺有重要意义。为了进一步提高黄淮麦香型白酒的麦香风味，本研究通过对酒醅中产麦香功能菌的筛选，得到与麦香物质形成有关的功能菌，并应用在麦香白酒的生产中，以期进一步提高麦香型白酒的麦香风味。发明内容[0003] 本发明的目的是提供一株产麦香融合融合魏斯氏菌Weissellaconfusa及其在麦香型白酒中的应用。[0004] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：[0005] 一株融合魏斯氏菌Weissellaconfusa，其分离自河南隋唐酒业有限公司提供的麦香型发酵酒醅中(2轮发酵第14d样品)即为实验过程中筛选的M7菌株，其于2024年5月28日送交中国武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCM20241086。[0006] 进一步的，该融合魏斯氏菌Weissellaconfusa的16SrDNA的核苷酸序列表如SEQIDNO：1所示。[0007] 融合魏斯氏菌Weissellaconfusa的应用，其用于白酒酿造过程中产麦香融合口感，提高麦香型白酒的麦香风味。[0008] 本发明具有的优点是：本发明融合魏斯氏菌Weissellaconfusa在烃类、醇类、酸类中香气成分高，与小麦更接近，且将其用于麦香型白酒酿造过程中能提高麦香型白酒的麦香风味，使白酒香气和口感等品质特性得到提高，对于掌握酿造过程中的作用机制、优化酿造工艺有重要指导意义。附图说明[0009] 图1是本发明中M1、M5、M7菌株形态图。[0010] 图2是本发明中M1、M5、M7菌株系统发育树图。具体实施方式[0011] 实施例[0012] 一株融合魏斯氏菌Weissellaconfusa，其分离自河南隋唐酒业有限公司提供的麦香型发酵酒醅中(2轮发酵第14d样品)，其于2024年5月28日送交中国武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCM20241086；该融合魏斯氏菌Weissellaconfusa的16SrDNA的核苷酸序列表如SEQIDNO：1所示；融合魏斯氏菌Weissellaconfusa的应用，其用于白酒酿造过程中产麦香融合口感，提高麦香型白酒的麦香风味。[0013] 实验[0014] 1材料与方法[0015] 1.1实验材料[0016] 黄淮麦香型发酵酒醅(2轮发酵第14d样品)由河南隋唐酒业有限公司提供。LB培养基(g/L)：蛋白陈1g，酵母提取物0.5g,1gNaCI,121℃灭菌20min。MRS培养基(g/L)：蛋白陈1g，MgSO40.02g，酵母提取物1g，乙酸钠0.5g，柠檬酸钠0.2g，葡萄糖2g，吐温800.1mL，K2HPO40.2g，MnSO40.005g，121℃灭菌20min后备用。YPD培养基(g/L)：蛋白陈2g，酵母提取物1g，葡萄糖2g；30℃培养24h。麸皮固体培养基：称取1g玉米粉和9g麸皮，以此为底物，加入0.05％磷酸二氢钾，6％葡萄糖，0.5％硫酸铵，加入蒸馏水，制成1:1料液(加入菌液后料液比为1:1)，121℃灭菌20min。[0017] 1.2仪器设备[0018] LDZM‑30电热式压力蒸汽灭菌器(信阳化工机械设备有限公司)、BXP‑6电热恒温培养箱(上海始恒仪器有限公司)、SHZ‑82气浴恒温振荡器(博纳科技仪器有限公司)[0019] 1.3发酵酒醅中产麦香菌的筛选和鉴定[0020] 1.3.1产麦香菌初筛[0021] 取10克大曲，并加入90毫升的无菌水，充分混合均匀。随后，将混合物放置在摇床上，在37℃的温度下持续震荡30分钟，以促进菌体均匀分布。取0.1mL菌悬液进行系列稀释(10‑1、10‑3、10‑5、10‑7和10‑9梯度)10倍倍比稀释，并取10‑3、10‑5、10‑7三个梯度稀释液，各取0.1mL菌悬液并涂布于LB固体培养基，MRS固体培养基和YPD固体培养基等筛选平板培养基上，把接过菌的LB培养基和MRS培养基倒置到37℃恒温培养箱培养两天，YPD培养基倒置到30℃恒温培养箱培养三天。挑选不同形态的菌落用四分法在营养琼脂培养基上接种，37℃培养两天后，采用平板划线法多次重复纯化，直到分离纯化得到不同形态微生物单菌落，并在4℃冰箱保存。将分离纯化得到的细菌菌株，用接种环挑取一个单菌落接种到液体种子培养基中，37℃，180转每分钟震荡培养两天。[0022] 1.3.2产麦香菌株的复筛[0023] 使用麸皮固体培养基，将上述分离纯化的16株菌株种子液，以2％的接种量接种于10g麸皮固体培养基中，40℃恒温培养14d后进行闻香评价，从中筛选出产麦香菌株，同时设置空白对照。[0024] 1.4产麦香菌株的鉴定[0025] 1.4.1形态实验[0026] 对产麦香菌进行形态鉴定和观察[0027] 1.4.2分子生物学鉴定[0028] 1.基因组DNA提取[0029] a：预处理细菌沉淀：首先，向含有细菌沉淀的试管中加入1000微升的磷酸缓冲盐溶液，使细菌沉淀均匀悬浮。随后，从中取出500微升悬浮液，转移至一个1.5毫升的离心管中，通过10000g的离心力离心1分钟，去除上清液。[0030] b：蛋白酶K消化[0031] c：DNA的提取与纯化[0032] d：DNA吸附与洗涤，每次洗涤后均通过离心去除废液。[0033] e：DNA洗脱与收集[0034] PCR扩增[0035] 在进行PCR扩增时，首先使用细菌基因组DNA抽提试剂盒从复筛的菌株中提取基因组DNA。随后，利用这些DNA作为模板，采用细菌16rDNA的通用引物对27F和1492R来执行PCR扩增过程。[0036] 琼脂糖凝胶电泳[0037] 在验证PCR扩增结果时，采用琼脂糖凝胶电泳的方法。对于那些条带清晰、显示良好扩增效果的PCR产物，选择将其送至武汉赛维尔生物科技有限公司进行测序分析。测序完成后，将获得的测序数据提交至美国国家生物信息技术中心(NCBI)的数据库，利用BLAST工具进行序列比对。此外，为了进一步探究目标菌株的系统发育关系，使用MEGA7.0软件构建了其系统发育树，为后续的遗传分析和分类提供了有力支持。[0038] 1.5不同菌株麦香成分分析[0039] 对感官评价产麦香的3种菌(M1、M5和M7)麦香成分进行代谢组学鉴定。同时以小麦作为参比对照组进行检测。[0040] 本研究中，采用了美国Aiglent公司出品的高级四极杆质谱检测系统(型号Agilent7820‑5977)，该系统集成了电子轰击离子源(EI)和MassHunter工作站，确保实验过程的精准性。数据采集仪器系统主要包括气相色谱(Agilent7820，USA)和四极杆质谱检测系统(Agilent5977，USA)。原始数据首先使用MassHunter(AgilentTechnologies，USA)软件进行基线过滤、峰识别等前处理，得到一个包含保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵。通过与本地数据库及NIST等公共数据库进行比对后实现对代谢物的定性定量分析。[0041] 1.6M7菌株不同添加比例对麦香酒香味成分和产品质量的影响[0042] 麦香型白酒生产工艺概述如下：[0043] 一轮发酵，取酒[0044] 小麦的酿酒粮食混匀后进行润料、蒸煮，蒸熟后加冷水浸泡至开花；[0045] 将浸泡后的粮食摊晾后加入5％‑8％的小曲进行堆积糖化，堆积发酵至温度升高至45～50℃后，摊凉，加入5‑10％中高温曲和1‑5％的稻壳后，堆积温度升高至30‑35℃后，入池发酵30d。发酵30d后出池蒸酒，留酒醅(记为旧粮)[0046] 二轮发酵，取酒[0047] 小麦的酿酒粮食混匀后进行润料、蒸煮，蒸熟后加冷水浸泡至开花；[0048] 将浸泡后的粮食摊晾后加入5％‑8％的小曲进行堆积糖化，堆积发酵至温度升高至45～50℃后，摊凉(记为新粮)。[0049] 新粮和旧粮1:1混合后，按新粮重量加入5％‑10％的大曲并同时加入不同比例的9M7菌液(活菌数为1.0×10CFU/mL)，分组如下：[0050] 对照组：不加M7菌液[0051] 实验1组：新粮重量的0.1％(V/W)[0052] 实验2组：新粮重量的0.3％(V/W)[0053] 实验3组：新粮重量的0.5％(V/W)[0054] 发酵周期14‑28d后，蒸馏取酒[0055] 一轮和二轮酒勾兑出酒。[0056] 4组酒进行产品质量检测和风味物质分析。[0057] 1.6数据统计与分析[0058] 所有实验数据均通过计算平均值及其标准偏差来呈现。数据分析方面，采用了SPSS20.0软件，并运用了其中的一般线性模型，结合单方差分析(ANOVA)进行统计检验。为了进一步比较不同组别之间的差异，采用了新复极差检验进行多次比较。在统计学上，设定P值小于0.05为差异显著，而P值大于0.05则视为差异不显著。[0059] 2结果与分析[0060] 2.1菌株初筛[0061] 对大曲实施分离纯化操作，经由初筛和复筛，通过肉眼观察菌株的群体特征和个体特征，依据形状、透明程度、菌落表面的干湿状况、光泽情况、颜色以及附着程度等，筛选出16种具有不同菌落形态的菌株。如表1.[0062] 表1菌株形态鉴定结果[0063]菌株编号 含水状态 外观形态 形态特征 菌落透明度 菌落颜色M1 较干燥 中间突起 边缘粗糙 不透明 灰白色M2 较湿润 小而突起 边缘较粗糙 不透明 白色M3 较湿润 表面光滑 圆形边缘整齐 微透明 白色M4 较湿润 表面光滑 圆形边缘整齐 不透明 黄色M5 较湿润 表面光滑 圆形边缘整齐 不透明 淡黄色M6 较湿润 表面光滑 圆形边缘整齐 不透明 白色M7 较湿润 表面光滑 不规则圆形 不透明 黄色M8 较湿润 大而突起 丝状边缘不规则 不透明 白色M9 较湿润 大而突起 丝状圆形边缘整齐 不透明 白色M10 较湿润 大而突起 丝状边缘粗糙 不透明 微黄色M11 较湿润 大而突起 丝状圆形 不透明 白色M12 较湿润 大而突起 丝状圆形边缘粗糙 不透明 微黄色M13 较湿润 大而突起 丝状圆形边缘整齐 不透明 微黄色M14 较湿润 大而突起 丝状不规则形 不透明 微黄色M15 较干燥 大而突起 丝状不规则形 不透明 白色M16 较干燥 小而突起 圆形边缘整齐 不透明 白色[0064] 2.2感官评定[0065] 通过固体发酵实验和感官评定从分离得到的16株菌株中挑选出3株产麦香的细菌，分别为M1、M5、M7，对麦香功能菌模拟固态发酵产物进行感官评定，结果如表2。[0066] 表2感官评定结果[0067][0068] 2.3产麦香菌株的鉴定[0069] 2.3.1形态学鉴定结果[0070] 对产麦香菌M1、M5、M7进行观察，观察其菌落形态，结果如图1，M1菌落颜色为灰白色，菌落形状为不规则圆形，菌落表面粗糙不透明，M5菌落颜色为乳白色，菌落形状为圆形，菌落表面光滑，M7菌落颜色为白色，菌落形状为不规则圆形，菌落表面光滑中间有突起。[0071] 2.3.2菌种鉴定[0072] 对产麦香菌株M1、M5、M7进行16SrDNA测序(武汉赛维尔生物科技有效公司)，菌株鉴定操作步骤为基因组DNA提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳等。测序结果分析16SrDNA序列在核糖体数据库https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上比对。以目标菌株的DNA为模板，经PCR扩增出的16SrDNA序列，M1序列大小为1422bp；M5序列大小为1381bp；M7序列大小为1449bp。通过序列比对发现菌株M1与Bacillussubtilis(TaxonomyID:2508883)相似性为100.00％；菌株M5与Erwiniatasmaniensis(TaxonomyID:465817)相似性为98.55％；菌株M7与Weissellaconfusastrain(TaxonomyID:1225265)相似性为99.93％。系统发育树如图2。[0073] 2.3麦香成分分析[0074] 经过代谢组学分析结果，共鉴定出47种成分(表3)，其中，M5中香气成分数量最多，高达45种；M7中香气成分数量次之，含43种；M1中香气成分数量最少，为41种。由表4可知，M1、M5、M7中共有香气成分37种。在烃类、醇类、酸类、酯类和酚类中(前三成分)M7香气成分更高，与小麦更接近，因此选择M7进行下步实验。[0075] 表3代谢组学结果[0076][0077][0078][0079][0080] 注：FC:foldchange＝菌株组(M1/M5/M7)/对照组(小麦)[0081] 2.5M7菌株不同添加比例对麦香酒香味风味成分的影响[0082] M7菌株不同添加比例对麦香酒香味风味成分的影响(前三)见表4，由表4可知每种风味物质取含量最高的前3进行统计，并选取对照组进行FC计算，并以各指标FC之和进行对比。结果表明添加0.1％M7菌液组FC值为16.39，与对照组FC值16.0无显著性差异；添加0.3％M7菌液组，FC值为19.63，与对照组相比显著高于对照组FC值；添加0.5％M7菌液后，FC值为19.53显著高于对照组，但与0.3％M7菌液组无显著性差异(P＜0.05)。[0083] 表4M7菌株不同添加比例对麦香酒香味风味成分的影响(前三)[0084][0085][0086] 2.6M7菌株不同添加比例对白酒质量的影响[0087] M7菌株不同添加比例对白酒质量的影响见表5。按照GB/T10781.1‑2021《白酒质量要求第1部分:浓香型白酒》的指标进行检测，结果表明添加0.1‑0.5％M7菌液后，对麦香酒产品质量无影响，且均复合国标要求。综合分析添加0.3‑0.5％M7菌液对产品质量无影响，且可显著提高麦香风味。[0088] 表5M7菌株不同添加比例对质量的影响[0089]

专利地区：河南

专利申请日期：2024-07-03

专利公开日期：2024-11-19

专利公告号：CN118638690B