SpCIPK2基因及蛋白在调控植物耐盐性中的应用

专利名称：SpCIPK2基因及蛋白在调控植物耐盐性中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202411353422.7

专利申请（专利权）人：海南大学三亚南繁研究院,海南大学三亚研究院
权利人地址：海南省三亚市崖州区甘农大道三亚南繁种业众创中心

专利发明（设计）人：周扬,李雨欣,王鹏,刘雯,夏海艳

专利摘要：本发明属于植物分子生物学和基因工程技术领域，具体提供SpCIPK2基因及蛋白在调控植物耐盐性中的应用，通过构建过表达载体转化到拟南芥中进行耐盐性分析，发现盐胁迫下的转基因拟南芥具有更高的鲜重，转基因植株中#imgabs0#和H2O2的积累量明显低于野生型植株，转基因植株叶片具有更低的相对电导率和更高的POD酶活性，所以SpCIPK2基因对植物耐盐性具有正向调控作用，与盐胁迫下促进Na+和K+稳态、激活抗氧化酶和清除活性氧有关，可作为植物耐盐性遗传改良的候选基因。

主权利要求：
1.SpCIPK2基因，其特征在于：所述SpCIPK2基因编码区核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.一种蛋白，其特征在于：所述蛋白的编码基因为权利要求1所述的SpCIPK2基因，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.一种生物材料，其特征在于：其中含有权利要求1所述的SpCIPK2基因或权利要求2所述的蛋白；
所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
4.权利要求1所述的SpCIPK2基因或权利要求2所述的蛋白或权利要求3所述的生物材料在调控植物耐盐性中的应用，其特征在于：所述植物为拟南芥；所述调控为提高权利要求
1所述的SpCIPK2基因或权利要求2所述的蛋白的表达，促进植物提高耐盐性。
5.一种调控植物耐盐性的方法，其特征在于：包括利用基因工程手段，在植物中促进权利要求1所述的SpCIPK2基因或权利要求2所述的蛋白的表达；所述植物为拟南芥。
6.根据权利要求5所述的调控植物耐盐性的方法，其特征在于：所述基因工程手段包括将携带有目的基因的表达载体通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射或电穿孔技术导入植物细胞中。 说明书 : SpCIPK2基因及蛋白在调控植物耐盐性中的应用技术领域[0001] 本发明涉及植物分子生物学和基因工程技术领域，尤其涉及SpCIPK2基因及蛋白在调控植物耐盐性中的应用。背景技术[0002] 土壤盐渍化是一个日益严重的全球化问题，随着土壤盐渍化问题日趋严重，盐胁迫是制约粮食生产的主要非生物胁迫因子。土壤盐分的增加会诱导离子和渗透胁迫，从而导致次生胁迫，如氧化应激和营养障碍，严重制约农业可持续发展。发明认为，维持细胞质+ +中稳定的K /Na比例对植物细胞功能至关重要。植物体内的CBL‑CIPK信号途径能够作用于+ +靶蛋白，参与调控细胞中的Na和K平衡。[0003] 海马齿（Sesuviumportulacastrum）是一种生长在滨海滩涂地的盐生植物，具有极强的耐盐性。目前已有大量的海马齿耐盐基因被报道，例如过表达果糖‑1,6‑二磷酸醛缩酶（SpFBA）能显著提高海马齿的耐盐性；例如在拟南芥中过表达海马齿甜菜碱醛脱氢酶基因SpBADH可以降低H2O2积累，提高脯氨酸含量，并激活抗氧化酶系统，促进活性氧的清除，增+ +强植物抗旱性和耐盐性。例如海马齿质膜Na/H逆转运蛋白基因SpSOS1能降低转基因酵母+ +突变体中的Na含量，增强酵母突变体的耐盐性；例如SpSOS1和H‑ATPase基因SpAHA1共表达+ +可提高拟南芥的耐盐性；例如发现Na/H逆向转运基因（SpNHX1）是响应盐胁迫的关键基因；例如在盐胁迫下，海马齿SpCBL10/SpCIPK8复合体可以提高SpSOS1的耐盐性。[0004] 尽管已有许多耐盐基因被发现，但是未发现海马齿SpCIPK2基因与植物耐盐性相关研究。发明内容[0005] 本发明从海马齿分离得到了一个调控植物耐盐性的基因SpCIPK2用于调控植物耐盐性，具体是SpCIPK2基因过表达显著增强植物对盐胁迫的耐受性，可作为植物耐盐性遗传改良的候选基因，为培育新品种提供了可能。基于此，提出如下发明内容。[0006] 第一方面，所述的SpCIPK2基因编码区核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，全长为1359个核苷酸。[0007] 所述的SpCIPK2基因的获取过程为：首先获取海马齿盐胁迫下的全长转录组和RNA‑seq数据，再从海马齿中克隆出一个CIPK基因，通过进化树分析发现其与拟南芥CIPK家族中的AtCIPK2亲缘关系较近，所以将其命名为SpCIPK2。[0008] 本发明还提供如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。[0009] 第二方面，本发明提供了所述的SpCIPK2基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，长度为452个氨基酸。[0010] 第三方面，本发明提供了一种生物材料，其中含有所述的SpCIPK2基因或其编码的蛋白；所述的生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物细胞或组织。[0011] 第四方面，本发明提供了所述的SpCIPK2基因、蛋白或所述的生物材料在调控植物耐盐性中的应用。[0012] 所述的植物为拟南芥。[0013] 通过提高所述的SpCIPK2基因或蛋白的表达或活性，促进植物提高耐盐性。[0014] 第五方面，本发明提供了所述的SpCIPK2基因、蛋白或所述的生物材料在制备转基因植物中的应用。[0015] 所述的应用包括：根据SpCIPK2基因设计克隆引物；以如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列为模板进行PCR扩增，将克隆产物与表达载体连接后，进行转化测序，然后将测序正确的序列构建过表达载体，通过农杆菌介导法转化至植物细胞获得转基因植物。[0016] 所述的过表达的方式选自（1）（3）中的一种或多种的组合，使用直接DNA转化、显~微注射、基因枪、电导和农杆菌介导中的任一方法将重组表达载体转化转入植物细胞内。[0017] （1）通过导入含有所述的基因的质粒；[0018] （2）通过将强启动子与所述的基因可操作地连接；[0019] （3）通过导入增强子。[0020] 第六方面，本发明提供了所述的SpCIPK2基因、蛋白或所述的生物材料在植物育种中的应用。[0021] 所述的育种的方式包括转基因。[0022] 第七方面，本发明提供了一种调控植物耐盐性的方法，包括利用基因工程手段，在植物中促进所述的SpCIPK2基因或蛋白的表达或活性。[0023] 所述的基因工程手段包括：将携带有目的基因的表达载体通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、或电穿孔技术导入植物细胞中。[0024] 本发明至少具有下列优点及有益效果：[0025] 首次提供了植物耐盐性调控相关SpCIPK2基因及蛋白，还通过农杆菌介导法将SpCIPK2基因表达载体转入拟南芥中，结果显示过表达SpCIPK2基因的拟南芥植株的耐盐性提高，说明该基因能够调控植物耐盐性。[0026] SpCIPK2基因及其编码的蛋白可以作为一种潜在的分子育种工具，用于改良植物耐盐性，提高植物出材量和生态效益，具有广阔的应用前景。附图说明[0027] 图1是海马齿cDNA中扩增SpCIPK2基因检测结果图，M：DL2000marker；1：SpCIPK2基因扩增产物。[0028] 图2是SpCIPK2基因鉴定结果图；[0029] A：与拟南芥AtCIPK蛋白的进化树分析对比；[0030] B：不同植物中CIPK2蛋白序列比对；[0031] C：SpCIPK2蛋白的结构域分析；[0032] D：SpCIPK2蛋白的NAF/FISL保守结构域。[0033] 图3是盐胁迫下SpCIPK2基因的表达模式；[0034] A：根中SpCIPK2基因在800mM的NaCl下的表达量变化；[0035] B：叶中SpCIPK2基因在800mM的NaCl下的表达量变化。[0036] 图4是转基因拟南芥的鉴定；[0037] M：DL2000marker；1‑22：转基因拟南芥叶片PCR鉴定；23：阳性对照；24：阴性对照。[0038] 图5是转基因拟南芥耐盐性分析；[0039] A：转基因拟南芥和野生型拟南芥在MS平板上的耐盐性分析；[0040] B：平板上生长的拟南芥鲜重测定；[0041] C：转基因拟南芥和野生型拟南芥在土壤中的耐盐性分析；[0042] D：土壤中生长的拟南芥鲜重测定；WT：野生型拟南芥；OE‑1：转SpCIPK2基因拟南芥株系1；OE‑4：转SpCIPK2基因拟南芥株系4；OE‑8：转SpCIPK2基因拟南芥株系8。[0043] 图6是转基因拟南芥在盐胁迫下的生理指标测定；[0044] A：转基因拟南芥和野生型拟南芥在盐胁迫下的组织化学染色；[0045] B：转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片相对电导率测定；[0046] C：转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片中过氧化物酶（POD）活性测定.WT：野生型拟南芥；OE‑1：转SpCIPK2基因拟南芥株系1；OE‑4：转SpCIPK2基因拟南芥株系4；OE‑8：转SpCIPK2基因拟南芥株系8。[0047] 图7是转基因拟南芥根尖Na+和K+动态变化；[0048] A：正常条件下转基因拟南芥和野生型拟南芥根尖Na+净流速；[0049] B：100mM的NaCl处理24h后转基因拟南芥和野生型拟南芥根尖Na+净流速；[0050] C：正常条件下转基因拟南芥和野生型拟南芥根尖K+净流速；[0051] D：100mM的NaCl处理24h后转基因拟南芥和野生型拟南芥根尖K+净流速；[0052] E：正常条件下转基因拟南芥和野生型拟南芥根尖Na+流速平均值；[0053] F：100mM的NaCl处理24h后转基因拟南芥和野生型拟南芥根尖Na+净流速；[0054] G：正常条件下转基因拟南芥和野生型拟南芥根尖K+净流速；[0055] H：100mM的NaCl处理24h后转基因拟南芥和野生型拟南芥根尖K+净流速；WT：野生型拟南芥；OE‑1：转SpCIPK2基因拟南芥株系1；OE‑4：转SpCIPK2基因拟南芥株系4；OE‑8：转SpCIPK2基因拟南芥株系8。[0056] 图8是转基因拟南芥叶片中的离子含量；[0057] A：转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片中的Na+含量；[0058] B：转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片中的K+含量；[0059] C：转基因拟南芥和野生型拟南芥叶片中的K+/Na+比.WT：野生型拟南芥；OE‑1：转SpCIPK2基因拟南芥株系1；OE‑4：转SpCIPK2基因拟南芥株系4；OE‑8：转SpCIPK2基因拟南芥株系8。具体实施方式[0060] 为使本发明的目的、技术发明和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0061] 若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如分子克隆实验手册，或按照制造厂商说明书建议的条件，所用原料均为市售商品。[0062] 实施例1、克隆及鉴定SpCIPK2基因。[0063] 如图1所示为利用SpCIPK2‑F和SpCIPK2‑R引物从海马齿cDNA中扩增SpCIPK2基因结果，经测序分析后，得到核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，该基因编码区全长为1359bp，编码氨基酸长度为452aa，如SEQIDNO.2所示。进化树分析发现，其与拟南芥CIPK家族中的AtCIPK2亲缘关系较近，因此命名为SpCIPK2，如图2中的A所示。序列分析发现，SpCIPK2与其他物种中的CIPK2蛋白序列均较近，相似度均在70%以上，如图2中的B所示。保守结构域分析发现，该蛋白N端含有一个激酶区，C端含有一个活性调节区，如图2中的C所示，且活性调节区包含有CIPK蛋白激酶的保守结构域NAF/FISL，如图2中的D所示，说明该蛋白属于植物中的CIPK蛋白。[0064] SpCIPK2‑F：ATGGAGAAGAAGGGAAGTTTGTTGA（如SEQIDNO.3所示）；[0065] SpCIPK2‑R：TTAATAAGCATTAACTAATTCAGTTTGC（如SEQIDNO.4所示）。[0066] 实施例2、SpCIPK2基因在盐胁迫下的表达分析。[0067] 采用荧光定量PCR技术分析了该基因在800mM的NaCl胁迫下的表达模式，根中SpCIPK2基因在800mM的NaCl下的表达量变化和叶中SpCIPK2基因在800mM的NaCl下的表达量变化如图3所示，可知在盐胁迫下，SpCIPK2基因在海马齿根和叶中均呈上调表达，且均在处理48h后达到峰值，分别为起始表达量的108和272倍。荧光定量PCR所用引物为SpCIPK2‑qRT‑F和SpCIPK2‑qRT‑R。[0068] SpCIPK2‑qRT‑F：CTTGGTTCAGGAAAGGATTAGGA（如SEQIDNO.5所示）；[0069] SpCIPK2‑qRT‑R：CAGATTGGTTGGTTTTGACAGC（如SEQIDNO.6所示）。[0070] 实施例3、SpCIPK2基因转化拟南芥。[0071] 采用SpCIPK2‑1300‑F和SpCIPK2‑1300‑R引物扩增SpCIPK2基因，构建到植物表达载体pCAMBIA1300中，利用农杆菌介导法转化拟南芥，对植株叶片进行PCR扩增，共获得22株阳性苗，如图4所示。[0072] SpCIPK2‑1300‑F：gcGTCGACATGGAGAAGAAGGGAAGTTTGTTGA（如SEQIDNO.7所示）；[0073] SpCIPK2‑1300‑R：atgGGTACCTTAATAAGCATTAACTAATTCAGTTTGC（如SEQIDNO.8所示）。[0074] 实施例4、SpCIPK2基因提高拟南芥耐盐性。[0075] 将转基因和野生型拟南芥幼苗分别移植于含有0和200mM的NaCl的1/2MS培养基上生长7d，如图5中的A所示，在0mM的NaCl培养基上拟南芥长势旺盛，叶片深绿色，而当培养基中加入200mM的NaCl时，拟南芥生长受到抑制，叶色开始发黄。在200mM的NaCl的培养基上，3个转基因植株生长状况比WT好，转基因植株的鲜重显著高于WT，如图5中的B所示。[0076] 为了进一步分析SpCIPK2基因对盐胁迫的响应，将在1/2MS培养基中生长的10天的长势一致的幼苗转移到土壤中，继续生长一个月后进行盐胁迫处理。如图5中的C所示，200mM的NaCl处理下WT表现为叶片变黄，植株萎蔫，而转基因拟南芥仍能正常生长，并且转基因拟南芥的植株鲜重显著高于WT，而在正常条件下，转基因拟南芥和WT长势无明显差异，如图5中的D所示。[0077] 实施例5、SpCIPK2基因通过清除活性氧提高耐盐性。[0078] 非生物胁迫会影响植物体内活性氧的稳态，导致活性氧的积累。采用NBT和DAB染色法分别检测盐胁迫下叶片中H2O2和 积累量。结果发现，在正常情况下，转基因植株和WT叶片均呈现轻微且均匀的染色，如图6中的A所示，表明H2O2和 含量较低。相比之下，WT和转基因植株在胁迫下的叶片染色均加深，如图6中的A所示，说明盐胁迫下植株的H2O2和 含量高于未处理植株。在盐胁迫下，转基因植株的染色比野生型植株浅，表明SpCIPK2基因可以缓解H2O2和 的积累。[0079] 同时，还测定了不同类型拟南芥叶片中相对电导率和POD活性如图6中的B和C所示。盐胁迫下，WT和转基因拟南芥相对电导率增加，但在转基因拟南芥中的相对电导率要低于野生型拟南芥，说明在盐胁迫下，转基因拟南芥叶片膜结构受损伤较小。POD活性在转基因植株中含量较高，说明转SpCIPK2基因拟南芥在胁迫后，具有较高的抗氧化酶活性，积累更多的渗透调节物质，以响应盐胁迫。[0080] 实施例6、SpCIPK2基因通过调节离子平衡提高耐盐性。[0081] 利用非损伤微测技术监测了盐胁迫下根尖伸长区Na+和K+的流动情况。在正常条件+下，转基因和野生型植株根部的Na 变化不明显，如图7中的A所示，均处于一个较低的水平，+如图7中的E所示。而在盐胁迫处理24h后，野生型拟南芥和转基因拟南芥根中Na 均表现出+较强的外排趋势，如图7中的B所示，盐胁迫下转基因拟南芥根中Na净流出率显著高于野生+型，如图7中的F所示。通过对盐胁迫前后根尖伸长区的K 净流速监测发现，在未处理前，野+生型和转基因拟南芥根中均表现出对K的吸收，如图7中的C和G所示，当对植株进行盐胁迫+ +处理后，根系均表现出对K的外排，如图7中的D所示，而且转基因植株根系外排K的量较少，如图7中的H所示。[0082] 本发明同时测定了盐胁迫前后植株中的Na+和K+含量，与流速相对应的是，正常条+ +件下野生型和转基因拟南芥植株中的Na和K含量均没有明显差异，如图8中的A和B所示。而+ +在受到盐胁迫后，所有植株中的Na含量均增加，但野生型拟南芥中的Na含量显著高于转基+ +因拟南芥，如图8中的A所示，同时所有植株中的K 含量均降低，但野生型拟南芥中的K含量+ +显著低于转基因拟南芥，如图8中的B所示，导致盐胁迫下转基因拟南芥中具有较高的K /Na比，如图8中的C所示。[0083] 本发明从盐生植物海马齿中克隆了一个新的基因SpCIPK2，首次对其耐盐功能进行研究，为盐生植物的高耐盐机制提供理论依据。基于海马齿盐胁迫下的全长转录组和RNA‑seq数据，从海马齿中克隆一个CIPK基因，命名为SpCIPK2。实时荧光定量PCR分析显示SpCIPK2基因在盐胁迫下显著上调表达。[0084] 本发明在拟南芥中验证了SpCIPK2基因的耐盐功能，可为该基因在作物耐盐分子育种中的应用奠定基础。构建植物过表达载体转化到拟南芥中进行耐盐功能分析，发现盐胁迫下的转基因拟南芥具有更高的鲜重，在盐胁迫下，转基因植株中 和H2O2的积累量明显低于野生型植株，转基因植株叶片具有更低的相对电导率和更高的POD酶活性。此外，+ + +NaCl处理后，转基因植株的Na 外排速度较快，但K外排速率低于WT，导致转基因植株Na 积+ +累较少，盐胁迫下可以维持较高的K/Na比。[0085] 研究结果表明SpCIPK2基因对植物耐盐性具有正向调控作用，且与盐胁迫下促进+ +Na和K稳态、激活抗氧化酶，清除活性氧（ROS）有关。SpCIPK2基因能够提高明显增强植物耐盐性，可作为植物耐盐性遗传改良的候选基因。[0086] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

专利地区：海南

专利申请日期：2024-09-26

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN118853706B