一株耐受重金属铜和锌的黏着箭菌HG1-3-1及其应用

专利名称：一株耐受重金属铜和锌的黏着箭菌HG1-3-1及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310510263.6

专利申请（专利权）人：韩山师范学院
权利人地址：广东省潮州市湘桥区桥东

专利发明（设计）人：王桔红,陈文

专利摘要：本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株耐受重金属铜和锌的黏着箭菌HG1‑3‑1及其应用，所述的粘着箭菌HG1‑3‑1于2023年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:63301，所述的粘着箭菌HG1‑3‑1能够耐受重金属，并能够去除重金属，还具有促进植物生长的作用，为生态环境的修复提供新的途径。

主权利要求：
1.一株粘着箭菌（Ensiferadhaerens）HG1‑3‑1，其特征在于，所述的粘着箭菌HG1‑3‑1于2023年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:63301。
2.如权利要求1所述的粘着箭菌HG1‑3‑1，其特征在于，所述的粘着箭菌HG1‑3‑1能耐受重金属铜和/或锌。
3.如权利要求1所述的粘着箭菌HG1‑3‑1在去除重金属中的应用，其特征在于，所述的重金属为铜和/或锌。
4.权利要求1所述的粘着箭菌HG1‑3‑1在重金属污染土壤修复中的应用，其特征在于，所述的重金属为铜和/或锌。
5.权利要求1所述的粘着箭菌HG1‑3‑1在促进重金属胁迫环境下植物生长中的应用，其特征在于，所述的重金属为铜和/或锌。
6.一种生物修复制剂，其特征在于，所述的生物修复制剂含有权利要求1所述的粘着箭菌HG1‑3‑1。
7.一种植物促生剂，其特征在于，所述的植物促生剂含有权利要求1所述的粘着箭菌HG1‑3‑1。 说明书 : 一株耐受重金属铜和锌的黏着箭菌HG1‑3‑1及其应用技术领域[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株耐受重金属铜和锌的黏着箭菌HG1‑3‑1及其应用。背景技术[0002] 近年来由于工农业迅速发展以及采矿工与冶金工业的快速增长，环境问题日趋严重，尤其是废弃重金属矿区污染成为全世界面临的严重环境问题之一。重金属由于具有毒性强、不能降解、易富集、能在食物链中传递且具有致癌性等特性，对生态环境和人类健康都有潜在威胁。铜污染是常见的重金属污染。铜矿的开采、尾矿的堆积、工业废水的排放、含铜农药的使用等因素都会使得土壤中铜元素积累过多。铜元素被植物吸收后停留在根部，阻碍根系对其它成分特别是对铁元素的吸收，导致植物生长不良。而且过多的铜进入人体内会导致人体出现恶心、呕吐、上腹疼痛、急性溶血和肾小管变形等中毒现象。金属锌本身无毒，但如果长期饮用锌污染的水，或食用土地锌污染的农作物，或呼吸锌尘污杂的空气，会导致急性和生锌中毒如呕吐、腹泻等胃肠道、贫血、头晕和疲劳等症状。[0003] 目前对于重金属土壤污染的修复技术包括物理修复、化学修复、植物修复、微生物修复、联合修复等。传统的物理修复方式工程量大、成本高、而且难以应用到大面积的土壤修复治理中；化学修复的操作过程相对复杂，同时会破坏土壤结构，导致土壤肥力下降，可能存在二次污染。植物修复因其成本低廉、无二次污染，是一种绿色环保的土壤重金属污染修复技术，但其存在生物量小、生长周期长等弊端，单一的植物修复很难达到理想的效果。微生物修复是目前常用的土壤修复方法，本领域技术人员也做了诸多研究，例如，发明专利CN115094004A公开了一株耐重金属且能降解抗生素的植物内生菌及其应用，所述的菌株能适应现实环境中重金属和/或抗生素污染的土壤，并能很好地生长，可以作为优良的微生物降解菌剂应用于抗生素污染的土壤修复中，尤其适用在重金属胁迫下对抗生素污染土壤进行修复，为改善土壤污染提供了优良菌种；发明专利CN105861362B公开了一株耐重金属的放线菌菌株及其应用，所述的放线菌可以耐受并吸附多种重金属，可以用于重金属污染的水体及土壤等的治理。由此可见，微生物多样性为污染土壤的修复创造了机会，筛选具有耐受性的土著菌株用于修复当地重金属污染的研究十分必要。[0004] 本发明以广东潮州韩钢集团有限公司周边河流沿岸杂草地的土壤为材料，筛选得到了一株粘着箭菌(Ensiferadhaerens)HG1‑3‑1，所述的粘着箭菌HG1‑3‑1于2023年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:63301，所述的粘着箭菌HG1‑3‑1能够耐受重金属，并能够去除重金属，还具有促进植物生长的作用，为生态环境的修复提供新的途径。发明内容[0005] 本发明的首要目的是提供一种粘着箭菌(Ensiferadhaerens)HG1‑3‑1，所述的粘着箭菌HG1‑3‑1于2023年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:63301。[0006] 优选的，所述的粘着箭菌HG1‑3‑1能耐受重金属铜和/或锌。[0007] 本发明的第二目的是提供所述的粘着箭菌HG1‑3‑1或其菌株发酵液或其发酵无菌滤液在去除重金属中的应用。[0008] 本发明的第三目的是提供所述的粘着箭菌HG1‑3‑1在重金属污染土壤修复中的应用。[0009] 优选的，所述的重金属为铜和/或锌。[0010] 本发明的第四目的是提供所述的粘着箭菌HG1‑3‑1在促进重金属胁迫环境下植物生长中的应用。[0011] 本发明的第五目的是提供一种生物修复制剂，所述的生物修复制剂含有所述的粘着箭菌HG1‑3‑1。[0012] 本发明的第六目的是提供一种植物促生剂，所述的植物促生剂含有所述的粘着箭菌HG1‑3‑1。[0013] 本发明的有益效果是：本发明提供了一种粘着箭菌HG1‑3‑1，所述的粘着箭菌HG1‑3‑1于2023年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:63301，所述的粘着箭菌HG1‑3‑1能够耐受重金属，并能够去除重金属，还具有促进植物生长的作用，为生态环境的修复提供新的途径。附图说明[0014] 图1菌株HG1‑3‑1显微照片[0015] 图2琼脂糖凝胶电泳图注：M从上到下依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp[0016] 图3粘着箭菌HG1‑3‑1对重金属铜耐受性[0017] 图4粘着箭菌HG1‑3‑1对重金属锌耐受性[0018] 图5粘着箭菌HG1‑3‑1对重金属铜的去除率[0019] 图6粘着箭菌HG1‑3‑1对重金属锌的去除率[0020] 图7粘着箭菌HG1‑3‑1对重金属铜胁迫下含羞草根长的影响[0021] 图8粘着箭菌HG1‑3‑1对重金属铜胁迫下含羞草茎长的影响[0022] 图9粘着箭菌HG1‑3‑1对重金属铜胁迫下含羞草幼苗鲜重的影响[0023] 图10染菌组比未染菌组含羞草幼苗各指标增加的倍数[0024] 图11染菌组比未染菌组的含羞草幼苗各指标增加的量[0025] 图12粘着箭菌HG1‑3‑1对重金属锌胁迫下含羞草根长的影响[0026] 图13HG1‑3‑1对重金属锌胁迫下含羞草茎长的影响[0027] 图14粘着箭菌HG1‑3‑1对重金属锌胁迫下含羞草幼苗鲜重的影响[0028] 图15染菌组比未染菌组含羞草幼苗各指标增加的倍数[0029] 图16染菌组比未染菌组含羞草幼苗各指标增加的量具体实施方式[0030] 以下结合具体实施方式对本发明进行说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。[0031] 实施例一、细菌的分离[0032] 1.土样采集[0033] 供试土壤样品采自广东潮州韩钢(潮州市潮安县)周边河流沿岸的杂草地(116°67'E，23°64'N)。在杂草地选5个地点取样，去除土壤表面枯枝落叶和杂草，取0～10cm的土壤样品，混合均匀、过100目筛。[0034] 2.LB培养基制备[0035] 蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，培养基的pH值为7.0～7.2，琼脂20g，蒸馏水1000ml。[0036] 称取10g蛋白胨于小烧杯中，加入10ml蒸馏水调成糊状，倒入大烧杯与90ml热水混匀。分别称取其它药品，加入蛋白胨溶液中，搅拌使其溶解，加入琼脂粉及剩余的蒸馏水摇匀，pH调至7.0～7.2。加热搅拌后装到锥形瓶内，于高压蒸汽灭菌锅内121℃0.103MPa灭菌20min，培养基略冷却后倒入无菌平皿中，制成无菌平板，待用。[0037] 3.土壤稀释样液制备[0038] 称取以上混合均匀的1g土壤样品于装有玻璃珠的锥形瓶中，加99mL无菌水，振荡‑2 ‑210min后得10 的土壤悬液。取无菌试管，加入9mL无菌水，用移液枪吸取1mL10 的土壤悬液‑3 ‑4 ‑5加入试管，吹吸数次，形成10 稀释液，依次获得10 、10 土壤稀释液。[0039] 4.分离细菌[0040] 在超净台中取无菌平板多套，用移液枪各取0.2mL10‑3和10‑4土壤稀释样液转接至无菌平板，用无菌三角玻璃涂布器迅速涂匀，设置3个重复，贴好标签，置于37℃恒温箱倒置培养2‑4d。根据细菌的菌落表面湿润，密集等特征，初步鉴别细菌后，再进行二次纯化、分离和培养，获得40株细菌纯菌落。[0041] 实施例二、耐重金属Cu和Zn的菌株筛选[0042] 1.制备菌悬液[0043] 制备50mlLB液体培养基，在高压锅进行灭菌；用接种环在固体斜面上取菌一环，将40株菌分别接到液体培养基中，制成菌悬液，在摇床中以150r/min、37℃振荡培养2‑4d。[0044] 2.耐重金属Cu的菌株筛选[0045] (1)初筛配制含Cu2+浓度为250mg/L的LB培养基，以移液枪将制备得到的各种细菌菌悬液0.1ml接种到上述LB无菌平板上，以无菌三角涂布器涂布均匀，设置3组重复，于37℃恒温箱培养2‑5d，观察并选出在铜离子浓度250mg/L浓度下长势较好的细菌。[0046] (2)复筛[0047] 将初筛中筛选出6株耐受性达250mg/L的菌株进行复筛。复筛的Cu2+浓度为：0、300、2+350、400、450、500mg/L。将灭菌后浓缩一倍的重金属Cu 溶液与灭菌后的浓缩一倍的细菌培养基混合倒平板，每个处理设置三个重复。倒置于37℃的培养箱中培养2‑5d，每24h观察一2+次并记录菌的生长情况，其中筛选得到耐受重金属Cu 浓度为500mg/L的细菌2株，其中一株为细菌HG1‑3‑1。[0048] 3.耐重金属Zn的菌株筛选[0049] (1)制备含重金属Zn的LB培养基[0050] 根据预实验结果，将重金属Zn2+溶液的浓度设为：0、1400、2800、4200、5600、7000、2+8400mg/L，将灭菌后浓缩一倍的重金属Zn 溶液与灭菌后、浓缩一倍的LB培养基混合倒平板，每个处理设置三个重复。[0051] (2)耐重金属锌的菌株筛选[0052] 以移液枪将制备得到的各种细菌菌悬液1ml接种到上述含重金属Zn的LB平板上，以无菌三角涂布器涂布均匀，设置3组重复，于37℃恒温箱中倒置培养2‑5d，每24h观察一次2+并记录菌的生长情况，筛选出耐受重金属Zn 溶液浓度为30mmol/L的细菌4株，其中一株为HG1‑3‑1。[0053] 4.菌株HG1‑3‑1菌落和细胞特征[0054] 菌株HG1‑3‑1的显微照片如图1所示。细菌为短杆状近球形，菌落为光滑、粘稠、湿润的乳白色油滴状。[0055] 实施例三、菌株HG1‑3‑1的16SrDNA测序鉴定[0056] 1.实验过程[0057] (1)基因组DNA提取[0058] 采用柱式法提取，具体过程如下：[0059] 1)取2ml离心管，加入200μL预处理液和少许玻璃珠，然后加入适量菌样品，放入研磨仪中研磨至充分。[0060] 2)加入20μLProteinaseK，加入200μL裂解液，充分颠倒混匀，70℃放置10min。[0061] 3)加200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，短离心以去除管盖内壁液滴。[0062] 4)过吸附柱，洗涤液洗1次，漂洗液洗2次。[0063] 5)吸附柱室温放置3～5分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。[0064] 6)将吸附转入一个新离心管，向吸附膜中间位置悬空滴加50～100μLdd[0065] H2O，室温放置3～5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。[0066] (2)PCR扩增[0067] 16s引物序列：[0068] Primer1(27f)：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG[0069] Primer2(1492R)：TACGGYTACCTTGTTACGACTT[0070] Primer3(V4‑515F)：GTGCCAGCAGCCGCGGTAA[0071] PCR扩增反应体系：[0072] PCRMix21μL；PrimerF(5P)1μL；PrimerR(5P)1μL；DNA模板(ng/μL)2μL；总体积25μL。[0073] 反应条件：[0074] 1.96℃5min[0075] 2.96℃20sec；62℃30sec；72℃30sec；35cycles[0076] 3.72℃10min[0077] 4.4℃forever[0078] (3)PCR产物检测及纯化[0079] 3μLPCR产物进行1.0％的琼脂糖凝胶检测，观察条带性状。[0080] 电泳条件：3μL样品+1％琼脂糖凝胶，Marker条带组成：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp，3000bp，5000bp。750bp条带浓度为60ng/3μL，显示为加亮带，其余条带浓度均为30ng/3μL。电泳方向从下向上。[0081] (4)测序[0082] 将纯化后的PCR产物上机测序。测序结果进行NCBI‑BLAST比对。NCBI链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。[0083] 2.测序结果[0084] (1)琼脂糖凝胶电泳图[0085] 琼脂糖凝胶电泳图如图2所示，可见电泳孔位1对应样品HG1‑3‑1菌株；扩增引物：27F+1492R；测序引物：V4‑515F+V4‑806R。[0086] (2)基因序列[0087] 菌株HG1‑3‑1的16SrDNA序列如SEQIDNo.1所示。[0088] (3)blast结果[0089] 根据blast结果，所述菌株HG1‑3‑1与EnsiferadhaerensstrainCorn53plasmidAB亲源关系最近(100％)，因此，判定菌株HG1‑3‑1为粘着箭菌，其全称为粘着箭菌(Ensiferadhaerens)HG1‑3‑1(简称：粘着箭菌HG1‑3‑1)，将粘着箭菌(Ensiferadhaerens)HG1‑3‑1于2023年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCCNo:63303，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，电话：020‑87137633，传真：020‑87686803，E‑mail:gdmcc@gdim.cn。[0090] 应当说明的是，以下实施例中将粘着箭菌(Ensiferadhaerens)HG1‑3‑1简写为粘着箭菌HG1‑3‑1。[0091] 实施例四、粘着箭菌HG1‑3‑1对重金属铜和锌的耐受性[0092] 1.对铜的耐受性[0093] 配制含Cu2+溶液浓度为0、300、350、400、450、500mg/L的LB培养基，用移液枪将粘着2+箭菌HG1‑3‑1菌悬液0.1ml接种到上述含不同Cu 溶液浓度的LB平板上，以无菌三角涂布器2+涂布均匀，设置3组重复，于37℃恒温箱培养5d，观察并记录含不同浓度Cu 的培养基中HG1‑2+3‑1菌落生长量以及对Cu 的最大耐受浓度。[0094] 粘着箭菌HG1‑3‑1对Cu2+的耐受性如图3所示，可见，粘着箭菌HG1‑3‑1最大能够耐2+受500mg/L的重金属Cu 。[0095] 2.对锌的耐受性[0096] 配制含Zn2+溶液浓度为0、1400、2800、4200、5600、7000、8400mg/L的LB培养基，以移2+液枪将粘着箭菌HG1‑3‑1菌悬液0.1ml接种到上述含不同浓度Zn 溶液的LB平板上，以无菌2+三角涂布器涂布均匀，设置3组重复，于37℃恒温箱培养5d，观察并记录含不同浓度Zn 的培2+养基中HG1‑3‑1菌落生长量以及对Zn 的最大耐受浓度。[0097] 粘着箭菌HG1‑3‑1对重金属锌耐受性如图4所示，可见，粘着箭菌HG1‑3‑1最大能够2+耐受8400g/L的重金属Zn 。[0098] 实施例五、粘着箭菌HG1‑3‑1对重金属铜和锌的去除率[0099] 1.粘着箭菌HG1‑3‑1对重金属铜的去除率实验[0100] (1)激活粘着箭菌HG1‑3‑1：首先将粘着箭菌HG1‑3‑1在固体LB培养基上划线接种，在温度条件为37℃的培养箱里培养4d至菌苔丰满。[0101] (2)制备菌悬液：用接种环在培养丰满的菌苔上挑选一环菌落于50mL液体培养基中(100mL锥形瓶)，以150r/min、37℃摇床培养4d，装入10ml橙色离心管中，以4000rpm/min离心10min，弃去上清液，得到菌悬液。[0102] (3)铜标准溶液的制备：称取0、0.01、0.02、0.03、0.04g的CuSO4·5H2O，分别加纯净水定容至200ml，配制成浓度为0、50、100、150、200mg/L的铜标准储备液。根据火焰原子吸收光谱仪对铜的可测范围(0‑2.5μg/mL)，用1％的硝酸分别将上述铜标准储备液稀释100倍，配制为浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0(mg/L)的铜标准溶液备用。[0103] (4)铜与粘着箭菌HG1‑3‑1混合培养液的制备：将步骤(2)所述菌悬液吸取0.5ml加到浓度为0、50、100、150、200mg/L的铜溶液(50ml)中，摇床培养24h(转速为150r/min，温度2+为37℃)，得到铜与粘着箭菌HG1‑3‑1混合培养液。吸取培养24h含不同浓度Cu 的粘着箭菌HG1‑3‑1培养液，以4000rpm/min离心10min，离心2次，弃去沉淀，以0.45μg的微滤膜过滤后，2+得到滤液1ml。用1％硝酸对滤液分别稀释100倍，稀释后的混合菌液中Cu 浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0(mg/L)。取7ml稀释后的滤液于离心管中待测。离心管使用前以10％的硝酸浸泡12‑24h，用清水冲洗，再用去离子水润洗备用。[0104] (5)重金属铜去除率的测定[0105] 将步骤(3)所述Cu2+标准溶液放入火焰原子吸收光谱仪进行测定铜的含量及绘制出标准曲线，得到初始浓度。将步骤(4)所述铜和粘着箭菌HG1‑3‑1培养液(混合培养液)在火焰原子吸收光谱仪测定OD值，根据标准曲线公式及粘着箭菌HG1‑3‑1混合培养液的OD，得2+到培养24h后混合培养液中Cu 浓度，并利用以下公式计算出HG1‑3‑1对铜的去除率：[0106][0107] 结果如图5所示，在Cu2+浓度为0‑200mg/L的范围内，随着Cu2+浓度的增大，粘着箭2+ 2+菌HG1‑3‑1对Cu 的去除率呈现上升趋势；在铜浓度为200mg/L时，粘着箭菌HG1‑3‑1对Cu2+去除率仍为41.58％。表明粘着箭菌HG1‑3‑1能够去除重金属污染环境中的部分Cu 。[0108] 综上所述，本发明所请求保护的粘着箭菌HG1‑3‑1菌制备的菌剂能够耐受一定浓2+度的铜污染，并且能够有效去除环境中的Cu ；可用于重金属铜污染土壤的修复。[0109] 2.粘着箭菌HG1‑3‑1对重金属锌的去除率实验[0110] (1)激活粘着箭菌HG1‑3‑1：同本实施例1所述。[0111] (2)制备粘着箭菌HG1‑3‑1菌悬液：同本实施例1所述。[0112] (3)锌标准溶液的制备：称取0、0.02、0.04、0.06、0.08g的ZnSO4·7H2O，分别加纯净水50ml，配制成浓度为0、400、800、1200、1600mg/L的锌标准储备液。根据火焰原子吸收光谱仪对锌的可测范围(0‑0.4μg/mL)，用1％的硝酸分别将上述锌标准储备液稀释4000倍，配制为浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4(mg/L)的锌标准溶液备用。[0113] (4)锌与粘着箭菌HG1‑3‑1混合培养液的制备：将步骤(2)所述菌悬液吸取0.5ml加到浓度为0、400、800、1200、1600mg/L的锌溶液(50ml)中，摇床培养24h(转速为150r/min，温2+度为37℃)，得到锌与粘着箭菌HG1‑3‑1混合培养液。吸取培养24h含不同浓度Zn 的粘着箭菌HG1‑3‑1培养液，以4000rpm离心10min，弃去沉淀，离心2次，以0.45μm的微滤膜过滤后，得2+到滤液1ml。用1％硝酸对滤液分别稀释4000倍，稀释后的菌液中Zn 浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4(mg/L)。取7ml稀释后的滤液于离心管中待测。离心管使用前以10％的硝酸浸泡12‑24h，用清水冲洗，再用去离子水润洗。[0114] (5)重金属锌去除率的测定：[0115] 将步骤(3)所述标准溶液放入火焰原子吸收光谱仪进行测定锌的含量及绘制出标准曲线，标准曲线公式为：y＝0.0121X+0.0019，得到初始浓度。将步骤(4)所述含锌的粘着箭菌HG1‑3‑1培养液(混合培养液)在火焰原子吸收光谱仪测定OD值，根据标准曲线公式及2+粘着箭菌HG1‑3‑1混合培养液的OD，得到培养24h后Zn 浓度，并利用以下公式计算出粘着箭菌HG1‑3‑1菌对锌的去除率：[0116][0117] 结果如图6所示，粘着箭菌HG1‑3‑1在锌浓度为400‑1600mg/L的范围内，随着铜浓度的增大，粘着箭菌HG1‑3‑1对锌的去除率呈现上升趋势；在锌浓度为1600mg/L时，粘着箭菌HG1‑3‑1对锌去除率仍为45.5％。表明粘着箭菌HG1‑3‑1能够有效去除重金属污染环境中2+的Zn 。[0118] 实施例六、粘着箭菌HG1‑3‑1对受铜污染的含羞草促生作用[0119] 1.实验过程[0120] (1)种子处理先用0.1％HgCl2溶液将含羞草种子表面消毒3min,再用95％酒精进行消毒3min，在无菌操作台中用无菌水将种子冲洗5次，并用已灭菌的吸水纸将种子表面的水吸干。将含羞草种子置于75℃的温水浸泡15min取出，破除种子休眠。[0121] (2)重金属胁迫实验[0122] A.设置实验组和对照组[0123] 实验组(染菌组)：将一组含羞草种子置于无菌水中浸泡6小时，之后自然阴干1h，取出待用。实验时使用1：1的重金属+粘着箭菌HG1‑3‑1菌悬液浇灌。[0124] 对照组(未染菌组)：将含羞草种子置于无菌水中浸泡6小时，之后自然阴干1h，取出待用。实验时使用1：1的重金属+蒸馏水浇灌。[0125] B.配制铜溶液[0126] 配制浓度为0、50、100、200、300、400、500mg/L的浓缩一倍的Cu2+溶液。[0127] C.重金属铜胁迫实验[0128] 用滤纸培养皿法将实验组和对照组含羞草种子30颗放入垫有滤纸的直径为90mm培养皿中。3个重复。按照重金属：菌液(实验组)/蒸馏水(对照组)＝1:1的比例混匀，等量加2+ 2+入实验组和对照组。为避免Cu 溶液浓度被稀释，此时所配置的重金属浓度为设计Cu 浓度的两倍。加入的重金属+菌液(实验组)/蒸馏水(对照组)刚好没过滤纸为宜，盖上皿盖，将加入种子和培养液的培养皿置于温度为28℃、相对湿度50％、光照时间10h/d的智能人工气候箱中培养，保持通气良好。为避免培养皿中铜离子的浓度发生变化，每2d更换一次滤纸并重新加入重金属+菌液(实验组)/蒸馏水(对照组)的混合液。连续培养10d。每皿中随机抽取10株幼苗，测量其根长(cm)、茎长(cm)、鲜重(g)，取其平均值，3个重复。[0129] 原始数据以SPSS26.0软件进行处理分析数据，以最小差异显著法检验其差异性；以OriginPro8.0制图。[0130] 2.实验结果[0131] 如图7‑9所示，随着培养液中Cu2+浓度的升高，Cu2+对幼苗生长的毒害作用明显增2+大，幼苗根长、茎长和鲜重均随Cu 浓度的升高而下降。染菌组和未染菌组相比较(除200mg/2+ 2+ 2+LCu 浓度的根长，50、200和300mg/LCu 浓度下的茎长以外)，不同Cu 浓度下染菌组含羞2+草幼苗的根长、茎高、幼苗鲜重均显著大于未染菌组(P<0.05)。Cu 浓度为0、50、100、200、300、400、500mg/L时，染菌后的幼苗根长分别为未染菌的1.402、1.348、1.446、1.205、1.722、1.796、1.869倍(如图7所示)，茎长分别为未染菌的1.223、1.083、1.126、1.062、1.111、1.386、1.736倍(如图8所示)，幼苗鲜重分别为未染菌1.230、1.264、1.236、1.173、2+1.284、1.330、1.401倍(如图9所示)。尤其是Cu 浓度为400和500mg/L下，染菌后的幼苗根长比未染菌的分别增加了79.64％和86.95％，茎长分别增加了38.57％和73.61％，幼苗鲜重增加了32.97％和40.08％(如图10和图11所示)。[0132] 可见粘着箭菌HG1‑3‑1在一定程度上可以解除Cu2+对含羞草幼苗的胁迫，有较强促生作用。综上所述，在受铜胁迫的环境中，浸染粘着箭菌HG1‑3‑1的含羞草幼苗根长、茎长、幼苗鲜重均显著大于未染菌处理的，粘着箭菌HG1‑3‑1对含羞草幼苗生长的促生作用明显。实施例三、粘着箭菌HG1‑3‑1对受锌离子污染的含羞草促生作用[0133] 1.实验过程[0134] (1)种子处理同上述7.1。先用0.1％HgCl2溶液将含羞草种子表面消毒3min,再用95％酒精进行消毒3min，在无菌操作台中用无菌水将种子冲洗5次,并用已灭菌的吸水纸将种子表面的水吸干。将含羞草种子置于75℃的温水浸泡15min取出，破除种子休眠。[0135] (2)重金属胁迫实验[0136] A.设置实验组和对照组[0137] 实验组(染菌组)：将一组含羞草种子置于粘着箭菌HG1‑3‑1菌悬液中浸泡6小时，取出待用。[0138] 对照组(未染菌组)：将含羞草种子置于无菌水中浸泡6小时，取出待用。浸泡过程中保持与空气有接触，之后自然阴干1h。[0139] B.配制锌溶液[0140] 配制浓度为0、300、600、900、1200、1500mg/L的Zn2+溶液。[0141] C.重金属锌胁迫实验[0142] 用滤纸培养皿法将实验组和对照组含羞草种子30颗放入垫有滤纸的直径为90mm培养皿中。3个重复。按照重金属：植物营养液(模拟种子适宜生长的条件)＝1:1的比例混2+匀，等量加入实验组和对照组。为避免Zn 溶液浓度被稀释，此时所配置的重金属浓度为设2+计Zn 浓度的两倍。加入的重金属和植物营养液混合液刚好没过滤纸为宜，盖上皿盖，将加‑1入种子和培养液的培养皿置于温度为28℃、相对湿度50％、光照时间10h·d 的智能人工气2+候箱中培养，保持通气良好。为避免皿培养液Zn 溶液浓度发生变化，每2d更换一次滤纸并重新加入重金属和植物营养液的混合液。连续培养6d。每皿中随机抽取10株幼苗，测量其根长(cm)、茎长(cm)、鲜重(g)，3个重复，取其平均值。[0143] 原始数据以SPSS26.0软件进行处理分析数据，最小差异显著法检验其差异性；以OriginPro8.0制图。[0144] 2.实验结果[0145] 如图12‑14所示，随着培养液中Zn2+浓度的升高，Zn2+对幼苗生长的毒害作用明显2+ 2+增大，幼苗根长、茎长、鲜重均随Zn 浓度的升高而下降。染菌组和未染菌组相比，不同Zn2+浓度下染菌组含羞草幼苗的根长、茎高、幼苗鲜重均显著大于未染菌组(P<0.05)。Zn 浓度为0、300、600、900、1200、1500mg/L时，染菌后的幼苗根长分别为未染菌的1.178、1.401、1.294、12.187、2.325倍，茎长分别为未染菌的1.006、1.058、1122、1.146、1.391、2.007倍，幼苗鲜重分别为未染菌1.215、1.296、1.131、1.295、1.477、1.474倍(如图15所示)。尤其是2+Zn 浓度为1200和1500mg/L下，染菌后的幼苗根长比未染菌的增加了84.67％和73.34％，茎长增加了54.66％和92％，幼苗鲜重增加了1.08％和1.03％(如图16所示)。[0146] 综上所述，在受锌胁迫的环境中，浸染HG1‑3‑1的含羞草幼苗根长、茎长、幼苗鲜重均显著大于未染菌处理的，HG1‑3‑1对含羞草幼苗生长的促生作用极为明显。[0147] 综上所述，本发明所请求保护的粘着箭菌HG1‑3‑1耐受一定浓度的铜和锌污染，能够显著解除铜和锌离子对含羞草幼苗生长的不利影响，促进含羞草幼苗生长和生物量积累。同时，本发明所请求保护的粘着箭菌HG1‑3‑1菌株能够有效去除环境中的铜离子和锌离子；还具有促进植物生长的作用，为生态环境的修复提供新的途径。[0148] 合理利用微生物‑植物联合技术修复体系，可充分发挥微生物与植物效力优势，提高污染土壤修复效率。应当说明的是，本发明仅做了粘着箭菌HG1‑3‑1对受铜和锌污染环境中含羞草生长的促生作用。本领域技术人员公知，含羞草是本领域技术人员常用的模式植物，在其上可以实现的结果，在其他豆科植物(紫云英、苜蓿、菜豆、落花生等)以及常见农作物(小麦、水稻、玉米、豆类、薯类等)均可实现同样的结果。

专利地区：广东

专利申请日期：2023-05-08

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN116376781B