重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的制备方法

专利名称：重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的制备方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202411062361.9

专利申请（专利权）人：长春生物制品研究所有限责任公司
权利人地址：吉林省长春市高新技术开发区创新路1616号

专利发明（设计）人：刘景会,刘玉林,刘琳琳,王江林,张宇,俞露,王莹

专利摘要：本发明涉及医用、牙科用或梳妆用的配制品技术领域，尤其涉及一种重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的制备方法。本发明中的重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂系由高效表达人白细胞介素‑1受体拮抗剂（rhIL‑1Ra）蛋白的大肠杆菌细胞，经发酵培养，分离和高度纯化后制成的水针剂，含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。

主权利要求：
1.一种重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将高效表达人白细胞介素‑1受体拮抗剂蛋白的大肠杆菌的工作种子批菌种接种于
500 600mL一级种子培养基中，分为2批，在30 35℃，100 250rpm下培养5 10h，OD600为0.5~ ~ ~ ~ ~
1.5时即为一级种子液；在30℃，100 250rpm，通气量24L/min下调节罐压为0.02 0.05MPa，~ ~向二级种子培养基中补加硫酸镁溶液、葡萄糖溶液、微量元素溶液、硫酸亚铁溶液，接种一级种子液，培养4 6h，OD600为0.5 1.5时即为二级种子液；
~ ~
S2、将全部种子液接种在灭菌培养基中，发酵培养温度为30±1℃，pH设置为7.0±
0.05，在发酵过程中保持发酵液中溶解氧饱和度≥30%，并根据葡萄糖消耗情况进行补料操作，待OD600值达到80 120时，停止补料，加入IPTG溶液进行诱导，诱导结束后继续发酵培~养，同时进行补料操作，培养8 10h后终止发酵；
~
S3、离心收集菌体，﹣20℃下冻存，对菌体进行初步纯化后将收集的菌体按1：9的重量比用菌体重悬缓冲液悬起，以30 60rpm转速搅拌1 2h，调节pH至5.5±0.05，在＜10℃下，640~ ~ ~
680bar均质1次，800 900bar均质1 2次后再次调节pH至5.5±0.05，离心收集上清液；过滤~ ~澄清，收集滤液即为重组人白细胞介素‑1拮抗剂初提液，经柱层析后加入到水中，浓度≥
150mg/mL，加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐以及聚乙二醇衍生物，室温下搅拌2 4h后经酸洗、碱洗、盐水洗涤后透析2 3d，再置换缓冲液，其中枸橼酸钠2.85g/kg，依~ ~地酸二钠0.2g/kg，氯化钠8.18g/kg，无水枸橼酸0.02g/kg，pH6.0 7.0，最终浓缩液的蛋白~浓度应≥120mg/mL，除菌过滤成重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂原液；
S4、将原液用稀释液稀释至所需浓度后加入聚山梨酯80，使重组人白细胞介素‑1拮抗剂终浓度为90 110mg/mL，枸橼酸钠终浓度为2.85mg/mL，依地酸二钠终浓度为0.20mg/mL，~氯化钠终浓度为8.18mg/mL，无水枸橼酸终浓度为0.058mg/mL，聚山梨酯80终浓度为
1.05mg/mL，经除菌过滤，即为半成品，经检定、分批、分装、包装即得；
所述聚乙二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：
X1、将维生素E‑醋酸酯加入到乙醇中，再加入0.5mol/L氢氧化钠水溶液，维生素E‑醋酸酯与氢氧化钠的摩尔比为1:1，至pH为7 8后搅拌2 6h，搅拌结束后加入二氯甲烷萃取，合并~ ~有机相后加入稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤后浓缩得残余物与马来酸酐、对二甲氨基吡啶加入到二氯甲烷中，残余物与马来酸酐、对二甲氨基吡啶的摩尔比为1:2 3:1 1.5，~ ~在氮气气氛下搅拌20 30h，加入冷乙醚稀释后有沉淀出现，透析2 3d后用于下一步；
~ ~
X2、将上一步的产物与对二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺加入到二氯甲烷中，在氮气气氛下搅拌20 30h，过滤后与八臂‑聚乙二醇‑羟基的二氯甲烷溶液混合，上一步的产物与~对二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺、八臂‑聚乙二醇‑羟基的摩尔比为1:1 1.5:1 1.5:~ ~
0.1，继续搅拌20 30h后加入冷乙醚稀释后有沉淀出现，洗涤3次后透析2 3d干燥即得。
~ ~
2.如权利要求1所述的重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中重组人白细胞介素‑1拮抗剂与1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐以及聚乙二醇衍生物的摩尔比为1:1.5 2:0.1 0.5。
~ ~ 说明书 : 重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的制备方法技术领域[0001] 本发明涉及医用、牙科用或梳妆用的配制品技术领域，尤其涉及一种重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的制备方法。背景技术[0002] 重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂（rhIL‑1Ra）是一种重要的生物制剂，它通过特定的机制发挥作用。rhIL‑1Ra能够抑制IL‑1的活性，这是一种在炎症过程中起关键作用的细胞因子。通过与IL‑1受体结合，rhIL‑1Ra可以阻止IL‑1引发的炎症反应。在D‑氨基半乳糖诱导的肝细胞损伤模型中，rhIL‑1Ra显示出对肝细胞的保护作用。它通过上调ERK1/2信号通路的活化水平，抑制细胞凋亡，从而保护肝细胞。在化疗前使用rhIL‑1Ra可以保护造血干/祖细胞（HS/PCs）免受化疗药物的细胞毒性。rhIL‑1Ra治疗能够上调磷酸化p38、p53和p21蛋白水平，并诱导HS/PCs的短暂静止状态，这有助于减轻化疗引起的中性粒细胞减少症。rhIL‑1Ra能够调节与IL‑1相关的多种免疫和炎症反应，特别是在感染和炎症的急性阶段。rhIL‑1Ra可能用于治疗多种疾病，包括脓毒症、类风湿性关节炎和慢性髓性白血病。rhIL‑1Ra还能够竞争性地与IL‑1β和IL‑1α结合，阻止它们与受体结合，但不与这些细胞因子本身发生相互作用。这种阻断作用有助于减少由IL‑1介导的炎症反应。rhIL‑1Ra通过IL‑1/IL‑1Ra信号通路（IL‑1RI→p38→p53→p21）诱导HS/PCs的静止，这可能为基于p53的循环疗法提供新途径，在化疗期间保护正常细胞同时杀死癌细胞。这些作用和机理展示了rhIL‑1Ra在医学上的广泛应用潜力，尤其是在治疗炎症和免疫相关疾病方面。[0003] CN105214092A公开了一种用于治疗干眼症的药物组合物及重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂在制备治疗干眼症药物中的新用途。本发明通过实验证明重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂对于各种程度的干眼症具有一定的效果，与现有的抗炎药物和人工泪液相比，效果显著。本发明的用于治疗干眼症的药物组合物，加入水溶性的高分子壳聚糖季铵盐，增加了组合物的粘性，更好的润滑眼表；其与重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂进行一定程度的结合，在一定程度上保护了重组人白细胞介素‑受体拮抗剂的活性，并且壳聚糖季铵盐具有一定的抗菌性和组织相容性，能够使重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂得到更好、更长时间的保存。[0004] CN101584855A提供了白细胞介素‑1受体拮抗剂的注射液制剂及其制备工艺，该发明所述的药物制剂在治疗类风湿性关节炎有显著的抑制作用；且药物作用明显，毒性很低，用药安全、价格低廉；其制剂剂型携带方便、易于服用；该发明所提供的制备方法能够有效制备需要的制剂、保证得到的制剂效果显著；制剂稳定，疗效好且质量可控；生产工艺科学合理，操作可行、生产成本低。[0005] 重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂（rhIL‑1RA）是一种重要的抗炎细胞因子，已被FDA批准用于治疗类风湿性关节炎。然而有研究表明rhIL‑1RA在水溶液中不稳定，rhIL‑1RA通过非共价作用形成不可逆的二聚体，生物活性显著降低，尤其是在用作治疗药物时，这种情况的出现不仅会影响药物的使用期限还会影响治疗效果。发明内容[0006] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供了一种重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的制备方法。[0007] 本发明中的重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂系由高效表达人白细胞介素‑1受体拮抗剂（rhIL‑1Ra）蛋白的大肠杆菌细胞，经发酵培养，分离和高度纯化后制成的水针剂，含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。[0008] 为实现上述目的，本发明提供了一种重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的制备方法，包括如下步骤：[0009] S1、将高效表达人白细胞介素‑1受体拮抗剂蛋白的大肠杆菌的工作种子批菌种接种于500 600mL一级种子培养基中，分为2批，在30 35℃，100 250rpm下培养5 10h，OD600为~ ~ ~ ~0.5 1.5时即为一级种子液；在30℃，100 250rpm，通气量24L/min下调节罐压为0.02~ ~ ~0.05MPa，向二级种子培养基中补加硫酸镁溶液、葡萄糖溶液、微量元素溶液、硫酸亚铁溶液，接种一级种子液，培养4 6h，OD600为0.5 1.5时即为二级种子液；~ ~[0010] S2、将全部种子液接种在灭菌培养基中，发酵培养温度为30±1℃，设置pH，在发酵过程中保持发酵液中溶解氧饱和度≥30%，并根据葡萄糖消耗情况进行补料操作，待OD600值达到80 120时，停止补料，加入IPTG溶液进行诱导，诱导结束后继续发酵培养，同时进行~补料操作，培养后终止发酵；[0011] S3、离心收集菌体，﹣20℃下冻存，对菌体进行初步纯化，后将收集的菌体用菌体重悬缓冲液悬起，以30 60rpm转速搅拌1 2h，调节pH，在＜10℃下，以640 680bar均质1次，以~ ~ ~800 900bar均质1 2次再次调节pH，离心收集上清液，过滤澄清，收集滤液即为重组人白细~ ~胞介素‑1拮抗剂初提液，经柱层析后进行缓冲液置换，最终浓缩液的蛋白浓度应≥120mg/mL，除菌过滤成重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂原液；[0012] S4、将原液用稀释液稀释至所需浓度后加入聚山梨酯80，使重组人白细胞介素‑1拮抗剂终浓度为90 110mg/mL，枸橼酸钠终浓度为2.85mg/mL，依地酸二钠终浓度为0.20mg/~mL，氯化钠终浓度为8.18mg/mL，无水枸橼酸终浓度为0.058mg/mL，聚山梨酯80终浓度为1.05mg/mL，经除菌过滤，即为半成品，经检定、分批、分装、包装即得。[0013] 进一步的，所述步骤S2中pH为7.0±0.05。[0014] 进一步的，所述步骤S2中培养的时间为8 10h。~[0015] 进一步的，所述步骤S3中菌体与重悬缓冲液的重量比为1:9。[0016] 进一步的，所述步骤S3中置换的缓冲液组成为枸橼酸钠2.85g/kg，依地酸二钠0.2g/kg，氯化钠8.18g/kg，无水枸橼酸0.02g/kg，pH6.0 7.0。~[0017] 进一步的，所述步骤S3中调节pH的值均为5.5±0.05。[0018] 优选的，所述重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的制备方法，包括如下步骤：[0019] S1、将高效表达人白细胞介素‑1受体拮抗剂蛋白的大肠杆菌的工作种子批菌种接种于500 600mL一级种子培养基中，分为2批，在30 35℃，100 250rpm下培养5 10h，OD600为~ ~ ~ ~0.5 1.5时即为一级种子液；在30℃，100 250rpm，通气量24L/min下调节罐压为0.02~ ~ ~0.05MPa，向二级种子培养基中补加硫酸镁溶液、葡萄糖溶液、微量元素溶液、硫酸亚铁溶液，接种一级种子液，培养4 6h，OD600为0.5 1.5时即为二级种子液；~ ~[0020] S2、将全部种子液接种在灭菌培养基中，发酵培养温度为30±1℃，pH设置为7.0±0.05，在发酵过程中保持发酵液中溶解氧饱和度≥30%，并根据葡萄糖消耗情况进行补料操作，待OD600值达到80 120时，停止补料，加入IPTG溶液进行诱导，诱导结束后继续发酵培~养，同时进行补料操作，培养8 10h后终止发酵；~[0021] S3、离心收集菌体，﹣20℃下冻存，对菌体进行初步纯化后将收集的菌体按1：9的重量比用菌体重悬缓冲液悬起，以30 60rpm转速搅拌1 2h，调节pH至5.5±0.05，在＜10℃下，~ ~640 680bar均质1次，800 900bar均质1 2次后再次调节pH至5.5±0.05，离心收集上清液；~ ~ ~过滤澄清，收集滤液即为重组人白细胞介素‑1拮抗剂初提液，经柱层析后置换缓冲液(枸橼酸钠2.85g/kg，依地酸二钠0.2g/kg，氯化钠8.18g/kg，无水枸橼酸0.02g/kg，pH6.0 7.0)，~最终浓缩液的蛋白浓度应≥120mg/mL，除菌过滤成重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂原液；[0022] S4、将原液用稀释液稀释至所需浓度后加入聚山梨酯80，使重组人白细胞介素‑1拮抗剂终浓度为90 110mg/mL，枸橼酸钠终浓度为2.85mg/mL，依地酸二钠终浓度为0.20mg/~mL，氯化钠终浓度为8.18mg/mL，无水枸橼酸终浓度为0.058mg/mL，聚山梨酯80终浓度为1.05mg/ml，经除菌过滤，即为半成品，经检定、分批、分装、包装即得。[0023] 重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂（rhILIra）属于一类结构性蛋白质，包括酸性和碱性成纤维细胞生长因子（aFGF和bFGF）、角质细胞生长因子（KGF）和白细胞介素‑l（IL‑1），所有这些蛋白质在中等温度的水溶液中长期储存时都会出现大量非原生分子沉淀，即高于室温但低于各自蛋白质的熔化温度。IL‑Ira的X射线晶体结构显示，它由12条3链组成，折叠成与aFGF、bFGF和IL‑1类似的整体拓扑结构。所有这些蛋白质的原生形式都是单体，没有可逆地结合成原生二聚体和寡聚体的趋势。然而其主要降解产物是一种不可逆形成的二聚体，但它保留了非常类似原生的结构和生物活性，只是活性显著降低，这显然不利于制剂的稳定保存。有研究表明，某些蛋白质可以通过聚乙二醇（PEG）作为赋形剂从而增加其稳定性，另一方面，聚乙二醇化蛋白质也被广泛研究以提高蛋白质的稳定性。而PEG对蛋白质的稳定性作用与聚合物的结构、分子量和浓度均有关。本发明提供了一种具有两亲性的聚乙二醇衍生物，对重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂进行保护，该衍生物具有更低的表面张力，更高的稳定性，以及更大的空间位阻，因而能够影响重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的聚集速率，从而防止其产生二聚体沉淀，进而提升有关制剂的稳定性。而本发明中的聚乙二醇衍生物所具有的两亲性特殊结构意味着其不仅具备良好的水溶性，还具有脂溶性，因此能够帮助被修饰的重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂更好地与细胞结合，从而更好、更快地发挥治疗效果。[0024] 更优选的，所述重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的制备方法，包括如下步骤：[0025] S1、将高效表达人白细胞介素‑1受体拮抗剂蛋白的大肠杆菌的工作种子批菌种接种于500 600mL一级种子培养基中，分为2批，在30 35℃，100 250rpm下培养5 10h，OD600为~ ~ ~ ~0.5 1.5时即为一级种子液；在30℃，100 250rpm，通气量24L/min下调节罐压为0.02~ ~ ~0.05MPa，向二级种子培养基中补加硫酸镁溶液、葡萄糖溶液、微量元素溶液、硫酸亚铁溶液，接种一级种子液，培养4 6h，OD600为0.5 1.5时即为二级种子液；~ ~[0026] S2、将全部种子液接种在灭菌培养基中，发酵培养温度为30±1℃，pH设置为7.0±0.05，在发酵过程中保持发酵液中溶解氧饱和度≥30%，并根据葡萄糖消耗情况进行补料操作，待OD600值达到80 120时，停止补料，加入IPTG溶液进行诱导，诱导结束后继续发酵培~养，同时进行补料操作，培养8 10h后终止发酵；~[0027] S3、离心收集菌体，﹣20℃下冻存，对菌体进行初步纯化后将收集的菌体按1：9的重量比用菌体重悬缓冲液悬起，以30 60rpm转速搅拌1 2h，调节pH至5.5±0.05，在＜10℃下，~ ~640 680bar均质1次，800 900bar均质1 2次后再次调节pH至5.5±0.05，离心收集上清液；~ ~ ~过滤澄清，收集滤液即为重组人白细胞介素‑1拮抗剂初提液，经柱层析后加入到水中，浓度≥150mg/mL，加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐以及聚乙二醇衍生物，室温下搅拌2 4h后经酸洗、碱洗、盐水洗涤后透析2 3d，再置换缓冲液(枸橼酸钠2.85g/kg，依地~ ~酸二钠0.2g/kg，氯化钠8.18g/kg，无水枸橼酸0.02g/kg，pH6.0 7.0)，最终浓缩液的蛋白浓~度应≥120mg/mL，除菌过滤成重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂原液；[0028] S4、将原液用稀释液稀释至所需浓度后加入聚山梨酯80，使重组人白细胞介素‑1拮抗剂终浓度为90 110mg/mL，枸橼酸钠终浓度为2.85mg/mL，依地酸二钠终浓度为0.20mg/~mL，氯化钠终浓度为8.18mg/mL，无水枸橼酸终浓度为0.058mg/mL，聚山梨酯80终浓度为1.05mg/mL，经除菌过滤，即为半成品，经检定、分批、分装、包装即得。[0029] 进一步的，所述步骤S3中重组人白细胞介素‑1拮抗剂与1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐以及聚乙二醇衍生物的摩尔比为1:1.5 2:0.1 0.5。~ ~[0030] 所述聚乙二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：[0031] X1、将维生素E‑醋酸酯加入到乙醇中，再加入0.5mol/L氢氧化钠水溶液，至pH为7~8后搅拌2 6h，搅拌结束后加入二氯甲烷萃取，合并有机相后加入稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶~液、盐水洗涤后浓缩得残余物与马来酸酐、对二甲氨基吡啶加入到二氯甲烷中，在氮气气氛下搅拌20 30h，加入冷乙醚稀释后有沉淀出现，透析2 3d后用于下一步；~ ~[0032] X2、将上一步的产物与对二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺加入到二氯甲烷中，在氮气气氛下搅拌20 30h，过滤后与八臂‑聚乙二醇‑羟基的二氯甲烷溶液混合，继续搅拌20~ ~30h后加入冷乙醚稀释后有沉淀出现，洗涤3次后透析2 3d干燥即得。~[0033] 进一步的，所述维生素E‑醋酸酯与氢氧化钠的摩尔比为1:1。[0034] 进一步的，所述残余物与马来酸酐、对二甲氨基吡啶的摩尔比为1:2 3:1 1.5。~ ~[0035] 进一步的，所述上一步的产物与对二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺、八臂‑聚乙二醇‑羟基的摩尔比为1:1 1.5:1 1.5:0.1。~ ~[0036] 优选的，所述聚乙二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：[0037] X1、将维生素E‑醋酸酯加入到乙醇中，再加入0.5mol/L氢氧化钠水溶液，维生素E‑醋酸酯与氢氧化钠的摩尔比为1:1，至pH为7 8后搅拌2 6h，搅拌结束后加入二氯甲烷萃取，~ ~合并有机相后加入稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤后浓缩得残余物与马来酸酐、对二甲氨基吡啶加入到二氯甲烷中，残余物与马来酸酐、对二甲氨基吡啶的摩尔比为1:2 3:1~ ~1.5，在氮气气氛下搅拌20 30h，加入冷乙醚稀释后有沉淀出现，透析2 3d后用于下一步；~ ~[0038] X2、将上一步的产物与对二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺加入到二氯甲烷中，在氮气气氛下搅拌20 30h，过滤后与八臂‑聚乙二醇‑羟基的二氯甲烷溶液混合，上一步的产~物与对二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺、八臂‑聚乙二醇‑羟基的摩尔比为1:1 1.5:1~ ~1.5:0.1，继续搅拌20 30h后加入冷乙醚稀释后有沉淀出现，洗涤3次后透析2 3d干燥即得。~ ~[0039] 本发明还提供了一种重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂，由上述方法制备而成。[0040] 本发明的有益效果：[0041] 1、与现有技术相比，本发明中的重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂系由高效表达人白细胞介素‑1受体拮抗剂（rhIL‑1Ra）蛋白的大肠杆菌细胞经发酵培养，分离和高度纯化后制成的水针剂，含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。[0042] 本发明提供了一种具有两亲性的聚乙二醇衍生物，对重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂进行修饰，该衍生物具有更低的表面张力，更高的稳定性，以及更大的空间位阻，因而能够影响重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的聚集速率，从而防止其产生二聚体沉淀，进而提升有关制剂的稳定性。而本发明中的聚乙二醇衍生物所具有的两亲性特殊结构意味着其不仅具备良好的水溶性，还具有脂溶性，因此能够帮助被修饰的重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂更好地与细胞结合，从而更好、更快地发挥治疗效果。附图说明[0043] 图1为实施例1中重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂原液的肽图检测图谱。[0044] 图2为实施例1中重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂高效液相色谱纯度检测图谱。[0045] 图3为实施例1中重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂蛋白质含量检测。具体实施方式[0046] 重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂生产用工程菌菌株系由带有人白细胞介素‑1受体拮抗剂基因的重组质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株，由上海中信国健药业有限公司建立，内部名称主代库菌种MCB106，批号20010115。按照中国《药品生产质量管理规范（2010年修订）》（GMP）和人用药物注册技术要求国际协会（ICH）指南要求对细胞库进行建立和维护。原始菌种经鉴定后传代、扩增培养后，甘油菌保存，检定合格后作为生产用主种子批，限传3代。主种子批经传代、扩增培养后，甘油菌保存，检定合格后作为生产用工作种子批，限传3代。主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。划种LB琼脂平板应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。在光学显微镜下观察，应为典型的革兰氏阴性杆菌。对抗生素的抗性应与原始菌种抗性相同，为氨苄西林抗性。应为典型大肠埃希菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。应符合大肠埃希菌生化反应特性。在摇床中培养，收获菌体进行还原型SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳表达水平测定，每条泳道上样量不小于10μg，经考马斯亮蓝法染色后扫描，样品纯度应不低于原始菌种表达量。该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒的相符。目的基因核苷酸序列应与批准的序列相符。将得到的菌种在﹣60℃以下保存。[0047] 一级种子培养基：配制含胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g的培养基1000mL，高压蒸汽灭菌。[0048] 二级种子培养基：配制含十二水合磷酸氢二钠172g、磷酸二氢钾30g、氯化铵10g、氯化钠5g、柠檬酸铁0.6g、消泡剂玉米油2.7g的培养基10kg，121℃灭菌30min。[0049] 灭菌培养基：配制含十二水合磷酸氢二钠2201.6g、磷酸二氢钾384g、氯化铵128g、氯化钠64g、柠檬酸铁7.68g、消泡剂玉米油34.56g的培养基128kg，121℃灭菌30min。[0050] 微量元素溶液：将七水合硫酸锌28.8g、一水合硫酸锰8.6g、六水合氯化钴4.8g、五水合硫酸铜12.5g、钼酸钠二水合物4.8g、碘化钾8.3g、硼酸6.2g分别配制成100mL母液，再将各母液取25mL与水4000mL配制成5000mL微量元素溶液。[0051] 硫酸亚铁溶液：将硫酸亚铁32g、0.5mol/L稀硫酸140mL配制成2.8L硫酸亚铁溶液。[0052] IPTG（异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷）溶液：将IPTG57.6g配制成800mL溶液。[0053] 菌体重悬缓冲液：Na2HPO450mmol/L、NaCl300mmol/L，pH7.6。[0054] 其余原料见下表：[0055][0056] 实施例1[0057] 一种重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的制备方法，包括如下步骤：[0058] S1、将高效表达人白细胞介素‑1受体拮抗剂蛋白的大肠杆菌的工作种子批菌种接种于600mL一级种子培养基中，分为2批，在35℃，200rpm下培养8h至OD600为1即为一级种子液；在30℃，200rpm，通气量24L/min下调节罐压为0.035MPa，向32L二级种子培养基中补加10wt%硫酸镁溶液12.8L、46.5wt%葡萄糖溶液9.2L、微量元素溶液5L、硫酸亚铁溶液2.8L，接种一级种子液，培养5h，OD600为1.5时即为二级种子液；[0059] S2、将全部种子液接种在灭菌培养基中，发酵培养温度为30℃，pH设置为7.0，在发酵过程中保持发酵液中溶解氧饱和度≥30%，并根据葡萄糖消耗情况进行补料操作，待OD600值达到100时，停止补料，加入IPTG溶液800mL进行诱导，诱导结束后继续发酵培养，同时进行补料操作，培养9h后终止发酵；[0060] S3、离心收集菌体，﹣20℃下冻存，对菌体进行初步纯化后将收集的菌体按1：9的重量比用菌体重悬缓冲液悬起，以50rpm转速搅拌2h，调节pH至5.5，在＜10℃下，650bar均质1次，850bar均质2次后调节pH至5.55后，离心收集上清液；过滤澄清，收集滤液即为重组人白细胞介素‑1拮抗剂初提液，经柱层析后置换缓冲液(枸橼酸钠2.85g/kg，依地酸二钠0.2g/kg，氯化钠8.18g/kg，无水枸橼酸0.02g/kg，pH6.50)，最终浓缩液的蛋白浓度应≥120mg/mL，除菌过滤成重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂原液；[0061] S4、将原液用稀释液稀释至所需浓度后加入聚山梨酯80，使重组人白细胞介素‑1拮抗剂终浓度为100mg/mL，枸橼酸钠终浓度为2.85mg/mL，依地酸二钠终浓度为0.20mg/mL，氯化钠终浓度为8.18mg/mL，无水枸橼酸终浓度为0.058mg/mL，聚山梨酯80终浓度为1.05mg/mL，经除菌过滤，即为半成品，经检定、分批、分装、包装即得；[0062] 图1按照《中华人民共和国药典》（现行版）通则3405测定重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂原液的肽图，采用胰蛋白裂解法反相HPLC法分离测定，测试结果表明肽图与理化对照品基本一致，特异性肽段标注：在10min至15min之间有一明显肽段峰，为T1；在25min至30min之间有一明显肽段峰，为T17；在40至45min之间有一组肽段峰，第一个为T16；[0063] 图2按照《中华人民共和国药典》（现行版）通则0512高效液相色谱法测定重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的纯度，采用反相HPLC法分析，按面积归一化法计算，测试结果表明重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂注射液主峰峰面积不低于95.0%，主峰及其相关蛋白峰面积应不低于总面积的98.0%；[0064] 图3采用高效液相色谱法法测定重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的蛋白含量，测试结果表明成品的蛋白量为标示量（80mg）的90.0 110.0%。~[0065] 实施例2[0066] 一种重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的制备方法，包括如下步骤：[0067] S1、将高效表达人白细胞介素‑1受体拮抗剂蛋白的大肠杆菌的工作种子批菌种接种于600mL一级种子培养基中，分为2批，在35℃，200rpm下培养8h至OD600为1即为一级种子液；在30℃，200rpm，通气量24L/min下调节罐压为0.035MPa，向32L二级种子培养基中补加10wt%硫酸镁溶液12.8L、46.5wt%葡萄糖溶液9.2L、微量元素溶液5L、硫酸亚铁溶液2.8L，接种一级种子液，培养5h，OD600为1.5时即为二级种子液；[0068] S2、将全部种子液接种在灭菌培养基中，发酵培养温度为30℃，pH设置为7.0，在发酵过程中保持发酵液中溶解氧饱和度≥30%，并根据葡萄糖消耗情况进行补料操作，待OD600值达到100时，停止补料，加入IPTG溶液800mL进行诱导，诱导结束后继续发酵培养，同时进行补料操作，培养9h后终止发酵；[0069] S3、离心收集菌体，﹣20℃下冻存，对菌体进行初步纯化后将收集的菌体按1：9的重量比用菌体重悬缓冲液悬起，以50rpm转速搅拌2h，调节pH至5.5，在＜10℃下，650bar均质1次，850bar均质2次后再次调节pH至5.55，离心收集上清液；过滤澄清，收集滤液即为重组人白细胞介素‑1拮抗剂初提液，经柱层析后加入到水中，浓度≥150mg/mL，加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐以及聚乙二醇衍生物，室温下搅拌3h后经酸洗、碱洗、盐水洗涤后透析3d，重组人白细胞介素‑1拮抗剂与1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐以及聚乙二醇衍生物的摩尔比为1:1.6:0.2，置换缓冲液(枸橼酸钠2.85g/kg，依地酸二钠0.2g/kg，氯化钠8.18g/kg，无水枸橼酸0.02g/kg，pH6.50)，最终浓缩液的蛋白浓度应≥120mg/mL，除菌过滤成重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂原液；[0070] S4、将原液用稀释液稀释至所需浓度后加入聚山梨酯80，使重组人白细胞介素‑1拮抗剂终浓度为100mg/mL，枸橼酸钠终浓度为2.85mg/mL，依地酸二钠终浓度为0.20mg/mL，氯化钠终浓度为8.18mg/mL，无水枸橼酸终浓度为0.058mg/mL，聚山梨酯80终浓度为1.05mg/mL，振荡7h后，经除菌过滤，即为半成品，经检定、分批、分装、包装即得。[0071] 所述聚乙二醇衍生物的制备方法，包括如下步骤：[0072] X1、将维生素E‑醋酸酯加入到乙醇中，再加入0.5mol/L氢氧化钠水溶液，维生素E‑醋酸酯与氢氧化钠的摩尔比为1:1，至pH为7后搅拌4h，搅拌结束后加入二氯甲烷萃取，合并有机相后加入稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤后浓缩得残余物与马来酸酐、对二甲氨基吡啶加入到二氯甲烷中，残余物与马来酸酐、对二甲氨基吡啶的摩尔比为1:2.5:1.1，在氮气气氛下搅拌24h，加入冷乙醚稀释后有沉淀出现，透析3d后用于下一步；[0073] X2、将上一步的产物与对二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺加入到二氯甲烷中，在氮气气氛下搅拌24h，过滤后与30wt%八臂‑聚乙二醇‑羟基的二氯甲烷溶液混合，上一步的产物与对二甲氨基吡啶、二环己基碳二亚胺、八臂‑聚乙二醇‑羟基的摩尔比为1:1.1:1.2:0.1，继续搅拌24h后加入冷乙醚稀释后有沉淀出现，洗涤3次后透析3d干燥即得。[0074] 对照例1[0075] 与实施例2基本相同，唯一区别在于将聚乙二醇衍生物替换为聚乙二醇。[0076] 对照例2[0077] 与实施例2基本相同，唯一区别在于将聚乙二醇衍生物替换为八臂‑聚乙二醇‑羟基。[0078] 测试例1[0079] 对实施例及对照例中的重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂进行治疗大鼠急性痛风性关节炎模型药效实验。从180只雄性SD大鼠，SPF级，供应单位：上海吉辉实验动物饲养有限公司，从大鼠中随机选取120只进行造模，剩余20只不造模。在造模大鼠的两后肢踝关节腔内各注射50μLMSU(60mg/mL)，以注射后踝关节囊立即鼓起作为造模成功标准。120只造模成功大鼠按体重随机分成6组，分别为模型对照组(0mg/kg)，受试样品组(30mg/kg)和秋水仙碱对照组(0.3mg/kg)，20只/组。另20只未造模大鼠作为正常对照组。正常对照组、模型组、受试样品组大鼠在造模后约6 7h进行首次皮下注射给药，正常对照组和模型组注射等~量生理盐水，然后在造模后24h、48h各给药1次，给药体积为lmL/kg。秋水仙碱阳性组在造模后约6 7h进行首次灌胃给药，间隔3 4h后进行第2次给药，然后在造模后24h、36h、48h各给~ ~药1次，给药体积5mL/kg。正常对照组与受试组在造模后51h解剖，摘取踝关节囊组织，称量湿重，并记录，取平均值；[0080][0081] 如表1所示，从测试结果可以看到，受试样品重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂皮下注射给药，能显著降低关节腔内注射MSU诱导的大鼠急性痛风性关节炎模型在造模后的关节肿胀程度，而实施例2与实施例1相比抑制关节肿胀的效果更好，这可能是由于实施例2中对重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂进行了修饰，而实施例2中修饰采用的两亲性的聚乙二醇衍生物能够对重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂进行保护，该衍生物具有更低的表面张力，更高的稳定性，以及更大的空间位阻，因而能够影响重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的聚集速率，从而防止其产生二聚体沉淀，进而提升有关制剂的稳定性。而具有两亲性的特殊结构意味着其不仅具备良好的水溶性，还具有脂溶性，因此能够帮助被修饰的重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂更好地与细胞结合，从而更好、更快地发挥治疗效果。而实施例1中未对重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂进行修饰，这加大了重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂降解的可能性，也没有增大其脂溶性，而对照例1 2中虽然对重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂~进行了修饰，但是同样未能增大制剂的脂溶性。因此，实施例2中的抑制关节肿胀效果最好。[0082] 测试例2[0083] 对实施例及对照例所制备的重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂进行稳定性测试，经凝胶柱将重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂交换为pH=5的乙酸钠溶液，随后无菌过滤，浓度为1mg/mL，室温下储存，观察是否有沉淀出现，并在30d后经色谱分析检测是否有降解产物出现；[0084][0085] 如表2所示，从实验结果可以看到，实施例2中的重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂稳定性最好，经过30d也无沉淀，也很少出现降解，这可能是由于实施例2中修饰采用的两亲性的聚乙二醇衍生物能够对重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂进行保护，该衍生物具有更低的表面张力，更高的稳定性，以及更大的空间位阻，因而能够影响重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂的聚集速率，从而防止其产生二聚体沉淀，进而提升有关制剂的稳定性。而实施例1中未对重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂进行修饰，重组人白细胞介素‑1受体拮抗剂本身即可发生不可逆的降解，因此稳定性较差。而对照例1 2由于对重组人白细胞介素‑1受体拮抗~剂进行了修饰，因此同样能够提高稳定性，只是效果不如实施例2。[0086] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

专利地区：吉林

专利申请日期：2024-08-05

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN118593688B