一种豹纹鳃棘鲈脑细胞系的构建方法及其应用

专利名称：一种豹纹鳃棘鲈脑细胞系的构建方法及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202411140759.X

专利申请（专利权）人：中国海洋大学三亚海洋研究院
权利人地址：海南省三亚市崖州区崖州湾科技城用友产业园一号楼七层

专利发明（设计）人：胡景杰,王婧文,汪波,张依倩,宋思祺,金超凡,包振民

专利摘要：本发明公开了一种豹纹鳃棘鲈脑细胞系的构建方法及其应用。该豹纹鳃棘鲈脑细胞系的构建方法包括：步骤A：豹纹鳃棘鲈脑组织预处理；步骤B：豹纹鳃棘鲈脑细胞原代培养；步骤C：豹纹鳃棘鲈脑细胞传代培养。所构建的豹纹鳃棘鲈脑细胞系稳定性好，细胞分裂旺盛，传代时间较短，能够稳定传代80代以上，可提供大量的豹纹鳃棘鲈脑来源细胞，细胞能够维持良好的生长状态，可以对其进行冷冻保存。本发明所构建的豹纹鳃棘鲈脑细胞系对神经坏死病毒具有敏感性，接毒后均出现细胞病变。本发明细胞系可直接应用于病原特性研究及外源基因功能研究等。

主权利要求：
1.一种豹纹鳃棘鲈脑细胞系的构建方法，其特征在于，包括：步骤A：豹纹鳃棘鲈脑组织预处理；所述步骤A包括：步骤A‑1：从豹纹鳃棘鲈中取出完整脑组织；步骤A‑2：将所述完整脑组织利用不同抗生素浓度的缓冲液冲洗和浸泡；
步骤B：豹纹鳃棘鲈脑细胞原代培养；所述步骤B包括：步骤B‑1：将所述步骤A‑2中冲洗和浸泡后的所述完整脑组织进行消化和清洗得到第一沉淀，重复清洗3遍后得到第四沉淀，所述消化的消化液包含：0.25%胰蛋白酶，2mg/mL胶原酶，5%胎牛血清和0.05%DNase1，所述消化反应温度为30℃；步骤B‑2：将所述步骤B‑1中所述清洗后获得的所述第四沉淀进行原代培养得到原代培养细胞；
步骤C：豹纹鳃棘鲈脑细胞传代培养，所述步骤C包括：步骤C‑1：将所述步骤B‑2中所述原代培养细胞进行消化和清洗得到第五沉淀；步骤C‑2：将所述步骤C‑1中所述清洗后获得的所述第五沉淀进行传代培养得到所述豹纹鳃棘鲈脑细胞系。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，
所述步骤A‑1具体为：将3月龄、4月龄、5月龄或6月龄的所述豹纹鳃棘鲈进行麻醉，用消毒酒精对所述豹纹鳃棘鲈鱼体表面进行消毒，在无菌条件下解剖取出所述完整脑组织；
所述步骤A‑2具体为：将所述完整脑组织用5´抗生素PBS缓冲液冲洗3 4次，每次冲洗~
10‑15min；将所述完整脑组织用2´抗生素PBS缓冲液冲洗1 2次，每次5 10min；将所述完~ ~整脑组织用1´抗生素的PBS缓冲液浸泡5min；
所述5´抗生素PBS缓冲液包含：500U/mL青霉素、500μg/mL链霉素；
所述2´抗生素PBS缓冲液包含：200U/mL青霉素、200μg/mL链霉素；
所述1´抗生素PBS缓冲液包含：100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，
所述步骤B‑1具体为：将所述步骤A‑2中冲洗和浸泡后的所述完整脑组织放入玻璃皿3
中，加入1mLL‑15培养基，将所述完整脑组织剪成1mm小块，加入4倍脑组织体积的所述消化液5mL，30℃，130rpm/min消化反应30 40min，所述消化反应后加入1/10体积胎牛血~清终止所述消化反应；利用40μm灭菌滤网将所述消化反应后的液体过滤至50mL离心管中，加入2 3mL所述L‑15培养基冲洗所述灭菌滤网，离心5min，弃上清，得到第一沉淀，加~入5mL所述L‑15重悬第一沉淀，再次过滤至50mL离心管中，用2 3mL所述L‑15培养基冲洗~所述灭菌滤网，离心5min，弃上清，重复清洗3遍后得到所述第四沉淀；
所述步骤B‑2具体为：取所述第四沉淀加入5mL完全培养基进行重悬，吹打混匀，分装2
至25cm的第一培养瓶中，细胞培养箱中正置进行原代培养，每日观察细胞生长情况，更换所述完全培养基，得到原代培养细胞；
所述完全培养基包含：100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、40ng/mL重组人表皮生长因子EGF、20％胎牛血清的所述L‑15溶液；
所述原代培养温度为28℃；
所述离心条件为300g，室温。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，
所述步骤C‑1具体为：待所述步骤B‑2中所述原代培养细胞贴壁覆盖率达到70%‑80%，将所述完全培养基吸出，加入2mLPBS缓冲液清洗所述第一培养瓶2次，每次静置1min，以
0.25%胰蛋白酶消化所述原代培养细胞，待消化的原代细胞悬起变圆，加入400μL胎牛血清终止所述消化反应；离心5min，弃上清，保留所述第五沉淀，加入5mL所述完全培养基重悬所述第五沉淀，吹打混匀，将所述第五沉淀细胞悬液接种到25cm2的第二培养瓶中继续正置于28℃细胞培养箱中培养；
所述步骤C‑2具体为：每2天半量更换一次传代培养基，每3‑6天传代一次；传至50代时，所述豹纹鳃棘鲈脑细胞系建立成功；
所述传代培养基包含：所述100U/mL青霉素、所述100μg/mL链霉素、所述40ng/mL重组人表皮生长因子EGF、15 20%胎牛血清的所述L‑15溶液；
~
所述传代培养温度为28℃；
所述离心条件为300g，室温。
5.由权利要求1所述方法构建的豹纹鳃棘鲈脑细胞系。
6.由权利要求1所述方法构建的豹纹鳃棘鲈脑细胞系在水产动物病毒分离、水产动物病毒培养、水产动物病毒抗病基因研究或非诊断治疗目的的水产动物病毒检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述水产动物病毒为神经坏死病毒。 说明书 : 一种豹纹鳃棘鲈脑细胞系的构建方法及其应用技术领域[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种豹纹鳃棘鲈脑细胞系的构建方法及其应用。背景技术[0002] 豹纹鳃棘鲈（Plectropomusleopardus），属鲈形目（Perciformes），鮨科（Serranidae），石斑鱼亚科（Epinephelinae），鳃棘鲈属，俗称东星斑。它主要分布于印度洋至太平洋之间的热带海域，海南东岸和南部海域均有分布，为热带珊瑚礁鱼类，数量稀少，因肉质鲜美，体色鲜艳成为名贵的海水养殖鱼类，具有广阔的市场前景。我国海南具有适合豹纹鳃棘鲈生长的优越自然条件，有丰富的鱼类资源，海南省鱼类养殖产量中，石斑鱼养殖产量最高。[0003] 神经坏死病毒（NNV，NervousNecrosisVirus）属于诺达病毒科（Nodaviridae），β诺达病毒属（Betanodavirus），该属病毒专一感染鱼类，可造成鱼类患病毒性神经坏死病。已经给水产养殖业造成了巨大的经济损失，严重制约了水产养殖业的可持续发展，在我国的台湾、海南、广东和福建等地区养殖的石斑鱼苗种受NNV的危害尤其严重，常造成石斑鱼孵化后一个月内的成活率不足10%。[0004] 由于NNV主要感染鱼类中枢神经系统和视网膜神经系统，中枢神经系统细胞组成复杂且功能多样性，而豹纹鳃棘鲈作为神经坏死病毒的易感群体，目前尚未有关于其脑组织细胞系的报道研究。细胞系作为一种重要的生物学特征研究材料，因此，有必要建立规范的豹纹鳃棘鲈脑细胞系分离和培养方法，为豹纹鳃棘鲈的体外研究精准营养提供可靠的研究材料。为研究免疫抗病基因的功能提供重要材料，也可更有针对性地研究NNV的入侵机制。发明内容[0005] 本发明的目的是为了建立规范的豹纹鳃棘鲈脑细胞系分离和培养方法，为解决该技术问题：[0006] 本发明第一方面提供一种纹鳃棘鲈脑细胞系的构建方法，包括以下步骤：[0007] 步骤A：豹纹鳃棘鲈脑组织预处理；步骤A包括：步骤A‑1：从豹纹鳃棘鲈中取出完整脑组织；步骤A‑2：将所述完整脑组织利用不同抗生素浓度的缓冲液冲洗和浸泡；[0008] 步骤B：豹纹鳃棘鲈脑细胞原代培养；步骤B包括：步骤B‑1：将步骤A‑2中冲洗和浸泡后的完整脑组织进行消化和清洗得到第四沉淀，消化的消化液包含：0.25%胰蛋白酶，2mg/mL胶原酶，5%胎牛血清和0.05%DNase1，消化反应温度为30℃；步骤B‑2：将步骤B‑1中所述清洗后获得的第四沉淀进行原代培养得到原代培养细胞；[0009] 步骤C：豹纹鳃棘鲈脑细胞传代培养；步骤C包括：步骤C‑1：将步骤B‑2中原代培养细胞进行消化和清洗；步骤C‑2：将步骤C‑1中所述清洗后获得的第五沉淀进行传代培养。[0010] 进一步的，步骤A‑1具体为：将3月龄、4月龄、5月龄或6月龄的豹纹鳃棘鲈进行麻醉，用消毒酒精对豹纹鳃棘鲈鱼体表面进行消毒，在无菌条件下解剖取出完整脑组织；[0011] 进一步的，步骤A‑2具体为：将所述完整脑组织用5´抗生素PBS缓冲液冲洗3 4次，~每次冲洗10‑15min；将所述完整脑组织用2´抗生素PBS缓冲液冲洗1 2次，每次5 10min；~ ~将所述完整脑组织用1´抗生素的PBS缓冲液浸泡5min；[0012] 进一步的，5×抗生素PBS缓冲液包含：500U/mL青霉素、500μg/mL链霉素；[0013] 进一步的，2×抗生素PBS缓冲液包含：200U/mL青霉素、200μg/mL链霉素；[0014] 进一步的，1×抗生素PBS缓冲液包含：100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。[0015] 进一步的，步骤B‑1具体为：将步骤A‑2中冲洗和浸泡后的所述完整脑组织放入玻3璃皿中，加入1mLL‑15培养基，将完整脑组织剪成1mm小块，加入4倍脑组织体积的消化液5mL，30℃，130rpm/min消化30‑40min，消化反应后加入1/10体积胎牛血清终止消化反应；利用40μm灭菌滤网将消化反应后的液体过滤至50mL离心管中，加入2 3mLL‑15培养~基冲洗灭菌滤网，离心5min，弃上清，得到第一沉淀；加入5mLL‑15培养基重悬第一沉淀，再次过滤至50mL离心管中，用2 3mLL‑15培养基冲洗灭菌滤网，离心5min，弃上清，重复~清洗3遍后得到第四沉淀；[0016] 进一步的，步骤B‑2具体为：取步骤B‑1中第四沉淀加入5mL完全培养基进行重悬，2吹打混匀，分装至25cm第一的培养瓶中，细胞培养箱中正置进行原代培养，每日观察细胞生长情况，更换完全培养基，得到原代培养细胞；[0017] 进一步的，完全培养基包含：100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、40ng/mL重组人表皮生长因子EGF、20％胎牛血清的L‑15溶液；[0018] 进一步的，原代培养温度为28℃；[0019] 进一步的，离心条件为300g，室温。[0020] 进一步的，步骤C‑1具体为：待步骤B‑2中原代培养细胞贴壁覆盖率达到70%‑80%，将完全培养基吸出，加入2mLPBS缓冲液清洗第一培养瓶2次，每次静置1min，以0.25%胰蛋白酶消化原代培养细胞，待消化的原代细胞悬起变圆，加入400μL胎牛血清终止反应；离心5min，弃上清，保留第五沉淀，加入5mL完全培养基重悬第五沉淀，吹打混匀，将第五沉2淀细胞悬液接种到25cm第二培养瓶中继续正置于28℃细胞培养箱中培养；[0021] 进一步的，步骤C‑2具体为：每2天半量更换一次传代培养基，每3‑6天传代一次；传至50代时，所述豹纹鳃棘鲈脑细胞系建立成功；[0022] 进一步的，传代培养基包含：100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、40ng/mL重组人表皮生长因子EGF、15 20%胎牛血清的L‑15溶液；~[0023] 进一步的，传代培养温度为28℃。[0024] 进一步的，离心条件为300g，室温。[0025] 本发明第二方面提供一种有上述方法构建的豹纹鳃棘鲈脑细胞系。[0026] 本发明第三方面提供一种豹纹鳃棘鲈脑细胞系在水产动物病毒分离、水产动物病毒培养、水产动物病毒抗病基因研究或非诊断治疗目的的水产动物病毒检测中的应用。[0027] 进一步的，水产动物病毒为神经坏死病毒。[0028] 本发明通过豹纹鳃棘鲈脑组织经原代培养、传代培养成功构建了豹纹鳃棘鲈脑细胞系，在原代培养过程中，发明人针对消化液配方、消化反应条件、完全培养基配方经过了多次改进，最终得到的该细胞系稳定性好，细胞分裂旺盛，传代时间较短，能够稳定传代80代以上，可提供大量的豹纹鳃棘鲈脑来源细胞，细胞能够维持良好的生长状态，可以对其进行冷冻保存。从而初次建立了规范的豹纹鳃棘鲈脑细胞系分离和培养方法，为豹纹鳃棘鲈的体外研究精准营养提供可靠的研究材料。[0029] 此外，本发明所构建的豹纹鳃棘鲈脑细胞系对神经坏死病毒具有敏感性，接毒后均出现细胞病变。因此，本发明细胞系可直接应用于病原特性研究及外源基因功能研究等，同时该构建方法也适用于其他鱼类脑细胞系的构建。附图说明[0030] 本发明的以上内容以及下面的具体实施方式在结合附图阅读时会得到更好的理解。需要说明的是，附图仅作为所请求保护的技术方案的示例。[0031] 图1为本发明实施例1中显微镜下观察（20×）豹纹鳃棘鲈脑细胞的原代培养图，其中A为原代细胞培养1天，B为原代细胞培养5天，C为原代细胞培养13天的结果；[0032] 图2为本发明实施例1中显微镜下观察（20×）豹纹鳃棘鲈脑细胞的传代培养图，其中A为原代细胞培养2代，B为原代细胞培养25代，C为原代细胞培养50代的结果；[0033] 图3为本发明实施例1中显微镜下观察（20×）豹纹鳃棘鲈脑细胞系冻存后复苏的细胞状态图，其中A为细胞复苏24h，B为细胞复苏48h，C细胞复苏72h的结果；[0034] 图4为本发明测试例1中显微镜下观察（20×）质粒pEGFP‑N3在豹纹鳃棘鲈脑细胞中表达的绿色荧光图。A为转染48h绿色荧光图，B为转染72h绿色荧光图；[0035] 图5‑1为本发明测试例2中显微镜下观察（20×）豹纹鳃棘鲈脑细胞在感染神经坏死病毒之后病变观察结果图，其中A为对照组细胞，B为NNV感染后24h细胞；[0036] 图5‑2为本发明测试例2中显微镜下观察（20×）豹纹鳃棘鲈脑细胞在感染神经坏死病毒之后病变观察结果图，其中C为NNV感染后48h细胞，D为NNV感染后72h细胞。具体实施方式[0037] 以下在具体实施方式中详细叙述本发明的详细特征以及优点，其内容足以使任何本领域技术人员了解本发明的技术内容并据以实施，且根据本说明书所揭露的说明书、权利要求及附图，本领域技术人员可轻易地理解本发明相关的目的及优点。[0038] 应注意的是，在本说明书中，相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。[0039] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0040] （1）样品材料的来源[0041] 4月龄豹纹鳃棘鲈购自中国海南省东方市感城镇海南晨海水产有限公司。[0042] （2）试剂耗材的来源[0043] 表1实验所需试剂耗材来源及货号[0044]名称 生产厂商 货号青霉素‑链霉素 Gibco 15140‑122Human‑egf（重组人表皮生长因子EGF） 派普泰克 AF‑100‑15‑100PBS缓冲液 Gibco 10010‑049Trypsin（胰蛋白酶） Worthington LS003707Collagenase（胶原酶） Roche 11074059001L‑15培养基 Hyclone SH30525.01pEGFP‑N3 庄盟生物 ZK413胎牛血清 Hyclone SH30406.05DNase 1 Takara 2270A细胞冻存液 雅酶生物 BY002PTransIT‑X2转染试剂 Mirus MIR60001mL加长枪头 科进 LG18‑601K‑1细胞培养瓶 NEST 707003[0045] （3）仪器设备来源[0046] 表2实验所需仪器设备来源及型号[0047] 仪器名称 仪器制造商 仪器型号二氧化碳培养箱 上海一恒科学仪器 BPN‑40CRH医用冷藏冷冻箱 海尔生物医疗 HYCD‑282超净工作台 海尔 HCB‑1300V液氮罐 OLABO YDS‑35‑80荧光倒置显微镜 徕卡显微系统 DMi8台式离心机 贝克曼库尔特 Microfuge 20R大容量离心机 贝克曼库尔特 Allegra X‑30R水浴锅 LICHEN HH‑6程序降温盒 科莫斯科技 Cell‑Home‑30[0048] 实施例1[0049] 豹纹鳃棘鲈脑细胞系的构建，包括以下步骤。[0050] S1、豹纹鳃棘鲈脑组织预处理，具体步骤参考如下：[0051] （1）将4月龄豹纹鳃棘鲈麻醉，用75%酒精反复擦拭豹纹鳃棘鲈鱼体表面，在无菌环境中使用无菌剪刀和眼科镊子解剖取出完整脑组织；[0052] （2）将上述取出的完整脑组织放入含有5×抗生素的PBS缓冲液（青霉素浓度为500U/mL，链霉素浓度为500μg/mL）中冲洗3 4次，每次冲洗10 15min，然后使用含有2×抗生~ ~素的PBS缓冲液（青霉素浓度为200U/mL，链霉素浓度为200μg/mL）冲洗1 2次，每次5 10~ ~min，再使用含有1×抗生素的PBS缓冲液（青霉素浓度为100U/mL，链霉素浓度100μg/mL），冲洗并浸泡一次5min。[0053] S2、原代培养，具体参考步骤如下：[0054] （1）取上述浸泡后的完整脑组织放入玻璃皿中，在玻璃皿中加入1mLL‑15培养3基，将完整脑组织剪成大约1mm 的小块，再加入约4倍组织块体积的消化液5mL（含0.25%胰蛋白酶，2mg/mL胶原酶，5%胎牛血清，0.05%DNase1），消化反应温度为30℃，130rpm/min消化30 40min，消化后加入1/10体积胎牛血清终止消化反应，并用40μm灭菌滤网过滤至~50mL离心管中，再使用2‑3mLL‑15培养基冲洗灭菌滤网，300g离心5min，弃上清，得到第一沉淀。加入5mLL‑15培养基重悬第一沉淀，再次过滤至50mL离心管中，用2 3mLL‑15培~养基冲洗灭菌滤网，300g再次离心5min，弃上清，重复清洗3遍后得到第四沉淀。[0055] （2）取上述第四沉淀加入5mL完全培养基（含有100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、40ng/mL重组人表皮生长因子EGF、20％胎牛血清的L‑15溶液）进行重悬，吹打混匀，分2装至25cm的第一培养瓶中，正置于28℃细胞培养箱中培养，每天观察细胞生长情况，根据需要更换细胞完全培养基，原代培养结果参见图1，原代培养时间在9 13天时原代培养细胞~贴壁覆盖率达到70%以上。[0056] S3、传代培养，具体参考步骤如下：[0057] 待上述原代细胞生长数目增多，原代细胞贴壁覆盖率达到70 80%时，开始进行传~代培养。[0058] （1）先将原代培养液吸出，使用2mLPBS缓冲液清洗第一培养瓶2次，每次静置1min，以0.25%胰蛋白酶消化原代培养细胞，直至消化的原代细胞悬起变圆后，再加入400μL胎牛血清终止反应，300g离心5min，弃上清，保留第五沉淀，再加入5mL完全培养基重悬第2五沉淀，吹打混匀，将第五沉淀细胞悬液接种到25cm的第二培养瓶中继续培养。[0059] （2）首次按1:1进行传代培养（传代培养基：100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、40ng/mL重组人表皮生长因子EGF、15 20%胎牛血清的L‑15溶液），待细胞长成单层后，此后每~次均按1:2进行传代培养，于28℃细胞培养箱中继续培养；每次更换培养基只更换50%原培养基（吸出培养瓶中2.5mL培养基，加入2.5mL新配置传代培养基），3 6天传代一次；当传~至15 20代时，将完全培养基中重组人表皮生长因子EGF浓度降低为10ng/mL；传至20代以~后，将完全培养基中重组人表皮生长因子EGF浓度降低为0，传至50代时，所述豹纹鳃棘鲈脑细胞系建立成功，传代培养结果参见图2，其中A为原代细胞培养2代，B为原代细胞培养25代，C为原代细胞培养50代的结果。[0060] S4、将S3中传代培养后的豹纹鳃棘鲈脑细胞进行冻存，具体步骤参考如下：[0061] （1）用0.25％胰蛋白酶消化法收集一瓶（25cm2）生长旺盛、处于指数生长期的豹纹鳃棘鲈脑细胞，获得单细胞悬液，1000rpm离心5min，将细胞收集到离心管底部，弃上清液，保留第六沉淀；[0062] （2）在第六沉淀中加入1mL细胞冻存液重悬细胞，得到轻轻吹打重悬细胞，使细胞6个数约为1×10 个/mL，取1mL第六沉淀细胞悬液转移至2mL无菌冻存管中，并将冻存管放入程序降温盒中，‑80℃冰箱放置24h后移至液氮中进行长期保存。[0063] S5、取S4中冻存的豹纹鳃棘鲈脑细胞进行复苏，具体步骤参考如下：[0064] 将装有豹纹鳃棘鲈脑细胞的冻存管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴锅中快速摇晃至完全融化，不超过两分钟；在无菌环境中，将解冻后的细胞转移至15mL离心管中，再加入9mL传代培养基，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入5mL传代培养基重悬细胞，转移至细胞培养瓶中，放置于28℃细胞培养箱中培养，隔天更换培养基，待豹纹鳃棘鲈脑细胞贴壁并铺满后进行细胞传代培养。[0065] 结果如图3所示，对于豹纹鳃棘鲈脑细胞冻存后复苏48h细胞贴壁率达到70％‑80％，冻存后复苏96h后细胞可长满培养瓶瓶底，与冻存前的豹纹鳃棘鲈脑细胞形态无明显差异，表明本发明豹纹鳃棘鲈脑细胞系构建方法构建获得的豹纹鳃棘鲈脑细胞系具有稳定性好的优势。[0066] 对比例1[0067] 本发明实施例1的S2步骤（1）中：消化液包含0.25%胰蛋白酶，2mg/mL胶原酶，5%胎牛血清和0.05%DNase1。[0068] 本对比例1与实施例1相比，区别在于胶原酶的浓度不同，本对比例1采用的消化液包含0.25%胰蛋白酶，4mg/mL胶原酶，5%胎牛血清和0.05%DNase1。[0069] 实验结果发现，利用本对比例的消化液进行消化反应，导致原代培养的脑细胞贴壁数量较少，未形成单层细胞。[0070] 对比例2[0071] 本发明实施例1的S2步骤（1）中：消化反应温度为30℃。[0072] 本对比例2与实施例1相比，区别在于消化反应温度为28℃。[0073] 实验结果发现，原代培养中豹纹鳃棘鲈脑细胞结团较多，解离效果不好。[0074] 对比例3[0075] 本发明实施例1的S2步骤（2）中：完全培养基包含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、40ng/mL重组人表皮生长因子EGF、20％胎牛血清的L‑15溶液。[0076] 本对比例3与实施例1相比，区别在于胎牛血清的浓度不同，本对比例3采用的完全培养基包含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、40ng/mL重组人表皮生长因子EGF、10％胎牛血清的L‑15溶液。[0077] 实验结果发现，原代培养中豹纹鳃棘鲈脑细胞贴壁速度较慢，传代一次需要7 10~天。[0078] 测试例1[0079] 将实施例1所得豹纹鳃棘鲈脑细胞进行转染实验，包括以下步骤：[0080] 将质粒pEGFP‑N3转入豹纹鳃棘鲈脑细胞的步骤如下：[0081] （1）取实施例1中第60代豹纹鳃棘鲈脑细胞接种于含完全培养基的24孔板中，细胞6密度在2 6×10个/孔，置于28℃细胞培养箱中培养，待细胞密度达到80％以上时，准备进~行细胞转染实验。[0082] （2）使用250μL无血清培养基稀释0.5μgpEGFP‑N3表达质粒，再加入1.5μLTransIT‑X2转染试剂充分混匀后，室温静置15 30min，形成DNA复合物TransIT‑X2。~[0083] （3）取出待转染豹纹鳃棘鲈脑细胞，吸出旧培养基，加入新的500μL传代培养基，DNA复合物TransIT‑X2加入24孔板中，轻晃混匀使其均匀分布。[0084] （4）24h 72h后，在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光表达情况。结果如图4所示，A~为转染48h绿色荧光图，B为转染72h绿色荧光图，两者差别不大。质粒pEGFP‑N3转入豹纹鳃棘鲈脑细胞，显示绿色荧光，即细胞转染成功，说明豹纹鳃棘鲈脑细胞系可以用于外源基因的表达等研究。[0085] 测试例2[0086] 将实施例1所得豹纹鳃棘鲈脑细胞进行细胞病毒感染实验，包括以下步骤：[0087] S1、细胞病变效应（CPE，cytopathiceffect）及病毒滴度检测，具体步骤参考如下：[0088] （1）取28℃培养箱中培养至80 90%贴壁的第55代豹纹鳃棘鲈脑细胞进行传代，轻~轻吹打细胞制成第一单细胞悬液后，用细胞计数器计数，再用含2％胎牛血清的L‑15培养基5将细胞按照2×10个/mL的浓度进行稀释，以100μL/孔的初始量接种至96孔板中，于28℃细胞培养箱中正置培养，使豹纹鳃棘鲈脑细胞充分贴壁。[0089] （2）次日，将自制病毒液（来源于本实验室收集的神经坏死病毒感染致死的病鱼材料，取病鱼头部充分剪碎，冰上将组织充分研磨，将研磨液在4℃，12000rpm条件下离心15‑1 ‑8min，收集上清，经至少三次0.22μm过滤膜除菌即获得病毒粗提液）。按照10 10 进行10~倍浓度梯度稀释的在含2％胎牛血清的L‑15培养基中。[0090] （3）将上述含有豹纹鳃棘鲈脑细胞的96孔板中原培养基吸出，然后以100μL/孔加入不同浓度梯度稀释的病毒样品，每个浓度梯度设置8个重复孔，并设阴性对照孔（仅加入不含病毒的L‑15培养基）。28℃培养箱中培养，每天观察细胞病变（CPE）的情况，观察4 7天，~按照Reed‑Muench法计算病毒滴度，公式为：[0091] 。[0092] 该实验测得 ，表明该豹纹鳃棘鲈脑细胞系对神经坏死病毒具有易感性。[0093] S2、豹纹鳃棘鲈脑细胞病毒感染实验，具体步骤参考如下：[0094] 将实施例1中第60代豹纹鳃棘鲈脑细胞接种于培养瓶中，待细胞生长密度达80％以上，吸出原有培养基，按照文献推荐的（MOI=1）加入1.5mL上述病毒液对豹纹鳃棘鲈脑细胞进行刺激，2h后吸出病毒液，加入含2%胎牛血清的L‑15培养基继续培养，将培养瓶放入培养箱培养，对攻毒0h、24h、48h、72h的细胞观察细胞病变程度，观察结果如图5所示，病毒感染后24h细胞开始出现空泡，随着时间的增长空泡化增多，表明本发明所构建的豹纹鳃棘鲈脑细胞系可用于神经坏死病毒的病原特性研究。[0095] 由此可以得出结论：本发明所提供的豹纹鳃棘鲈脑细胞系通过胶原酶和胰蛋白酶联合消化法分离脑组织细胞，进行原代培养和传代培养，继而成功构建了豹纹鳃棘鲈脑细胞系，已连续传至80代以上，可提供大量的豹纹鳃棘鲈来源脑细胞，且细胞能维持良好的生长状态，可以对其进行冷冻保存。此外，本发明所构建的豹纹鳃棘鲈脑细胞系对神经坏死病毒具有敏感性，接毒后均出现细胞病变。因此，本发明细胞系可直接应用于病原特性研究及外源基因功能研究等，同时该构建方法也适用于其他鱼类脑细胞系的构建。[0096] 这里基于的术语和表述方式只是用于描述，本发明并不应局限于这些术语和表述。使用这些术语和表述并不意味着排除任何示意和描述（或其中部分）的等效特征，应认识到可能存在的各种修改也应包含在权利要求范围内。其他修改、变化和替换也可能存在。相应的，权利要求应视为覆盖所有这些等效物。[0097] 同样，需要指出的是，虽然本发明已参照当前的具体实施例来描述，但是本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，在没有脱离本发明精神的情况下还可做出各种等效的变化或替换，因此，只要在本发明的实质精神范围内对上述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书的范围内。

专利地区：海南

专利申请日期：2024-08-20

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN118652848B