间充质干细胞来源的纳米微囊泡在制备治疗子痫前期的药物中的应用

专利名称：间充质干细胞来源的纳米微囊泡在制备治疗子痫前期的药物中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202110207297.9

专利申请（专利权）人：济宁医学院附属医院
权利人地址：山东省济宁市任城区古槐路89号

专利发明（设计）人：王凤鸽,张斌,满冬梅,赵柔,刘淼,魏利,梁敬,陈彦戎,魏东

专利摘要：本发明提供了间充质干细胞来源的纳米微囊泡在制备治疗子痫前期的药物中的应用，属于生物药物技术领域。本发明提供了间充质干细胞来源的纳米微囊泡在制备治疗子痫前期的药物中的应用。实验证明，从脐带间充质干细胞提取分泌的微囊泡后，用于子痫前期大鼠动物模型的治疗，hucMSC来源的微囊泡具有降低子痫前期模型鼠血压和24h蛋白尿，改善大鼠子痫前期样症状的作用，并且能够增加仔鼠重改善胎仔发育，为子痫前期疾病的治疗提供新方向。

主权利要求：
1.间充质干细胞来源的纳米微囊泡在制备治疗子痫前期的药物中的应用，所述子痫前期为L‑NAME诱导的子痫前期；
所述间充质干细胞来源的纳米微囊泡的制备方法，包括以下步骤：
1)将hucMSC体外扩增培养，待细胞汇合度达到75％～80％时收集培养上清液，去除细胞碎块后，得到MSC‑CM；所述hucMSC体外扩增培养采用无血清培养基；
2)将所述MSC‑CM去除细胞碎片和细胞器后进行超滤洗涤，收集浓缩液；
3)将所述浓缩液转移至质量浓度30％的庶糖/D2O密度垫上进行密度梯度离心，收集底部缓冲垫；所述密度梯度离心的离心力为100000g，所述密度梯度离心的时间为3h；所述密度梯度离心的温度为4℃；
4)将所述底部缓冲垫稀释洗涤后进行所述超滤洗涤，收集微囊泡浓缩液除菌得到间充质干细胞来源的纳米微囊泡；
所述步骤2)或步骤4)中所述超滤洗涤的截留分子量为100000Da；
所述药物的剂型为注射剂；在所述注射剂中，间充质干细胞来源的纳米微囊泡的浓度
11
不低于4.5×10 微粒数/0.4ml；
步骤1)中去除细胞碎块的方法包括离心；所述离心的离心力为1800～2200g，所述离心的时间为8～12min；
步骤2)中去除细胞碎片和细胞器包括差速离心；所述差速离心的离心力为1500～
2200rpm，所述差速离心的时间为15～30min；
所述间充质干细胞来源的纳米微囊泡的表面标记蛋白包括CD63和CD9。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，步骤2)或步骤4)中所述超滤洗涤采用
100000DaMWCO超滤离心管进行。 说明书 : 间充质干细胞来源的纳米微囊泡在制备治疗子痫前期的药物
中的应用技术领域[0001] 本发明属于生物药物技术领域，具体涉及间充质干细胞来源的纳米微囊泡在制备治疗子痫前期的药物中的应用。背景技术[0002] 子痫前期是妊娠期的一个严重的并发症，发病率约5％至8％，是世界范围内引起孕产妇死亡主要原因。子痫前期会导致胎儿生长受限甚至死亡。尽管子痫前期对孕妇和胎儿的健康有显著的影响，但目前尚无有效的治疗方法可以延长怀孕时间，而不会对胎儿造成不良后果。目前，终止妊娠仍是子痫前期的唯一治疗方法，导致胎儿早产和心肺不成熟等不良结局。此外，临床上最常用的治疗的药物有硫酸镁等，但长期大量应用可引起一定的副作用，并且只是从疾病的表现症状出发，主要是起到降压作用，并非从病因学角度起到治疗作用。因此，积极探索子痫前期治疗新方案并揭示其作用机理，具有重要的科学意义与临床转化价值。[0003] 近年来，间充质干细胞(MSCs)以其多能性及旁分泌能力在医学领域备受关注。但是干细胞的伦理、安全性、难以储存和运输等问题限制其临床应用。近年来，MSCs旁分泌中的重要成分微囊泡被报道广泛参与细胞侵袭与迁移、免疫调节、血管新生和组织再生等很多疾病生理及病理过程。间充质干细胞来源的微囊泡与MSCs相比具有运输方便、生物安全好和靶向性高等优点。脐带也早已被证明是MSCs分泌的微囊泡的优质来源之一，相对于其他来源的MSC分泌的微囊泡，脐带MSC分泌的微囊泡具备无伦理争议、基因稳定安全、采集方便和免疫原性低等优势。微囊泡结构是近年来发现的细胞间信号通讯的重要途径，是细胞可溶性细胞因子外的重要旁分泌形式。目前MSCs来源的微囊泡在组织损伤的修复和再生中发挥作用，主要通过传递其含有MSCs来源蛋白质、脂质、mRNA、miRNA等物质并介导旁分泌通路，是损伤组织中尚存活的细胞重新进入细胞周期，同时能通过与受损细胞释放的MVs的遗传物质的双向性交换获得组织特异性，进一步修复受损组织。然而现有技术中还没有关于MSCs来源的微囊泡能够用于治疗子癫前期的报道。发明内容[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种间充质干细胞来源的纳米微囊泡在制备治疗子痫前期的药物中的应用。[0005] 本发明提供了间充质干细胞来源的纳米微囊泡在制备治疗子痫前期的药物中的应用。[0006] 优选的，所述间充质干细胞来源的纳米微囊泡的制备方法，包括以下步骤：[0007] 1)将hucMSC体外扩增培养，待细胞汇合度达到75％～80％时收集培养上清液，去除细胞碎块后，得到MSC‑CM；[0008] 2)将所述MSC‑CM去除细胞碎片和细胞器后进行超滤洗涤，收集浓缩液；[0009] 3)将所述浓缩液转移至质量浓度30％的庶糖/D2O密度垫上进行密度梯度离心，收集底部缓冲垫；[0010] 4)将所述底部缓冲垫稀释洗涤后，进行所述超滤洗涤，收集微囊泡浓缩液除菌得到间充质干细胞来源的纳米微囊泡。[0011] 优选的，步骤1)中去除细胞碎块的方法包括离心；所述离心的离心力为1800～2200g，所述离心的时间为8～12min。[0012] 优选的，步骤2)中去除细胞碎片和细胞器包括差速离心；所述差速离心的离心力为1500～2200rpm，所述差速离心的时间为15～30min。[0013] 优选的，步骤2)或步骤4)中所述超滤洗涤采用100000Da MWCO超滤离心管进行。[0014] 优选的，步骤3)中所述密度梯度离心的离心力为100000g，所述密度梯度离心的时间为3h；所述密度梯度离心的温度为4℃。[0015] 优选的，所述间充质干细胞来源的纳米微囊泡的表面标记蛋白包括 CD63和CD9。[0016] 优选的，所述药物的剂型为注射剂；在所述注射剂中，间充质干细胞来源的纳米微11囊泡的浓度不低于4.5×10 微粒数/0.4ml。[0017] 本发明提供了间充质干细胞来源的纳米微囊泡在制备治疗子痫前期的药物中的应用。从脐带间充质干细胞提取分泌的微囊泡后，用于子痫前期大鼠动物模型的治疗，发现hucMSC具有降低子痫前期模型鼠血压和24h蛋白尿，改善大鼠子痫前期样症状的作用，并且能够增加仔鼠重改善胎仔发育。附图说明[0018] 图1为本发明分离纯化得到的hucMSC微囊泡鉴定结果；其中图1A为电子显微镜图片；图1B为hucMSC微囊泡的大小分布结果；图1C为western blot技术检测结果；[0019] 图2为PE大鼠模型造模以及hucMSC微囊泡干预流程图；[0020] 图3为判断大鼠怀孕的结果图，其中图3A为阴道栓电镜图；图3B为取阴道分泌物现场图；图3C为阴道涂片结果；[0021] 图4为成功构建PE模型大鼠的检测结果；其中图4A为大鼠24h蛋白尿水平柱形图；图4B为大鼠的血压柱形图；[0022] 图5为采用hucMSC微囊泡治疗改善PE大鼠子痫前期样症；[0023] 图6为采用hucMSC微囊泡治疗子痫前期对PE仔鼠重、窝产仔数和胎盘重的影响结果图，其中图6A为平均胎鼠重，图6B为平均胎盘重。具体实施方式[0024] 本发明提供了间充质干细胞来源的纳米微囊泡在制备治疗子痫前期的药物中的应用。[0025] 在本发明中，所述间充质干细胞来源的纳米微囊泡的制备方法，优选包括以下步骤：[0026] 1)将hucMSC体外扩增培养，待细胞汇合度达到75％～80％时收集培养上清液，去除细胞碎块后，得到MSC‑CM；[0027] 2)将MSC‑CM去除细胞碎片和细胞器后进行超滤洗涤，收集浓缩液；[0028] 3)将所述浓缩液转移至质量浓度30％的庶糖/D2O密度垫上进行密度梯度离心，收集底部缓冲垫；[0029] 4)将所述底部缓冲垫稀释洗涤后，进行所述超滤洗涤，收集浓缩液除菌得到间充质干细胞来源的纳米微囊泡。[0030] 本发明将hucMSC体外扩增培养，待细胞汇合度达到75％～80％时收集培养上清液，去除细胞碎块后，得到MSC‑CM。[0031] 在本发明中，hucMSC体外扩增培养的方法可参见现有技术(QiaoChun etal.Humanmesenchymalstemcellsisolatedfromtheumbilicalcord.CellBiolInt.2008Jan；32(1):8‑15.)。在本发明实施例中，hucMSC的购自赛业生物。所述hucMSC优选増殖能力强、状态好的健康人hucMSC，例如选择体外扩增培养第三代或第四代细胞。所述培养优选采用无血清培养基。[0032] 在本发明中，去除细胞碎块的方法优选包括离心；所述离心的离心力优选为1800～2200g，更优选为2000g；所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min。[0033] 得到MSC‑CM后，本发明将所述MSC‑CM去除细胞碎片和细胞器后进行超滤洗涤，收集浓缩液。[0034] 在本发明中，去除细胞碎片和细胞器优选包括差速离心；所述差速离心的离心力优选为1500～2200rpm，更优选为2000rpm。所述差速离心的时间优选为15～20min，更优选为20min。所述超滤洗涤优选采用100000DaMWCO超滤离心管进行。本发明对所述100000DaMWCO超滤离心管的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的的100000DaMWCO超滤离心管的来源即可。[0035] 得到浓缩液后，本发明将所述浓缩液转移至质量浓度30％的庶糖/D2O密度垫上进行密度梯度离心，收集底部缓冲垫。[0036] 在本发明中，所述密度梯度离心的离心力优选为100000g，所述密度梯度离心的时间优选为3h；所述密度梯度离心的温度优选为4℃。本发明对所述质量浓度30％的庶糖/D2O密度垫的制备没有特殊限制，采用本领域所熟知的质量浓度30％的庶糖/D2O密度垫的制备方法即可。微囊泡经过密度梯度离心沉降到底部，收集底部缓冲垫用于后续纯化。[0037] 得到底部缓冲垫后，本发明将所述底部缓冲垫稀释洗涤后，进行所述超滤洗涤，收集微囊泡浓缩液除菌得到间充质干细胞来源的纳米微囊泡。[0038] 在本发明中，所述稀释洗涤的溶液优选为7.4值的PBS缓冲液。用PBS缓冲液稀释底部缓冲垫的倍数优选为2～10倍，更优选为10倍。[0039] 在本发明中，所述超滤洗涤优选将得到的稀释液转移至100000Da MWCO超滤离心管中，收集微囊泡浓缩液。所述除菌优选采用滤膜过滤除菌；所述滤膜的孔径优选为0.22μm。[0040] 在本发明中，优选对得到的间充质干细胞来源的纳米微囊泡进行鉴定。所述鉴定包括基本形态鉴定和表面标记蛋白的鉴定。所述基本形态鉴定包括透射电镜观察分离纯化的纳米微囊泡。由透射电镜图片表明，所述微囊泡呈典型的囊泡结构，粒径为100nm左右。所述表面标记蛋白的鉴定优选采用westernblot技术检测。所述westernblot技术检测的蛋白优选包括CD63和CD9和阴性标记物Calnexin。结果表明，本发明分离纯化得到的间充质干细胞来源的纳米微囊泡的表面标记蛋白优选包括CD63、CD9和Calnexin。[0041] 在本发明中，所述药物的剂型优选为注射剂；在所述注射剂中，间充质干细胞来源11的纳米微囊泡的浓度优选不低于4.5×10 微粒数/0.4ml。[0042] 在本发明中，通过构建子痫前期大鼠模型，将分离纯化得到的间充质干细胞来源的纳米微囊泡分别进行低剂量和高剂量治疗，通过测定大鼠的尿蛋白水平和血压，结果表明，高剂量的hucMSC微囊泡能显著降低大鼠血压和24h蛋白尿水平，而低剂量的hucMSC微囊泡能显著降低大鼠血压，但是24h尿蛋白水平统计学差异不显著，仅表现出下降趋势。同时本发明还评估hucMSC微囊泡的治疗对胎儿及胎盘重量影响，结果表明，高低剂量治疗组均能增加仔鼠平均重，高剂量治疗组能够增加平均胎盘重量，改善胎儿发育结局。[0043] 下面结合实施例对本发明提供的间充质干细胞来源的纳米微囊泡在制备治疗子痫前期的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0044] 实施例1[0045] hucMSC微囊泡(MVC)的获得方法[0046] 1.主要材料和来源分别如下：[0047] 1.1试剂：低糖DMEM、胰蛋白酶(Sigma公司产品)、胎牛血清(Gibco公司产品)、无血清培养基(上海依科赛公司)、微囊泡提取试剂：重水(D2O，上海创赛公司)，分析纯蔗糖(广州化学试剂厂)，兔抗人CD9抗体(美国BioworldTechnology公司)、兔抗人CD63抗体(美国Epitomics公司)、兔抗人Calnexin抗体(美国abcam公司)、BCA蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(北京康为世纪公司)，HRP化学发光底物；[0048] 1.2仪器设备与耗材：二氧化碳培养箱(Forma公司)；台式梯度离心机、电子显微镜、倒置显微镜、生物显微镜、超净工作台、100‑kDaMWCO超滤离心管、0.22μm无菌滤膜(美国Millipore公司)、透射电子显微镜(FEITecnai 12，Philips公司)、滤膜。[0049] 2.实验方法[0050] (1)hucMSC的分离培养：[0051] 按本课题组早前建立的hucMSC分离培养及鉴定方法体外培养扩增MSC(QiaoChunetal.Humanmesenchymalstemcellsisolatedfromtheumbilicalcord.CellBiolInt.2008Jan；32(1):8‑15)，选择増殖能力强，状态好的健康人hucMSC(第三代或第四代)，生长面积覆盖80％后无血清培养基，收集培养上清液，2000g/10min离心也除去细胞碎片后即为hucMSC‑CM，﹣80℃保存并用于微囊泡的提取。[0052] (2)脐带间质干细胞微囊泡的分离纯化：[0053] 将收集的hucMSC‑CM经差速离也除去细胞碎片及细胞器后移至15mL规格的100000DaMWCO超滤离心管中浓缩，将浓缩液移至5ml浓度为30％的庶糖/D2O密度垫上，在4℃条件下，100000g离心3h，收集底部5ml的缓冲垫(含微囊泡)用PBS稀释洗涤后，置入100000DaMWCO超滤离心管中洗涤，最后将收集的微囊泡浓缩液定量，用0.22μm滤膜过滤除菌，Nanosigt法测定胞微囊泡的微粒数并分装，于﹣80℃冷藏备用。[0054] (3)脐带间质干细胞微囊泡鉴定[0055] 透射电镜观察上述分离纯化得到的脐带间充质干细胞微囊泡的基本形态，具体方法如下：脐带间充质干细胞微囊泡20μL，充分混匀后滴加于直径2mm的载样铜网上，于室温静置5min后，用滤纸轻轻吸去铜网边缘残余液体，然后将铜网倒扣于30g/L磷钨酸(pH6.8)液滴上，室温下负染5min，最后将铜网在白炽灯下烘干，置于透射电镜下观察并拍照，结果如附图1‑A所示。[0056] 采用westernblot技术检测所述微囊泡表面标记蛋白，具体方法如下：配制12％SDS‑PAGE电泳胶，将上述提取的微囊泡充分裂解后加入1/4体积的5×SDS上样缓冲液，煮沸5min，按200μg蛋白质总量上样，电转移(350mA，120min)将蛋白质转至PVDF膜上，用含50g/L脱脂牛奶的TBS/T室温封闭1h，分别与兔抗人CD9抗体和兔抗人CD63抗体(1:500)于4℃反应过夜，次日用TBS/0.5％Tween20洗膜3次后，与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗37℃温育1h)，TBS/0.5％Tween20洗膜3次后，加入预混HRP化学发光底物，并通过化学发光凝胶成像系统进行检测，如附图1C所示，脐带来源的微囊泡的标记蛋白的表达。[0057] 实施例2[0058] 子痫前期大鼠模型的构建方法[0059] 1.材料和试剂：10周龄健康SD雌性大鼠(200～250g)和雄性大鼠(200～250g)购自济南朋悦实验动物有限公司，普通饲料(济南朋悦实验动物有限公司)，一次性注射器，L‑NAME，生理盐水，大鼠代谢笼，全自动生化分析仪(Roche，瑞士)和全自动无创血压监测仪(中国北京Softron公司)等。[0060] 2.实验方法(步骤见图2)：[0061] 大鼠子痫模型的构建：10周龄健康SD雌性大鼠和雄性大鼠喂养1周为它们适应环境后进行编号并于晚上8h按照雌雄比例2:1左右进行进行合笼。第二天早晨7点分离雌雄鼠后，检查阴道栓。如果看到阴道栓则(图3A)视为怀孕第一天。在看不到阴道栓的情况下取阴道分泌物(图3B)进行阴道涂片观察精子及上皮细胞(图3C)。如果载玻片上有精子，则这一天被认为是怀孕的第一天。[0062] 将怀孕的大鼠随机分为2组：正常对照组(Control)、PE模型组；在妊娠第7天到19天对PE模型组、高浓度微囊泡组和低浓度微囊泡组鼠腹腔注射L‑NAME(亚硝基左旋精氨酸甲酯)，250mg/kg/d。在妊娠第7天到19天对正常对照组腹腔注射生理盐水。并用BP2010全自动无创血压监测仪监测妊娠第6天(注射L‑NAME前一天)、第10天和第13天的血压。在妊娠第6天(注射L‑NAME前一天)、第10天和第13天，用全自动生化分析仪测定大鼠24小时尿蛋白水平。[0063] 结果表明，模型组血压比正常组升高的数值大于30mmHg(图4A)，24小时尿蛋白水平显著升高(图4B)。以上结果表明PE模型大鼠构建成功。[0064] 实施例3[0065] hucMSC微囊泡对子痫前期大鼠的治疗效果评估[0066] 1.所需材料和试剂：一次性注射器，hucMSC微囊泡,生理盐水，大鼠代谢笼，全自动生化分析仪，全自动无创血压监测仪，戊巴比妥钠，剂量天平。[0067] 2.实验方法[0068] HucMSC微囊泡的治疗步骤及效果评估：[0069] 设置四个分组：[0070] 对照组：14开始尾静脉注射生理盐水，0.4ml/大鼠/天，共6天；[0071] PE组：第14天开始尾静脉注射生理盐水，0.4ml/大鼠/天，共计6天生理盐水；[0072] 低浓度微囊泡组(PE+L‑MVS)：从第14开始每次尾静脉注射量(0.4ml)为2.25×1110 微粒数的微囊泡悬液，0.4ml/大鼠/天，共6天；[0073] 高浓度微囊泡组(PE+H‑MVS)：从第14开始每次尾静脉注射量(0.4ml)为4.5×1011微粒数的微囊泡悬液，0.4ml/大鼠/天，共6天。[0074] 1)分别监测妊娠第16和19天血压及24小时尿蛋白水平。[0075] 结果见表1和图5。[0076] 表1各实验组和对照组中大鼠的血压和蛋白尿检测结果[0077][0078] 注：所有数据均以“均值±标准差”表示，表中同行不同字母表示差异达到0.01的显著水平。[0079] 结果表明，高剂量的hucMSC微囊泡能显著降低大鼠血压和24h蛋白尿水平，低剂量的hucMSC微囊泡能显著降低大鼠血压但是24h尿蛋白水平统计学差异不显著，但是有下降趋势。[0080] 2)HucMSC微囊泡的治疗对胎儿及胎盘重量以影响效果观察评估：[0081] 大鼠麻醉后使用3％戊巴比妥钠溶液，待麻醉好后，立即行剖宫产术取出胎儿和胎盘，缝合子宫和腹部，计数正常大小的胎儿和胎盘。取下胎盘上的胎膜和脐带后，切断连接胎儿的脐带，将胎儿和胎盘放在无菌纱布上，吸干血液和羊水。随后，在分析天平上分别称重胎儿和胎盘。[0082] 结果见表2和图6。[0083] 表2胎鼠和胎盘的重量[0084] Control PE PE+L‑MVS PE+H‑MVSa b a a胎鼠重(g) 3.006±0.103 2.635±0.245 2.932±0.086 2.981±0.058a b ab a胎盘重(g) 0.453±0.051 0.351±0.046 0.389±0.038 0.429±0.051[0085] 注：所有数据均以“均值±标准差”表示，表中同行不同字母表示差异达到0.05的显著水平。[0086] 结果表明，高低剂量治疗组均能增加仔鼠平均重，高剂量治疗组能够增加平均胎盘重量，改善胎儿发育结局。[0087] 由上述实施例结果可知，采用HucMSC微囊泡治疗子痫前期疾病，不仅能改善怀孕母体的血压和尿蛋白指标，而且对胎儿的体重和胎盘重量有明显提高，且能提高胎儿发育状况。[0088] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

专利地区：山东

专利申请日期：2021-02-24

专利公开日期：2024-11-22

专利公告号：CN114081900B