一种具备双重响应性的纳米药物Zn-AIP-RES-ICG的制备和应用

专利名称：一种具备双重响应性的纳米药物Zn-AIP-RES-ICG的制备和应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202411206183.2

专利申请（专利权）人：山东第二医科大学
权利人地址：山东省潍坊市潍城区宝通西街7166号

专利发明（设计）人：马金龙,马兰,张羽中,范国娟,张维芬

专利摘要：本发明公开了一种具备双重响应性的纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG的制备和应用，属于纳米药物领域，首先，基于光引发剂2,2'‑氮杂双(2‑咪唑啉)二盐酸盐去除盐酸后产生的AIP和含锌物质制备纳米片Zn‑AIP，所述纳米片Zn‑AIP具有双重pH值和热响应性；然后所述纳米片Zn‑AIP通过负载RES和光热剂ICG，制得纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG，同时实现抑菌和伤口愈合。作为药物释放载体时pH响应性赋予了材料强大的释放能力，使其能更快地释放药物用于伤口愈合并溶解Zn2+起到抗菌作用，此外在一定温度下，Zn‑AIP的有机配体也会分解产生自由基，从而使材料进一步抗菌。本发明所述Zn‑AIP‑RES‑ICG，Zn‑AIP纳米片弥补了白藜芦醇的抗菌能力不足的问题，这使其成为治疗烧伤创面的最佳候选者，并为治疗烧伤提供了新的思路。

主权利要求：
1.一种具备双重响应性的纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG的制备方法，其特征在于，首先，基于光引发剂2,2'‑氮杂双(2‑咪唑啉)二盐酸盐去除盐酸后产生的AIP和硝酸锌制备纳米片Zn‑AIP；然后所述纳米片Zn‑AIP通过负载白藜芦醇和吲哚菁绿，制得纳米药物Zn‑AIP‑白藜芦醇‑吲哚菁绿，记为Zn‑AIP‑RES‑ICG。
2.根据权利要求1所述的一种具备双重响应性的纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）Zn‑AIP的合成：用一锅合成，将硝酸锌溶于水中，配制成溶液，将AIP在甲醇中溶解制成AIP溶液，将硝酸锌溶液和AIP溶液混合，加入水中，搅拌，离心，洗涤收集沉淀，冷冻、干燥；
（2）Zn‑AIP‑RES的合成：将白藜芦醇溶液加入制备的Zn‑AIP溶液中，在室温下搅拌，直至出现丁达尔现象；
（3）Zn‑AIP‑RES‑ICG的合成：将制备的Zn‑AIP‑RES以8000rpm离心20‑30min，除去上清液，加入吲哚菁绿溶液和去离子水，搅拌过夜。
3.根据权利要求2所述的一种具备双重响应性的纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，采用的离心转速为8000rpm，10‑20min；配制的硝酸锌溶液和AIP甲醇溶液的浓度为100‑200mM。
4.根据权利要求2所述的一种具备双重响应性的纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，白藜芦醇溶液的溶剂是水，白藜芦醇溶液浓度为500‑700μg/mL。
5.根据权利要求2所述的一种具备双重响应性的纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，吲哚菁绿溶液浓度为1‑5mg/mL。
6.一种具备双重响应性的纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG，其特征在于，采用权利要求1‑5任一项所述制备方法制得。
7.权利要求6所述的具备双重响应性的纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG在制备抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌功能的药物的应用。
8.权利要求6所述的具备双重响应性的纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG在制备治疗烧伤伤口愈合药物的应用。 说明书 : 一种具备双重响应性的纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG的制备和
应用技术领域[0001] 本发明属于纳米药物领域，具体涉及一种具备酸响应性和热响应性的负载白藜芦醇（RES）和吲哚菁绿（ICG）的纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG的制备和应用。背景技术[0002] 皮肤是人体最大的器官。它是身体与外界接触的部分，约占体重的16%。它也是人体抵抗外部物理、机械和化学伤害以及病原微生物攻击的第一道防线。因此，如果发生事故，皮肤不可避免地会首先受到损害，例如电蒸汽，化学和热损伤。严重烧伤可能会引起许多后果，如微生物感染、氧化应激、炎症、代谢紊乱等，并对患者的心理健康和正常生活产生很大影响。在严重的情况下，它可能导致患者死亡。烧伤后的伤口愈合具有非常复杂的分子机制，需要成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞和生长因子，以及外部环境相互作用。因此，伤口愈合所需的药物不仅要能促进细胞增殖，加速伤口愈合，还要在炎症期起到抗炎作用，抑制细菌生长。目前，磺胺嘧啶银等银离子敷料常应用在临床治疗中进行治疗。然而，一些报告表明，其中所含的银离子会产生细胞毒性。因此，需要一种兼具伤口愈合、安全性和抗菌能力的新型材料来治疗烧伤伤口。发明内容[0003] 本发明的目的是解决上述背景技术中的问题，提供一种具备双重响应性的新的纳米材料Zn‑AIP的制备方法以及负载RES和ICG的Zn‑AIP‑RES‑ICG纳米药物。基于光引发剂AIPH（2,2'‑氮杂双(2‑咪唑啉)二盐酸盐）去除盐酸后产生的AIP和含锌物质制备了一种纳米片Zn‑AIP。Zn‑AIP纳米片是具有双重pH值和热响应性的纳米材料，它不仅可以在酸性条件下破裂，还可以在热环境（40°C）下破裂。并通过负载了RES和光热剂ICG，可同时实现抑菌和伤口愈合。[0004] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：[0005] 一种同时具备热响应性和pH响应性的负载白藜芦醇（RES）和吲哚菁绿（ICG）的纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG的制备方法，包括以下步骤：[0006] （1）Zn‑AIP的合成：用一锅合成，将硝酸锌溶于水中，配制成溶液，将AIP在甲醇中溶解制成AIP溶液。将硝酸锌溶液和AIP溶液混合，加入水中，搅拌，离心，洗涤收集沉淀，冷冻、干燥。[0007] （2）Zn‑AIP‑RES的合成：将RES溶液加入制备的Zn‑AIP溶液中，在室温下搅拌，直至出现丁达尔现象。[0008] （3）Zn‑AIP‑RES‑ICG的合成：将制备的Zn‑AIP‑RES以8000rpm离心20‑30min，除去上清液，加入ICG溶液和去离子水，搅拌过夜。[0009] 所述步骤（1）中，采用的离心转速为8000rpm，10‑20min。[0010] 所述步骤（1）中，配制的硝酸锌溶液和AIP甲醇溶液的浓度为100‑200mM。[0011] 所述步骤（2）中，RES溶液的溶剂是水。RES溶液浓度为500‑700μg/mL。[0012] 所述步骤（3）中，ICG溶液浓度为1‑5mg/mL。[0013] 所述同时具备热响应性和pH响应性纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG在制备抗菌功能的药物的应用。[0014] 所述同时具备热响应性和pH响应性纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG在制备治疗烧伤伤口愈合药物的应用。[0015] Zn‑AIP纳米片是具有双重pH值和热响应性的纳米材料，它不仅可以在酸性条件下破裂，还可以在热环境（40°C）下破裂，在此温度下，Zn‑AIP的有机配体会分解产生自由基，从而使材料获得强抗菌能力。[0016] 根据该纳米材料的酸响应性可使白藜芦醇在Zn‑AIP响应性破裂后释放出来进行2+伤口愈合，并溶解Zn 起到抗菌作用，因此该纳米材料可兼具抗菌和治疗功能。[0017] 本发明的有益效果：[0018] （1）本发明方法首先制备了纳米片Zn‑AIP，再通过一锅法，制备出纳米药物Zn‑AIP‑RES‑ICG，该纳米片的粒径为200nm左右。[0019] （2）本发明制备方法简单，制备的纳米材料同时具备热响应性与pH响应性。为本领域提供了一种具备多种功能的载体材料，而将白藜芦醇和吲哚菁绿负载于Zn‑AIP之上后合成的Zn‑AIP‑RES‑ICG成为了一种能够用于伤口愈合的纳米药物。[0020] （3）本发明方法制备的纳米材料同时具备热响应性与pH响应性。作为药物释放载体时pH响应性赋予了材料强大的释放能力，使其能更快地释放药物用于伤口愈合并溶解2+Zn 起到抗菌作用，除此之外，在一定温度下，Zn‑AIP的有机配体也会分解产生自由基，从而使材料进一步抗菌。而本发明所述Zn‑AIP‑RES‑ICG，Zn‑AIP纳米片弥补了白藜芦醇的抗菌能力不足的问题，这使其成为治疗烧伤创面的最佳候选者，并为治疗烧伤提供了新的思路。附图说明[0021] 图1为Zn‑AIP纳米片的TEM和TEMmapping图像；[0022] 图2为Zn‑AIP‑RES‑ICG的表征数据；（a）、（b）、（c）对应Zn‑AIPXPS光谱的Zn2p、N1s和C1s峰；（d）RES，ICG，Zn‑AIP‑RES和Zn‑AIP‑RES‑ICG的紫外吸收峰；[0023] 图3为合成的Zn‑AIP和Zn‑AIP‑RES‑ICG纳米粒子以及RES的XRD结果；[0024] 图4为Zn‑AIP‑RES‑ICG在40℃以及酸性条件下的形貌；[0025] 图5为PBS，40℃‑NIR，RES，Zn‑AIP，Zn‑AIP‑RES，Zn‑AIP‑RES‑ICG，Zn‑AIP‑ICG‑NIR，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR处理过的细胞活/死染图像；[0026] 图6为PBS，40℃‑NIR，RES，Zn‑AIP，Zn‑AIP‑RES，Zn‑AIP‑RES‑ICG，Zn‑AIP‑ICG‑NIR，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR处理过的细菌平板计数图像；[0027] 图7为PBS，40℃‑NIR，RES，Zn‑AIP，Zn‑AIP‑RES，Zn‑AIP‑RES‑ICG，Zn‑AIP‑ICG‑NIR，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR处理过的细菌TEM图像；[0028] 图8为0，3，7，14天的小鼠伤口图像；[0029] 图9为0，3，7，14天小鼠伤口染色切片H&E染色图像；[0030] 图10为0，3，7，14天小鼠伤口染色切片马森三色(MT)图像；[0031] 图11为0，3，7，14天小鼠伤口染色切片天狼星红染色图像。具体实施方式[0032] 以下对本发明的优选实施例结合附图进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。[0033] 实施例1[0034] Zn‑AIP的合成：采用一锅法合成，将3g五水合硝酸锌溶于水中制备成100mL的浓度为100mM的溶液，将2.5gAIP溶于100mL甲醇中制成浓度为100mM的AIP溶液，将硝酸锌溶液和AIP溶液分别各取2mL加入到50mL水中，搅拌1h，在8000rpm下离心10min，洗涤并收集沉淀，冻干。[0035] 实施例2[0036] Zn‑AIP‑RES的合成：将RES溶液（500μg/mL，0.3mL）添加到实施例1制备的Zn‑AIP溶液中，并在室温下搅拌直至出现丁达尔效应。[0037] 实施例3[0038] Zn‑AIP‑RES‑ICG的合成：将实施例2制备的Zn‑AIP‑RES在8000rpm下离心20min，除去上清液，加入ICG溶液（1mg/mL，3mL）和去离子水（3mL），搅拌过夜。[0039] 实施例4[0040] 实验方法：使用紫外分光光度计（UV‑1700；日本京都）检测Zn‑AIP，Zn‑AIP‑RES，Zn‑AIP‑RES‑ICG的光谱扫描数据，分别在透射电子显微镜（JEOLJEM2100F）和扫描电子显微镜下（捷克TESCANMIRALMS）下观察样品形貌并记录。使用X射线光电子能谱仪（X射线光电子能谱仪（美国ThermoScientificK‑Alpha）对ZIF‑Zn进行分析，最后使用X射线衍射仪（日本RigakuD/MAX‑2600）对Zn‑AIP，Zn‑AIP‑RES，Zn‑AIP‑RES‑ICG的晶体结构进行了表征。最后使用扫描电子显微镜（捷克TESCANMIRALMS）观察样品在40℃以及酸性条件下的形貌并记录。[0041] 实验结果：通过TEM（图1）观察纳米片的形貌，可以看到成功合成了Zn‑AIP纳米片，并且TEMmapping成像显示C、N和Zn元素均匀分布在纳米颗粒中，进一步证实了Zn‑AIP的成功形成。通过XPS进一步证实了Zn‑AIP纳米粒的合成，Zn‑AIP的XPS光谱显示对应于Zn2p（图2a）、N1s（图2b）和C1s（图2c）的峰。而这种曲线也表明我们成功制备了Zn‑AIP。之后我们对Zn‑AIP‑RES‑ICG进行了表征，（图2d）紫外数据显示白藜芦醇的最大吸收峰在306nm，而Zn‑AIP‑RES和Zn‑AIP‑RES‑ICG在306nm出同样有吸收峰，并且吲哚菁绿的吸收峰为781nm处，Zn‑AIP‑RES‑ICG在781nm处同样有吸收，这表明成功合成了Zn‑AIP‑RES‑ICG。（图3）显示了合成的Zn‑AIP和Zn‑AIP‑RES‑ICG纳米粒子以及RES的XRD结果，可以看到Zn‑AIP包被后RES的特征峰消失，表明RES包被成功。（图4）的SEM图像，可以看到经过40℃和酸处理后的纳米片结构遭到了破坏，证实了本文所述材料的热响应性和酸响应性。[0042] 实施例5[0043] 实验方法：将L929细胞以每孔5000‑8000个的密度接种于含有100mLDMEM培养基的96孔板中。培养24h后，分别用PBS，40℃‑NIR，RES，Zn‑AIP，Zn‑AIP‑RES，Zn‑AIP‑RES‑ICG，Zn‑AIP‑ICG‑NIR，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR处理细胞，并以未做任何处理的细胞作为对照组。药物作用24h后。每孔细胞中加入100μLAM/PI，充分混匀，避光孵育20min。在荧光显微镜下于490nm处同时检测活细胞（发绿色荧光）和死细胞（发红色荧光）。[0044] 实验结果：如图5所示，活/死染色分析显示，PBS，40℃‑NIR，RES，Zn‑AIP，Zn‑AIP‑RES，Zn‑AIP‑RES‑ICG，Zn‑AIP‑ICG‑NIR，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR都对细胞无杀伤。[0045] 实施例6[0046] 实验方法：使用在Luria−Bertani(LB)培养基中培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球8菌和铜绿假单胞菌评估了材料的抗菌能力。首先，将菌液（10CFU/mL，900μL）与PBS，40℃‑NIR，RES，Zn‑AIP，Zn‑AIP‑RES，Zn‑AIP‑RES‑ICG，Zn‑AIP‑ICG‑NIR，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR在摇菌管中混合，将其置于37°C摇床中，以110rpm/min摇动12h。然后用PBS（pH7.4）将菌液5稀释至10CFU/mL，滴加60μL至平板中，用涂布棒涂匀，置于37°C培养箱中，倒置培养24h。最后对平板进行拍照，通过ImageJ对菌落进行计数，计算药物的抗菌率。[0047] 实验结果：结果如图6所示，与对照组相比，40℃‑NIR，RES组对细菌几乎没有杀灭作用，而Zn‑AIP，Zn‑AIP‑RES，Zn‑AIP‑RES‑ICG组的细菌菌落数量明显减少，Zn‑AIP‑ICG‑2+NIR，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR菌落几乎全部消失，推测其抗菌效果主要归功于中Zn 和光热升温后产生的自由基的抗菌能力，同时根据细菌菌落数计算药物的抗菌率。RES处理组的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的存活率约为90%，而Zn‑AIP，Zn‑AIP‑RES，Zn‑AIP‑RES‑ICG组的存活率高于40%，Zn‑AIP‑ICG‑NIR，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR组的存活率低于5%。[0048] 实施例7[0049] 实验方法：采用透射电子显微镜（TEM）来观察并记录不同材料处理后细菌的完整性。将PBS，40℃‑NIR，RES，Zn‑AIP，Zn‑AIP‑RES，Zn‑AIP‑RES‑ICG，Zn‑AIP‑ICG‑NIR，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR与菌液共同孵育12h，离心（500rpm，5min）后，收集细菌并用2.5%戊二醛溶液固定。在TEM下观察细菌的形态变化。[0050] 实验结果：结果如图7所示，Zn‑AIP‑ICG‑NIR，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR处理后的细菌基本形态被完全破坏，内容物流出。[0051] 实施例8[0052] 实验方法：首先，给小鼠腹腔注射10%戊巴比妥溶液（10mg/mL），并剃除背部毛。然6后，用直径10mm的金属棒（100℃）接触小鼠背部10s。随后，将金黄色葡萄球菌（10CFU/mL，50μL）施用于伤口。感染后24h，用各组相应的材料覆盖烧伤部位，并用近红外辐射Zn‑AIP‑ICG‑NIR，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR组。未治疗组用作对照组。在0，3，7，14天对所有伤口进行测量。[0053] 实验结果：如图8所示，炎症期（1 3天）各组伤口大小无明显变化，而在伤口愈合~期，Zn‑AIP，Zn‑AIP‑RES，Zn‑AIP‑RES‑ICG组的愈合有一定进展，伤口面积有所减少，而Zn‑AIP‑ICG‑NIR，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR则更进一步，与PBS，40℃‑NIR，RES组相比，伤口愈合面积显著增加。[0054] 实施例9[0055] 实验方法：在设定时间点（0，3，7，14天）采集皮肤和器官样本，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成3mm切片。进行苏木精和伊红(H&E)和马森三色(MT)以及天狼星红染色以评估血管生成、肉芽组织形成和皮肤组织的胶原含量。[0056] 实验结果：如图9‑11所示，从H&E染色（图9）可以看到对照组和RES组在第3天、第7天都出现了严重的炎症反应，主要是由细菌感染引起的。然而，Zn‑AIP，Zn‑AIP‑RES，Zn‑AIP‑RES‑ICG，Zn‑AIP‑ICG‑NIR，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR组的伤口炎症程度较低，这可能是由于锌离子具有良好的消炎作用。随着伤口修复的进展，Zn‑AIP‑ICG‑NIR，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR组在第7天的炎症浸润较少，并且可以看到Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR组形成了与健康皮肤非常相似的上皮层，具有清晰可见的再生结构，而其他组的伤口尚未完全愈合。最后，在第14天，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR组出现了新的毛囊。[0057] 马森三色染色（MTC）结果如（图10）所示，随着治疗的进行，各组胶原蛋白的含量逐渐增加，可以看出对照组和RE胶原纤维发育不全，排列疏松，与创面方向平行，而此时Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR组中形成的胶原纤维相对成熟，胶原网络拓扑规则定向并呈带状排列。这表明Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR组的上皮再生过程更快、更成熟。[0058] 天狼星红染色结果如（图11）所示，治疗前（第0天）各组胶原蛋白短而有序排列。治疗后第3天，各组分布的胶原纤维增厚，不同程度增加。与其他组相比，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR组的胶原分布更广一些。治疗后第7天，与其他相比，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR组的胶原蛋白更均匀、更致密，而且与其他组不同，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR的胶原蛋白开始逐渐呈胶原线束分布。治疗后第14天，与其它组相比，Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR组胶原形态较粗，并且非常均匀。上述结果表明Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR组能够减轻炎症反应，促进血管修复、毛囊再生和皮肤组织重建，快速恢复皮肤再生的健康微环境。[0059] 这些结果表明Zn‑AIP‑RES‑ICG‑NIR为促进伤口愈合提供了重要线索，使其成为临床应用于三度烧伤的有希望的候选者。

专利地区：山东

专利申请日期：2024-08-30

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118717977B