一种可延缓端粒磨损的酪蛋白来源活性肽及其应用和一种含该活性肽的药物

专利名称：一种可延缓端粒磨损的酪蛋白来源活性肽及其应用和一种含该活性肽的药物

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202411161031.5

专利申请（专利权）人：四川大学华西第二医院
权利人地址：四川省成都市人民南路3段20号

专利发明（设计）人：成果,张林,张伶俐

专利摘要：本发明提供了一种可延缓端粒磨损的酪蛋白来源活性肽及其应用和一种含该活性肽的药物，属于生物活性肽技术领域。本发明从发酵法制备的酪蛋白水解物中筛选了一条序列为FVAPFPE的活性肽，该活性肽经口摄入后可稳定入脑，并具有抗炎、抗氧化、保护端粒磨损的功效。该活性肽可以延缓衰老，有望用于预防和/或治疗与衰老有关的疾病，具有良好的临床应用前景。

主权利要求：
1.一种活性肽在制备改善神经炎症的药物中的应用，其特征在于：所述活性肽的氨基酸序列为FVAPFPE。 说明书 : 一种可延缓端粒磨损的酪蛋白来源活性肽及其应用和一种含
该活性肽的药物技术领域[0001] 本发明属于生物活性肽技术领域，具体涉及一种可延缓端粒磨损的酪蛋白来源活性肽及其应用和一种含该活性肽的药物。背景技术[0002] 衰老是一个渐进的、不可逆的病理生理过程，表现为组织和细胞功能下降。是神经退行性疾病、心血管疾病、代谢疾病、肌肉骨骼疾病和免疫系统疾病的一个重要危险因素。端粒缩短、炎症、氧化应激与衰老及相关疾病的发生发展密切相关。端粒长度被广泛用于评估衰老，衰老过程中端粒不断缩短，环境因素可能加速或延缓这一进程从而起到加速衰老或延缓衰老的作用。有孟德尔随机化研究确证了端粒长度与认知功能、端粒长度与阿尔兹海默症之间存在因果关联。实验研究证明端粒是与年龄相关的神经发生和认知变化的关键调节因素。延缓端粒磨损有助于预防或延缓多种与衰老及相关的疾病。[0003] 端粒缩短、炎症、氧化应激三者之间存在复杂的相互作用关系。端粒对炎症和氧化应激相当敏感，直接在端粒引发氧化应激可促进DNA损伤应答激活和端粒脆性增加，激活p53途径，加速细胞衰老。氧化应激与炎症相互助长：细胞内ROS水平增加可通过氧化磷酸化途径激活NLRP3炎性小体，也可通过增加线粒体渗透性促进mtDNA的释放，从而激活炎症相关通路，激活NF‑κB引发炎症级联。双链DNA损伤可以上调NF‑κB从而在转录水平上促发炎症相关衰老表型。除了NF‑κB外，Wnt、RAP1、TERT、PARP蛋白在炎症和端粒维持中也有双重功能。由此可见，在理解衰老过程和开发新的治疗方法时有必要从始发事件入手去探寻有效的干预策略。[0004] 人群研究发现西南地区坚持蔬菜型膳食模式人群的端粒较长，该膳食模式中，酸奶摄入贡献比较高。动物实验比较了摄入酸奶和牛奶对端粒长度的影响，发现相比于牛奶组，酸奶组的端粒较长，与对照组相比，牛奶组的端粒甚至有磨损（Shan,S.F.,YogurtandStreptococcusthermophilusmetabolitesamelioratedtelomereattritioninD‑galactose‑inducedageingmiceandt‑BHP‑challengedHepG2cells,INTERNATIONALJOURNALOFFOODSCIENCEANDTECHNOLOGY,55(6),2509‑2516）。上述结果提示发酵乳制品摄入可能通过延缓端粒磨损延缓衰老，从而可能会对衰老相关疾病起到保护作用。现有大量关于活性肽抗衰老的研究，而发酵也会水解乳中所含的蛋白质进而产生大量活性肽。因此，发酵乳制品中可能存在有益于认知功能的活性肽。此外，从多肽中筛选可入脑的活性成分对目前多数药物不能穿过血脑屏障的困境来说，是一个值得探索的方向。发明内容[0005] 本发明的目的是提供一种可延缓端粒磨损的酪蛋白来源活性肽及其应用。[0006] 本发明提供了一种活性肽，其氨基酸序列为FVAPFPE。[0007] 本发明还提供了上述的活性肽在制备延缓端粒磨损的药物中的应用。[0008] 进一步地，所述药物为改善神经系统端粒磨损的药物。[0009] 进一步地，所述药物为抗炎和/或抗氧化的药物。[0010] 进一步地，所述药物为改善氧化应激和神经炎症的药物。[0011] 进一步地，所述药物为改善认知功能减退的药物。[0012] 进一步地，所述药物为延缓衰老的药物。[0013] 进一步地，所述药物为预防和/或治疗与衰老有关的疾病的药物。[0014] 进一步地，所述药物为能穿过血脑屏障，直接入脑发挥作用的药物。[0015] 本发明还提供了一种药物，它是以上述的活性肽为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。[0016] 本发明还提供了上述的活性肽在制备具有增强免疫力或抗氧化功能的保健食品中的应用。[0017] 本发明还提供了一种具有增强免疫力或抗氧化功能的保健食品，其特征在于：它是以上述的活性肽为活性成分，加上食品上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的产品。[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：[0019] 本发明经体外模拟人摄食后的体内过程、分子对接预测和细胞实验验证，从发酵法制备的酪蛋白水解物中筛选了一条序列为FVAPFPE的活性肽，该活性肽经口摄入后可稳定入脑，并具有抗炎、抗氧化、保护端粒磨损的功效。该活性肽可以延缓衰老，有望用于预防和/或治疗与衰老有关的疾病，具有良好的临床应用前景。[0020] 本发明提供了一种有希望直接入脑发挥作用的、可改善神经系统端粒磨损、氧化应激和神经炎症的酪蛋白来源活性肽，可用于制备改善神经系统衰老、氧化应激及炎症的药物，也可用于与其他保健品或食物添加剂复配使用。本发明研发的活性肽结构明确、可化学合成，合成成本低，且该活性肽来自天然的牛乳来源的酪蛋白，具有良好的生物兼容性，安全性高。[0021] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。[0022] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明[0023] 图1为7种多肽对BV2细胞的毒性作用结果图。[0024] 图2为7种多肽对脂多糖诱导的BV2细胞的NO生成量的影响结果图。[0025] 图3为多肽FVAPFPE（FE7）和FGKEKVNE（FE8）对IL‑1β水平的影响结果图。[0026] 图4为多肽FVAPFPE（FE7）和FGKEKVNE（FE8）对ROS水平的影响结果图。[0027] 图5为多肽FVAPFPE（FE7）和FGKEKVNE（FE8）对MDA水平的影响结果图。[0028] 图6为大鼠来源的原代神经干细胞鉴定结果图。A.特征1：能进行不对称分裂；B.特征2：具有分裂增殖能力；C.特征3：干细胞特征蛋白Nestin阳性；D.特征4：分化标志蛋白GFAP阳性。[0029] 图7为不同浓度过氧化氢叔丁醇干预48h对神经干细胞的细胞毒性结果图。[0030] 图8为不同浓度多肽FVAPFPE干预48h对神经干细胞的细胞毒性结果图。[0031] 图9为多肽FVAPFPE干预对氧化应激条件下的端粒长度的影响结果图。具体实施方式[0032] 本发明具体实施方式中未注明具体条件的实验方法，若无特殊说明，则是按照常规条件或制造商建议的条件，所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。[0033] 实施例1、酪蛋白来源可入脑活性肽的筛选[0034] 本发明采用一种简便高效的方法从保加利亚乳杆菌发酵的酪蛋白水解物中筛选可入脑活性肽。准备好发酵的酪蛋白水解物后，依次进行以下在体外模拟消化、吸收和转运的三个步骤：（1）INFOGEST标准方法模拟人体消化过程；（2）基于在transwell小室上培养人结肠癌细胞（Caco‑2）形成屏障模拟人体肠道吸收过程；（3）基于在transwell小室上培养永生化人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D）3 细胞形成屏障模拟人体血脑屏障渗透过程。[0035] 采用保加利亚乳杆菌标准菌株（Genbank序列号：CP032451.1）混合发酵制备酪蛋白水解物,将保加利亚乳杆菌复苏后传代2次进行活化后，以1%‑2%的比例加入灭菌的MRS液体培养基中混匀，然后置于37℃厌氧培养箱中培养36h进行菌种扩增。培养结束后将菌液离心浓缩，参照国标方法进行平板计数，将浓缩的菌液加入无菌的50mL离心管中，在4℃以3000rpm/min的转速离心10min后弃上清，而后加入3倍体积的PBS清洗，在4℃条件下，仍以3000rpm/min的转速离心10min，弃去PBS备用。以2.5g酪蛋白/100mL超纯水的比例称取酪蛋白固体于烧杯中，按4%（v/v）加入0.5MNaOH溶液后充分搅拌，然后加入96%（v/v）超纯水后，以封口膜封口，室温下磁力搅拌，待团块状酪蛋白完全溶化后，测得pH在7.2‑7.3之间，90℃加热15min灭菌，待其冷却到室温后，先取5mL酪蛋白溶液将重悬准备8好的菌，再加入一定量的酪蛋白溶液混匀，使菌液浓度达到5×10CFU/mL，然后拧上离心管盖，封口膜封口后置于37℃厌氧培养箱内发酵72h。将发酵体系在4℃、3900rpm/min离心10min，用0.22um膜过滤除菌后制备得“发酵的酪蛋白水解物”，冻干后用于下一步实验。[0036] （1）INGEST标准方法模拟人体消化过程[0037] 本部分完全依据INFOGEST2.0版本要求的标准操作程序进行。简言之，先配制储备液，再根据各消化液中储备液用量依配制消化液，配制完成后在预热至37℃备用，加热过程中用封口膜封口，以防溶剂蒸发。而后称取120mg冻干的酪蛋白水解物，将其溶于配好的3mL口腔消化液中，37℃条件下60rpm/min晃摇2min以模拟口腔消化阶段。接下来在该体系中加入3mL含2000U/mL胃蛋白酶的胃消化液，从加酶时开始计时，置于37℃孵箱中以60rpm/min的水平转速晃摇120min；接下来在该体系中加入6mL含100U/mL胰蛋白酶和200mg/mL胆汁的肠消化液，从加酶时开始计时，置于37℃孵箱中以60rpm/min的水平转速晃摇120min；消化结束后，100℃灭活5min后，将全部液体加入10kDa超滤管中，以3000rpm/min的转速在4℃离心15min，以排除消化酶的干扰，收集＜10kDa部分滤液作为“模拟消化产物”。[0038] （2）人结肠癌细胞（Caco‑2）形成屏障模拟人体肠道吸收过程[0039] 将Caco‑2细胞在添加了10%胎牛血清、1%青霉素‑链霉素的DMEM高糖培养基中培5养，每隔2‑3天传代一次。将生长良好的细胞悬液以2×10 个/mL密度以0.1mL体积加入transwell小室（corning,3470,膜直径6.5mm，膜孔径0.4um）顶侧，同时在基底侧加入0.6mL培养基，将Caco‑2细胞在transwell小室上培养21天使其长成完整致密的单细胞层，期间每2天用Millicell‑ERS2细胞电阻仪监测膜两侧的跨膜电阻并换液。经CCK‑8法检测受试物对细胞的毒作用，将B以最大无毒性作用的浓度稀释在Hank’s平衡盐溶液（HBSS）中，然后添加到transwell小室顶侧，以新鲜HBSS在基底侧接收2h，收集基底侧液体，并检测2跨膜电阻，将Caco‑2细胞屏障跨膜电阻保持在400Ω·cm以上的孔为有效孔，收集有效孔转运后的产物作为“模拟肠道吸收的部分”。[0040] （3）永生化人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）细胞形成屏障模拟人体血脑屏障渗透过程[0041] hCMEC/D3细胞在hCMEC/D3专用培养基（PriMed‑iCell‑002，配方：93%内皮细胞培养基础培养基，5%优质胎牛血清，1%内皮细胞培养添加剂，1%青霉素/链霉素）中培养，细胞5密度达80‑90%时进行传代。将生长良好的细胞悬液以2×10 个/ml密度以0.1mL体积加入transwell小室（corning,3470,膜直径6.5mm，膜孔径0.4um）顶侧，同时在基底侧加入0.6mL培养基，每2天换液1次，在transwell小室上培养7天使其形成完整的单细胞层，期间每2天用Millicell‑ERS2细胞电阻仪监测1次膜两侧的跨膜电阻，该部分的TEER值的标准2为≥20Ω·cm，同期检测“模拟肠道吸收入血的部分”干预对hCMEC/D3细胞的毒作用，选择最大无毒性作用的浓度进行转运实验。将“模拟肠道吸收入血的部分”以该浓度稀释在HBSS溶液中，然后添加到transwell小室顶侧，从基底侧接收2h，收集基底侧液体后，再次2检测跨膜电阻，将hCEMC/D3细胞屏障跨膜电阻保持在20 Ω·cm以上的孔为有效孔，有效孔转运后的产物作为“模拟经血入脑的部分”。[0042] 将“发酵的酪蛋白水解物”、“模拟消化产物”、“模拟肠道吸收入血的部分”、“模拟经血入脑的部分”进行多肽组学检测，进行多肽鉴定后，求这4个阶段的交集，以此表征来源于保加利亚乳杆菌发酵制备的酪蛋白水解物中能抵抗消化过程的破坏、能经受肠上皮细胞分泌于肠腔侧的酶的水解、能完整穿过肠上皮屏障、能完整穿过血脑屏障的多肽子集。上述结果包含63个肽段，接下来，利用Autodockvina将上述63个肽与Keap1蛋白(https://www.rcsb.org/structure/2FLU)的活性位点Ketch结构域进行了分子对接。理论上，该活性肽可通过与Nrf2竞争靶点，从而促进Nrf2的释放，启动下游抗氧化及与炎症反应的串扰过程。我们对上述63个多肽按对接分数排序，并以Keap1蛋白的原配体Nrf2的对接分数‑7.8kcal/mol为截点，确定了对接分数低于‑7.8kcal/mol、且分子量小于1kDa的7条多肽（这7条多肽的序列信息如表1所示）。检索BIOPEP‑UWM(https://www.uwm.edu.pl/biochemia）和theMilkBioactivePeptideDatabase(https://mbpdb.nws.oregonstate.edu/)这两个活性肽数据库发现，这7条多肽均尚无记录，由此可认为这7条多肽均为新发现的序列。这些7条多肽经ToxiBTL(http://server.wei‑group.net/ToxIBTL)预测均无毒。用peptideranker工具（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）预测发现FVAPFPE和PVVVPPF可能具有生物活性。[0043] 表1.筛选出来的7个具有潜在生物活性的多肽信息[0044][0045] 实施例2、在小鼠小胶质细胞系BV2细胞模型中验证预测结果[0046] 委托生工生物工程（上海）股份有限公司采用固相合成法对上述7条多肽进行人工合成和脱盐处理。反相高效液相色谱测得合成的多肽纯度>99%。[0047] 2.1体外筛选的多肽对BV2细胞的毒性作用和对NO生成量的影响[0048] 在37℃、5%CO2培养箱中，用含有10%胎牛血清、1%青霉素‑链霉素的DMDM培养基中5培养BV2细胞，每1‑2天传代1次。将BV2细胞以1×10 个/mL密度铺96孔板，每孔100μL，待细胞生长24h后，以浓度为0.01μg/mL、0.1μg/mL、1.00μg/mL、10.00μg/mL的多肽干预24h后，采用CCK‑8法检测细胞存活率，实验重复3次。[0049] 结果如图1所示，7种多肽对BV2细胞均未显示出细胞毒性。[0050] 采用Griess法检测NO生成量，评估体外筛选的7个多肽对脂多糖诱导BV2细胞的神5经炎症的作用。将BV2细胞以1×10 个/mL密度铺96孔板，每孔100μL。待细胞生长24h后，各组处理措施如下：对照组：不加多肽、不加脂多糖，补充等量培养基；模型组：不加多肽，加入终浓度为1μg/mL脂多糖；阳性对照组：加入终浓度为1μg/mL脂多糖和终浓度为5μM的姜黄素；干预组：加入终浓度为1μg/mL的脂多糖和1.00μg/mL的多肽。各组均干预24h。收集细胞上清，采用Griess法检测NO生成量。[0051] NO检测结果如下图2所示，与未干预的对照组相比，模型组的NO生成量显著增加，阳性对照组NO生成量明显下降（姜黄素是一种公认的天然药物，具有抗氧化和抗炎活性，也有助于延缓衰老，但无法穿过血脑屏障）。而各多肽干预组中，FVAPFPE（FE7）、FGKEKVNE（FE8）这两个多肽显著降低了一氧化氮（NO）生成量，其余5个多肽未表现出对NO的抑制作用。因此，在后续实验中，仅对这两个多肽的效应进行评估。[0052] 2.2可减少NO生成量的多肽的抗炎和抗氧化效应评估[0053] 将BV2细胞以1×105个/mL密度铺96孔板，每孔100μL，待细胞生长24h后，各组处理措施如下：对照组：不加多肽、不加脂多糖，补充等量培养基；模型组：不加多肽，加入终浓度为1μg/mL脂多糖；阳性对照组：加入终浓度为1μg/mL脂多糖和终浓度为5μM的姜黄素；干预组：加入终浓度为1μg/mL的脂多糖和不同浓度（0.01μg/mL、0.1μg/mL、1.00μg/mL）的多肽。各组均干预24h。收集细胞上清液，采用ELISA试剂盒检测IL‑1β含量。[0054] IL‑1β检测结果如图3所示，模型组IL‑1β生成量提示LPS诱导BV2细胞释放更多IL‑1β，而经不同浓度FVAPFPE干预后，IL‑1β生成量有随多肽浓度增加而减少的趋势，多肽干预后IL‑1β的生成量下降在1.00μg/mL剂量组最明显，差异有统计学意义。但FGKEKVNE干预并未降低IL‑1β水平。[0055] 将BV2细胞以1×105个/mL密度铺24孔板，每孔500μL，培养24h后开始干预。各组处理措施如下：对照组：不加多肽、不加脂多糖，补充等量培养基；模型组：不加多肽，只加入终浓度为1μg/mL脂多糖；阳性对照组：加入终浓度为1μg/mL脂多糖和终浓度为5μM的姜黄素；干预组：加入终浓度为1μg/mL的脂多糖和不同浓度（0.01μg/mL、0.1μg/mL、1.00μg/mL）的多肽。各组均干预24h。采用ROS检测试剂盒（碧云天）用酶标法检测ROS水平。具体来说，用无血清DMEM按照1:1000稀释DCFH‑DA，使其终浓度为10μmol/L。去除24孔板上的细胞培养液后，加入稀释好的DCFH‑DA，将细胞在37ºC培养箱内孵育20min。刮下细胞后用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，将细胞混匀后分两份，一份用荧光酶标仪检测488nm激发波长、525nm发射波长条件下的荧光强度。另一份用CCK‑8法检测450nm处的吸光度。计算荧光强度与450nm处的吸光度的比值，并用对照组的值进行校正，即得相对ROS值。[0056] ROS检测结果如图4所示，阳性对照组的ROS下降程度与模型组相比有统计学意义；FVAPFPE（1μg/mL）干预后也使ROS明显下降，与模型组的差异有统计学意义。且1μg/mL的FVAPFPE的干预效应与阳性对照水平相当，这提示1μg/mL的FVAPFPE具备与5μM姜黄素近乎同等的ROS清除能力。而FGKEKVNE干预后的相对ROS与模型组之间无统计学差异。[0057] 将BV2细胞以1×105个/mL密度铺6孔板，每孔3mL，培养24h后开始干预，各组处理措施如下：对照组：不加多肽、不加脂多糖，补充等量培养基；模型组：不加多肽，只加入终浓度为1μg/mL脂多糖；阳性对照组：加入终浓度为1μg/mL脂多糖和终浓度为5μM的姜黄素；干预组：加入终浓度为1μg/mL的脂多糖和不同浓度（0.01μg/mL、0.1μg/mL、1.00μg/mL）的多肽。各组均干预24h。干预结束后，将细胞用细胞刮刀刮下后，裂解细胞，使用BCA试剂盒（碧云天）进行蛋白定量，采用MDA检测试剂盒（碧云天）用检测MDA水平，实验操作完全按照说明书进行。[0058] MDA检测结果如图5所示，模型组经LPS诱导BV2细胞后MDA水平显著增加，经不同浓度FVAPFPE干预后，MDA水平有随多肽浓度增加而减少的趋势，在1.00μg/mL的FVAPFPE干预组中下降最明显，差异与模型组相比有统计学意义。而FGKEKVNE干预后的MDA水平与模型组之间无统计学差异。[0059] 综上，本部分对分子对接筛选出来的7个小肽进行功能验证，结果表明FVAPFPE效果最优，兼具抗炎、抗氧化能力。1μg/mL的FVAPFPE在改善IL‑1β、ROS、MDA水平方面与5μM的姜黄素的效果相当。[0060] 实施例3、FVAPFPE对SD大鼠来源的神经干细胞相对端粒长度的影响[0061] 自然状态下的衰老伴随着端粒长度缩短，而氧化应激可加速端粒磨损和衰老，因此本发明基于神经退行性疾病中氧化应激与端粒之间的密切关联，关注上述经抗氧化性及抗炎活性筛选出的FVAPFPE对氧化应激加速端粒磨损的保护作用。[0062] 3.1神经干细胞的分离、培养和鉴定[0063] 在无菌条件下分离出生后24h内的SD大鼠新生鼠海马区并机械消化后，在DMEM/F12培养基（添加体积分数为2%的B27、体积分数为1%的青霉素‑链霉素、终浓度为20ng/mL的表皮生长因子、终浓度为20ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子）中培养，每2天换液1次，培养7天后，用Accutase酶消化后计数，得到神经干细胞。通过显微镜下观察神经干细胞形态特征、分裂能力、增殖能力、并对表面标志蛋白进行免疫荧光法鉴定。免疫荧光实验中，用Nestin和GFAP抗体孵育后，加绿色标记的二抗，并用DAPI染液标记细胞核。然后在荧光显微镜下观察。[0064] 结果如图6所示，通过神经干细胞形态特征单个神经细胞呈圆形，具有神经干细胞典型的不对称分裂能力，具有对称分裂增殖能力，Nestin染色结果显示阳性，表明具有干细胞的特征，其表面GFAP染色结果阳性，表明该细胞具有分化能力。上述特征表明上述方式获得的细胞具备神经干细胞特征。[0065] 3.2过氧化氢叔丁醇造模剂量选择[0066] 将神经干细胞以2×105个/mL的密度铺96孔板，每孔100μL。待细胞生长24h后，以不同浓度（0μM、10μM、20μM、40μM、50μM、60μM终浓度）过氧化氢叔丁醇干预48h后，采用CCK‑8法检测细胞存活率，实验重复3次。[0067] 结果如图7所示，过氧化氢叔丁醇的浓度为20μM时，原代神经干细胞的存活率在80%左右，结合文献报道的造模浓度，本发明采用20μM作为造模剂量。[0068] 3.3多肽FVAPFPE对神经干细胞的细胞毒性测试[0069] 神经干细胞来源及获取方式同3.1。将原代神经干细胞以2×105个/mL的密度铺96孔板，每孔100μL。待细胞生长24h后，以浓度为0.01μg/mL、1.00μg/mL、100.00μg/mL的FVAPFPE干预48h后，采用CCK‑8法检测细胞存活率，实验重复3次。[0070] 结果如图8所示，在0.01‑100.00μg/mL剂量范围内，FVAPFPE无细胞毒性，因此，本实验在该剂量范围内进行下一步测试。[0071] 3.4多肽FVAPFPE干预后端粒长度检测[0072] 神经干细胞来源及获取方式同3.1。将SD大鼠来源的神经干细胞以2×105个/mL的密度在T25培养瓶中培养，每瓶5mL。将FVAPFPE以0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL的终浓度添加到无血清DMEM/F12培养基中，以5μM姜黄素作为阳性对照，每2天全换液1次，持续干预10天后，将培养基更换为添加了终浓度为20μM过氧化氢叔丁醇的DMEM/F12培养基，造模48h后，提取基因组DNA，将基因组DNA统一稀释到50ng/μL，qt‑PCR检测相对端粒长度。用0.4μL10μM的正向引物、0.4μl10μM的负向引物、3.2μLddH2O、5μLTaqII、1μL基因组DNA配制10μL反应体系（反转录试剂和PCR反应体系试剂均购自Takara）。使用LightCycler96实时定量PCR仪进行检测。qt‑PCR反应条件如下：95℃预变性3min，然后95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸40s，总共40个循环，以AT1内参对照。实验重复3次，每个样本复测3次。[0073] 引物序列如下：[0074] Telo‑F：GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT（SEQIDNO.8）[0075] Telo‑R：TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA（SEQIDNO.9）[0076] AT1‑F：ACGTGTTCCAGCATCGACCCTACC（SEQIDNO.10）[0077] AT1‑R：AGAATGATAAGGAAAGGGAAGAAGCCC（SEQIDNO.11）[0078] 结果如图9所示：与对照组相比，模型组（t‑BHP干预组）神经干细胞经过氧化氢叔丁醇处理后加速缩短，经过10天的活性肽预处理的3个干预组中，相对端粒长度较模型组长，其中0.10μg/mL多肽FVAPFPE干预后相对端粒长度与模型组相比有统计学意义。说明多肽FVAPFPE可以延缓端粒磨损。[0079] 综上，本发明从发酵法制备的酪蛋白水解物中筛选了一条序列为FVAPFPE的活性肽，经体外模拟、分子对接预测和细胞实验验证，确认该活性肽经口摄入后可稳定入脑，并具有抗炎、抗氧化、保护端粒磨损的功效。活性肽可以延缓衰老，并且预防和/或治疗与衰老有关的疾病，具有良好的临床应用前景。

专利地区：四川

专利申请日期：2024-08-22

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118702799B