一株细菌在耐重金属中的应用发明专利

专利名称：一株细菌在耐重金属中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202111325085.7

专利申请（专利权）人：沈阳药科大学
权利人地址：辽宁省本溪市高新技术产业开发区华佗大街26号

专利发明（设计）人：张怡轩,赵师源,张佳怡,章朦玥

专利摘要：本发明属于微生物资源的开发与利用领域，涉及一株细菌Candidimonas sp.的应用。细菌Candidimonas sp.作为重金属耐受的植物生长促进菌中的应用。该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1.16005。所述的菌株对多种重金属具有较强的耐受作用，同时还具有促进植物种子萌发的作用。本发明使用含有该菌株的菌剂对植物种子进行浸泡，能够促进植物种子的萌发，并且能够促进重金属胁迫下的种子萌发率升高。这将为种植业的高产、稳产、优产打下坚实基础，同时也为微生物‑植物联合修复重金属污染土壤提供了较高应用价值的材料，具有广阔的应用前景。

主权利要求：
1.一株细菌在作为重金属耐受的植物生长促进菌中的应用，其特征在于：细菌Candidimonassp.作为重金属耐受的植物生长促进菌中的应用；
所述细菌Candidimonassp.的保藏编号为：CGMCCNo.1.16005。
2.一株细菌在作为促进植物种子萌发促进剂中的应用，其特征在于：细菌Candidimonassp.作为促进植物种子萌发促进剂中的应用，所述植物种子为玉米、青椒、黄瓜、三七种子。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：细菌Candidimonassp.还作为在重金属胁迫下的促进植物种子萌发促进剂中的应用，所述植物种子为印度芥菜种子。
4.一种种子促进剂，其特征在于：种子促进剂含权利要求1所述细菌。
5.根据权利要求4所述种子促进剂，其特征在于：所述种子促进剂为所述细菌的菌悬液、发酵液、发酵悬液、发酵浓缩液、发酵液分离上清液、固体发酵产物中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的种子促进剂，其特征在于：所述细菌的菌悬液为细菌复苏后母液经水重悬；发酵液为细菌经复苏后于LB培养基中发酵获得发酵液；发酵悬液为所述发酵液经水重悬。
7.根据权利要求6所述的种子促进剂，其特征在于：所述细菌复苏为取纯化后细菌Candidimonassp.用LB固体培养基进行复苏,20‑37℃培养24‑48小时，待用。
8.根据权利要求6或7所述的种子促进剂，其特征在于：所述发酵液为将复苏后菌株经液体LB培养基在28‑32℃条件下140‑180r/min发酵24h作为种液,然后按照1‑5%v/v的接种量接入LB培养基中相同条件下发酵2天，收集待用；
所述固体发酵为将上述发酵液接种到固体菌剂培养基中，20‑40℃培养，培养1‑3d后在无菌条件下进行搅拌，搅拌后继续培养1‑3d，即得。
9.一种权利要求4所述种子促进剂的应用，其特征在于：所述种子促进剂对植物种子进行浸泡或灌根处理，在促进种子萌发中的应用。
10.根据权利要求9所述的种子促进剂的应用，其特征在于：所述种子促进剂添加至有机肥中施用于土壤促进种子作物生长。 说明书 : 一株细菌在耐重金属中的应用技术领域[0001] 本发明属于微生物资源的开发与利用领域，涉及一株细菌Candidimonassp.的应用。背景技术[0002] 在过去的几十年里，农业生产者越来越依赖农用化学品作为增加产量的可靠方法，大量使用农药会增加病原体抗性和环境风险，因此，生物肥料被认为是减少农药使用的一种替代或补充方式，对发展绿色无公害农业的生产具有非常重要的意义。植物益生菌作为植物生长促进细菌(plantgrowth‑promotingbacteria，PGPB)可以直接或间接地有利于植物生长，作用包括刺激根茎生长、植物抗逆性增强、诱导抗性提升、抗致病菌、占据生态位等。作为植物生长促进细菌可具有其中的一种或几种功能，同时从土壤中分离是筛选PGPB的有效做法，然而，Candidimonas属在植物益生作用方面的研究很少被报道。[0003] 此外，随着社会经济的发展及人类活动逐渐加强，以各种化学形式存在的重金属由于在环境中不可降解，可对全球环境和人类健康产生长远的不利影响。物理法、化学法、电动修复法、热稳定技术、生物修复技术等都是治理土壤重金属污染的有效措施。其中微生物‑植物联合修复技术属于原位修复技术，其成本低、环保无污染，可大面积应用，因此是国内外研究与应用的热点。微生物可在控制重金属元素形态转化中发挥重要的作用，同时也可增强联用植物抗重金属毒性来提高植物存活率和生长速率，或促进根系发育，增大植物的重金属吸收，进而强化土壤重金属的去除效果。然而，微生物‑植物联合修复技术通常是耗时的，并且会受到修复地点环境条件的影响，因此筛选环境兼容性好、生长条件宽泛、适用植物种类多的微生物菌株显得尤为重要。在污染环境中微生物通过直接促生、提高植物抗逆性来强化植物修复能力，以达到彻底修复的目的，在重金属污染土壤的修复中显示出良好的应用前景。发明内容[0004] 本发明的目的在于提供一株细菌Candidimonassp.的应用。[0005] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：[0006] 一株细菌在作为重金属耐受的植物生长促进菌中的应用，细菌Candidimonassp.作为重金属耐受的植物生长促进菌中的应用。[0007] 一株细菌在作为促进植物种子萌发促进剂中的应用，细菌Candidimonassp.作为促进植物种子萌发促进剂中的应用。[0008] 所述细菌Candidimonassp.还可作为在重金属胁迫下的促进植物种子萌发促进剂中的应用。[0009] 一种种子促进剂，种子促进剂含所述细菌。[0010] 所述种子促进剂为所述细菌的菌悬液、发酵液、发酵悬液、发酵浓缩液、发酵液分离上清液中的一种或几种。[0011] 所述细菌的菌悬液为细菌复苏后母液经水重悬；发酵液为细菌经复苏后于LB培养基中发酵获得发酵液；发酵悬液为所述发酵液经水重悬。[0012] 所述细菌复苏为取纯化后细菌(Candidimonassp.)用LB固体培养基进行复苏,20‑37℃培养24‑48小时，待用。复苏后菌株经蒸馏水重悬获得复苏后母液，母液中使有效活8菌数大于10个/ml。[0013] 所述发酵液为将复苏后菌株经液体LB培养基在28‑32℃条件下140‑180r/min发酵24h作为种液,然后按照1‑10％(v/v)的接种量接入LB培养基中相同条件下发酵2天，菌液浓度大于OD600＝1即可结束发酵，收集待用。[0014] 或，将前述所得的菌株发酵液使用等体积乙酸乙酯萃取，收集浓缩萃取液，得菌株发酵液提取液。[0015] 所述固体发酵为将上述发酵液接种到固体菌剂培养基中，20‑40℃培养，培养1‑3d后在无菌条件下进行搅拌，搅拌后继续培养1‑3d，即得。[0016] 所述的LB培养基的配方为：蛋白胨1‑5％，酵母浸粉0.1‑5％，NaCl0.1‑3％，水1000ml；LB固体培养基的配方为：蛋白胨1‑5％，酵母浸粉0.1‑5％，NaCl0.1‑3％，琼脂1.5‑2％，水1000ml。[0017] 所述固体菌剂培养基的配方为，以g/ml计如下，麦麸20‑50％，玉米粉10‑30％，豆粉1‑10％，硝酸钾0.1‑1％，磷酸氢二钾0.1‑1％，氯化钠0.4‑0.7％，碳酸钙1‑10％，蒸馏水200ml。[0018] 一种种子促进剂的应用，所述种子促进剂对植物种子进行浸泡或灌根处理，在促进种子萌发中的应用。[0019] 所述种子促进剂可添加至有机肥中施用于土壤促进种子作物生长。[0020] 本发明所具有的优点：[0021] 本发明从中国土壤中分离、筛选到益生细菌(Candidimonassp.)菌株，该细菌具有耐受重金属作用、促进植物种子萌发等的益生作用。可作为生物肥料使用，达到提高产量和品质的目的，亦可与重金属修复植物联用，强化植物修复能力，具有成本低、对环境无污染、对人畜安全的特点。附图说明[0022] 图1为菌株CGMCCNo.1.16005基于16SrRNA与有效描述Candidimonas菌属系统发育树；[0023] 图2为菌株发酵液对植物种子萌发率的影响；[0024] 图3为菌株发酵液对植物根活力的影响；[0025] 图4为菌株菌悬液对重金属胁迫下植物种子萌发的促进作用具体实施方式[0026] 下面结合具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。[0027] 本发明所述“益生细菌Candidimonassp.”是发明人采集自新疆野芝麻根际土壤，分离纯化后，经形态学及分子生物学鉴定该菌株为Candidimonas属；该细菌16SrRNA区域的序列已提交至NCBI(GenBankaccessionNo.KY923198.1)，经16SrRNA基因比对，同源分析，鉴定该菌株属于Candidimonas属细菌，命名为益生细菌Candidimonassp.，其系统发育树参见图1。本发明所述“益生细菌(Candidimonassp.)”已在保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.1.16005，保藏日期为2017年01月18日；其可通过保藏中心进行购买获得；同时该菌株一直保藏于申请人所在的国家微生物资源平台药学微生物资源子平台，公众可向申请人所在的重点实验室购买获得，申请人承诺自本发明申请日起20年本实验室可向公众提供本发明所述的“益生细菌(Candidimonassp.)”。[0028] 本发明使用含有该菌株的菌剂对植物种子进行浸泡，能够促进植物种子的萌发，并且能够促进重金属胁迫下的种子萌发率升高。这将为种植业的高产、稳产、优产打下坚实基础，同时也为微生物‑植物联合修复重金属污染土壤提供了较高应用价值的材料，具有广阔的应用前景。[0029] 实施例1[0030] 菌株(Candidimonassp.)重金属耐受能力[0031] 重金属耐受能力测试：将菌株(Candidimonassp.)CGMCCNo.1.16005分别加入至含不同浓度的重金属(砷、铅，铬或镉)的固体LB培养基中，28℃条件下培养3‑7天，观察记录。[0032] 上述培养基中含有各重金属的不同浓度为50mg/L，100mg/L，200mg/L，300mg/L，400mg/L，500mg/L。[0033] 结果如表1所示，菌株(Candidimonassp.)CGMCCNo.1.16005对As(V)、Pb(II)、Cr(VI)、Cd(II)具有抗性，对Pb(II)、Cr(VI)具有较高的耐受能力，达到>500mg/l。[0034] 表1.菌株对重金属耐受浓度(mg/l)[0035][0036] 实施例2菌株(Candidimonassp.)对植物种子萌发的促进作用[0037] 将玉米、青椒、黄瓜、三七种子洗净，在无菌条件下，无菌水漂洗3次，无菌吸水纸吸干表面后备用。[0038] 用LB固体培养基将所述菌株(Candidimonassp.)进行复苏，28℃培养48小时，使8用蒸馏水将活化好的菌株配置成母液，使母液中有效活菌数大于10个/ml，备用；而后将母7液经无菌水重悬制备成菌悬液，菌悬液浓度为10cfu/ml。[0039] 使用上述菌悬液进行种子萌发实验，同时以蒸馏水作为对照组(CK)，备用。每组三个重复，每个重复30粒种子，每组使用菌悬液或蒸馏水20ml浸泡4h。筛网过滤得到种子，20‑25℃保湿培养，当一组萌发率达到80％时，统计植物种子萌发率、测根系活力，结果见表2‑3。根系活力测定方法为氯化三苯基四氮唑(TTC)法，参照张志良《植物生理学实验指导第三版》。[0040] 将上述复苏后的菌株(Candidimonassp.)No.1.16005用50ml的液体LB培养基在28‑30℃条件下140‑160r/min发酵24h作为种液,然后按照1％(v/v)的接种量接入LB培养基5中按照制备种液的条件发酵2天，而后经无菌水将发酵液稀释10 倍，按照上述试验步骤处理玉米、青椒、黄瓜、三七种子统计植物种子萌发率、测根系活力，结果见图2‑3。[0041] 通过以上测量指标，运用Graphpad软件进行显著性差异分析，结果如表2‑3，图2‑3所示，使用(Candidimonassp.)No.1.16005菌悬液及菌株发酵液处理过的三七及玉米种子萌发率均高于对照(CK)组，并有显著性差异，说明该菌株对植物种子萌发有促进作用。并且如表3，图3所示，该菌株的菌悬液和发酵液可以显著提高玉米及三七种子的根系活力，对植物的营养吸收起到促进作用，有促生作用。[0042] 表2.菌株Candidimonassp.No.1.16005菌悬液对植物种子萌发率(％)影响[0043][0044] 注：*，P<0.05.[0045] 表3.菌株Candidimonassp.No.1.16005菌悬液对植物根活力[μg/(g·h)]的影响[0046][0047][0048] 注：*，P<0.05.[0049] 实施例3[0050] 菌株(Candidimonassp.)促进植物种子在重金属胁迫下的萌发作用[0051] 将印度芥菜种子洗净，在无菌条件下，无菌水漂洗3次，无菌吸水纸吸干表面后备7用。使用无菌水将所述实施例2记载菌悬液(菌悬液浓度为10 cfu/ml)，以蒸馏水作为对照组(CK)，备用。每组三个重复，每个重复30粒种子，每组使用菌悬液或蒸馏水20ml浸泡3‑5h。筛网过滤得到种子，重金属胁迫组加入500mg/l的Pb(II)或Cr(VI)的溶液1ml/皿，其余组加入1ml/皿无菌水，20‑25℃保湿培养。当一组萌发率达到80％时，统计植物种子萌发率，结果见图4。在Pb(II)或Cr(VI)胁迫下，印度芥菜种子的萌发率下降，与CK组相比在500mg/l的Cr(VI)胁迫下有明显的显著性差异(P<0.01)。菌株(Candidimonassp.)No.1.16005处理印度芥菜种子后，可缓解重金属胁迫对种子的毒害作用，萌发率升高，与未加菌株的500mg/l的Cr(VI)胁迫组相比有极显著性差异(P<0.001)，说明所述菌株具有重金属胁迫下促进植物种子萌发的能力。

专利地区：辽宁

专利申请日期：2021-11-10

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN116102369B