一种鼠李糖乳杆菌及其应用发明专利

专利名称：一种鼠李糖乳杆菌及其应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202410238340.1

专利申请（专利权）人：东北农业大学
权利人地址：黑龙江省哈尔滨市香坊区长江路600号

专利发明（设计）人：满朝新,张宇,苗超,姜毓君,赵倩玉

专利摘要：本发明公开了一种鼠李糖乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)JY027，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2022年11月21日，保藏编号为GDMCC NO：62991。本发明的鼠李糖乳杆菌JY027及其胞外多糖，相比于单独的鼠李糖乳杆菌，其对小鼠的血清中的尿酸、尿液中尿酸和肝脏中黄嘌呤氧化酶含量具有明显的降低趋势。相比于单独的鼠李糖乳杆菌胞外多糖，其使小鼠空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白‑胆固醇水平明显降低而高密度脂蛋白‑胆固醇明显升高，因此本发明可以用于缓解/治疗糖尿病并发高尿酸血症的情况。

主权利要求：
1.鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillusrhamnosus）JY027，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，广州，保藏日期为2022年11月21日，保藏编号为GDMCCNO：62991。
2.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌JY027的胞外多糖的制法，其特征在于，包括以下步骤：将活化后的鼠李糖乳杆菌JY027以5%的比例接种于无菌MRS液体培养基中，于37℃厌氧的条件下培养24h后，将培养液于4℃条件下10000g离心10min，弃菌体沉淀取上清发酵液，加入80%的三氯乙酸溶液，使其最终浓度为4%，于4℃静置12h；离心除去蛋白质沉淀；离心之后的上清液通过旋蒸浓缩体积至原体积的20%，然后加入3倍体积冷却的无水乙醇至最终浓度75%，置于4℃静置12h，10000g离心10min收集沉淀，加适量去离子水溶解沉淀；将溶液用8000‑13000Da的透析袋透析72h，期间每8h换一次去离子水；透析完成后进行真空冷冻干燥，最后获得EPS。
3.含有根据权利要求2所述的鼠李糖乳杆菌JY027的胞外多糖的制法获得的鼠李糖乳杆菌JY027的胞外多糖的复合物，其特征在于，由鼠李糖乳杆菌JY027和EPS组成，鼠李糖乳9
杆菌JY027的活菌数不低于10cfu/mL；鼠李糖乳杆菌JY027和EPS的体积质量比为0.2mL：
150mg。 说明书 : 一种鼠李糖乳杆菌及其应用技术领域[0001] 本发明涉及一种鼠李糖乳杆菌及其应用，尤其涉及一种鼠李糖乳杆菌JY027及其胞外多糖、复合物及其在制备缓解2型糖尿病并发高尿酸血症药物中的应用，属于微生物技术领域。背景技术[0002] 如今，人们饮食结构的改变致使人体内尿酸含量增加，从而导致高尿酸血症的频发。高尿酸血症是一种嘌呤在机体内代谢紊乱导致的慢性疾病。其不仅是痛风发病的生化基础，也易导致糖尿病、动脉粥样硬化、肥胖症、尿酸性肾病等多种慢性疾病的发生。2型糖尿病是最常见的糖尿病类型，其特征是血糖水平升高。2型糖尿病与胰岛素抵抗和相对胰岛素分泌不足有关。胰岛素是一种负责帮助身体的细胞吸收葡萄糖的重要激素。胰岛素抵抗意味着身体的细胞对胰岛素的反应减弱，导致血糖水平升高。而高尿酸血症与2型糖尿病之间的联系是双向的，二者相互影响并加剧病情。它们都是代谢综合征的组成部分，会增加心血管疾病风险的因素，包括高血压、腹型肥胖、高血糖和异常的脂质代谢，从而对人体的生命健康造成严重威胁。[0003] 机体处于高尿酸水平可能与胰岛素抵抗有关，而胰岛素抵抗是2型糖尿病的核心机制之一。研究表明，尿酸可能直接影响胰岛素的信号传导路径，从而降低其效果，加剧或促进糖尿病的发展。高尿酸水平也与系统性炎症增加有关，而炎症又是2型糖尿病发展的一个关键因素。尿酸晶体可在体内沉积，触发炎症反应，进一步加剧胰岛素抵抗。而且高尿酸血症与血管内皮功能障碍有关，内皮功能障碍是2型糖尿病患者心血管并发症的重要前驱状态。同样2型糖尿病患者常常存在胰岛素抵抗，不仅影响葡萄糖的代谢，也可能影响尿酸的排泄。研究表明，胰岛素抵抗可能导致尿酸排泄减少，从而增加血尿酸水平。糖尿病还可以导致肾脏疾病，包括糖尿病肾病等肾脏损伤。肾脏功能减弱会降低其清除尿酸的能力，导致高尿酸血症。[0004] 目前，对于高尿酸血症和2型糖尿病的防治措施主要包括药物治疗与减少高嘌呤、高糖类饮食的摄入。而药物均具有一定的副作用不能被广泛使用。此外，服用药物的同时还需患者控制饮食，这将会导致患者营养失衡。由于目前的治疗手段需要患者控制饮食且药物副作用大，且大多数患者无法实现长期控制。因此探寻新型缓解高尿酸血症和2型糖尿病的方法已成为各界研究的热点。[0005] 益生菌是定殖在人体内且可以给宿主的健康带来益处的活性微生物。益生菌既可以促进肠道健康，还具有增强免疫系统、促进心血管健康和抗过敏等益生功能。胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)是一类由益生菌产生的高分子多糖，这些多糖被分泌到细胞外环境中。EPS具有多种生物活性，对人体健康有着积极的影响，包括改善肠道健康、增强免疫系统、抗炎、抗氧化等作用。益生菌及胞外多糖可以协同发挥作用，其中益生菌可以帮助维持肠道菌群的平衡，而EPS则通过形成保护膜来抵抗病原菌，减少肠道炎症，促进肠黏膜的修复，从而改善肠道健康。[0006] 综上所述，可以通过使用益生菌与其产生的胞外多糖协同发挥作用，替代药物和控制患者饮食缓解2型糖尿病并发高尿酸血症，可以有效降低这两者对于患者的负面影响。[0007] 故亟需一种具有高效缓解2型糖尿病并发高尿酸血症作用的鼠李糖乳杆菌及其胞外多糖的应用。发明内容[0008] 本发明的目的是为了提供一种鼠李糖乳杆菌JY027。[0009] 同时，本发明的目的是为了提供一种鼠李糖乳杆菌JY027的胞外多糖。[0010] 同时，本发明的目的是为了提供一种鼠李糖乳杆菌JY027的胞外多糖的制法。[0011] 同时，本发明的目的是为了提供一种含有鼠李糖乳杆菌JY027的胞外多糖的复合物，该复合物具有缓解2型糖尿病并发高尿酸血症的作用。[0012] 同时，本发明的目的是为了提供一种含有鼠李糖乳杆菌JY027及其胞外多糖的复合物在制备缓解2型糖尿病并发高尿酸血症药物中的应用。[0013] 同时，本发明的目的是为了提供一种含有鼠李糖乳杆菌JY027及其胞外多糖的复合物在制备治疗2型糖尿病并发高尿酸血症药物中的应用。[0014] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：[0015] 鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)JY027，所述鼠李糖乳杆菌JY027保藏于广东省微生物菌种保藏中心，广州，保藏日期为2022年11月21日，保藏编号为GDMCCNO：62991。[0016] 鼠李糖乳杆菌JY027的胞外多糖的制法，包括以下步骤：将活化后的鼠李糖乳杆菌JY027以5％的比例接种于无菌MRS液体培养基中，于37℃厌氧的条件下培养24h后，将培养液于4℃条件下10000g离心10min，弃菌体沉淀取上清发酵液，加入80％的三氯乙酸溶液，使其最终浓度为4％，于4℃静置12h；离心除去蛋白质沉淀；离心之后的上清液通过旋蒸浓缩体积至原体积的20％，然后加入3倍体冷却的无水乙醇至最终浓度75％，置于4℃静置12h，10000g离心10min收集沉淀，加适量去离子水溶解沉淀；将溶液用8000‑13000Da的透析袋透析72h，期间每8h换一次去离子水；透析完成后进行真空冷冻干燥，最后获得EPS。[0017] 鼠李糖乳杆菌JY027的胞外多糖，EPS的纯度在80％以上。[0018] 含有鼠李糖乳杆菌JY027的胞外多糖的复合物，由鼠李糖乳杆菌JY027和EPS组成，9鼠李糖乳杆菌JY027的活菌数不低于10cfu/mL；鼠李糖乳杆菌JY027和EPS的体积质量比为0.2mL：150mg。[0019] 本发明的复合物在制备缓解2型糖尿病并发高尿酸血症药物中的应用。[0020] 本发明的复合物在制备治疗2型糖尿病并发高尿酸血症药物中的应用。[0021] 本发明的鼠李糖乳杆菌JY027在制备缓解2型糖尿病并发高尿酸血症药物中的应用。[0022] 本发明的鼠李糖乳杆菌JY027在制备治疗2型糖尿病并发高尿酸血症药物中的应用。[0023] 本发明具有以下有益效果：[0024] 本发明所提供的鼠李糖乳杆菌及其胞外多糖，可以降低2型糖尿病并发高尿酸血症小鼠血清中尿酸、尿液中尿酸和肝脏中黄嘌呤氧化酶(XOD)含量。[0025] 本发明所提供的鼠李糖乳杆菌及其胞外多糖，可以降低2型糖尿病并发高尿酸血症小鼠空腹血糖、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白‑胆固醇(LDL‑C)、高密度脂蛋白‑胆固醇(HDL‑C)含量。[0026] 本发明所提供的鼠李糖乳杆菌及其胞外多糖，可以缓解小鼠2型糖尿病并发高尿酸血症，可作为功能性食品添加剂供人体食用。[0027] 本发明所提供的鼠李糖乳杆菌JY027及其胞外多糖，相比于单独的鼠李糖乳杆菌，其对小鼠的血清中的尿酸、尿液中尿酸和肝脏中黄嘌呤氧化酶含量具有明显的降低趋势。相比于单独的鼠李糖乳杆菌胞外多糖，其使小鼠空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白‑胆固醇水平明显降低而高密度脂蛋白‑胆固醇明显升高，因此该鼠李糖乳杆菌JY027及其胞外多糖可以用于缓解/治疗糖尿病并发高尿酸血症的情况。附图说明[0028] 图1为本发明中各组小鼠血清中尿酸含量变化结果图；[0029] 图2为本发明中各组小鼠尿液中尿酸含量变化结果图；[0030] 图3为本发明中各组小鼠肝脏中XOD含量变化结果图；[0031] 图4为本发明中各组小鼠空腹血糖含量变化结果图；[0032] 图5为本发明中各组小鼠血清中TC含量变化结果图；[0033] 图6为本发明中各组小鼠血清中TG含量变化结果图；[0034] 图7为本发明中各组小鼠血清中LDL‑C含量变化结果图；[0035] 图8为本发明中各组小鼠血清中HDL‑C含量变化结果图。具体实施方式[0036] 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。[0037] 本发明中，鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)JY027分离自西藏传统发酵乳制品，该菌株经测序分析，其16SrDNA序列如下(SEQIDNO:1)：CCTCGCAGGCTGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAACGAGTTCTGATTATTGAAAGGTGCTTGCATCTTGATTTAATTTTGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAAATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGACAAGGGGATTGC，将测序得到的序列在NCBI数据库中进行核酸序列比对，结果显示菌株为鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)JY027，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，广州，保藏日期为2022年11月21日，保藏编号为GDMCCNO：62991。鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)JY027(下文中简称JY027)在MRS培养基上的菌落突起，表面光滑、圆形、水润、白色不透明、直径为0.8～1.6mm。[0038] 鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)JY027的筛选、鉴定、培养、观察和保存如下：[0039] 1、筛选[0040] 取1g来源于西藏的传统发酵乳制品，梯度稀释后涂布于MRS固体培养基(含快速筛选)中，置于37℃厌氧环境中培养48h，观察并记录菌落形态；挑取表面湿润、有凸起的、白色的菌落在MRS固体培养基上划线，于37℃厌氧的条件下进行纯化培养，重复此操作3次，获得纯化后的单菌落；挑取单菌落在MRS固体培养基上划线，37℃厌氧培养48h。[0041] 2、鉴定[0042] 提取筛选得到的菌株的基因组，将菌株的16SrDNA进行扩增和测序(扩增得到的16SrDNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示)，将获得的序列在NCBI‑Blast中进行核酸序列比对，结果显示菌株为鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)JY027。[0043] 其中，16SrDNA扩增所用引物如下：[0044] 27F上游引物：5’‑AGTCTCTGATCATGCCTCAG‑3’；[0045] 1492R下游引物：5’‑AAGGAGGTGCTCCAGCC‑3’；[0046] 16SrDNA扩增程序如下：[0047] 95℃5min；35个循环(95℃30s；55℃30s；72℃2min)；72℃10min。[0048] 4、保存[0049] 挑取鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)JY027的单菌落接入MRS液体培养基中，于37℃厌氧的条件下培养17h，得到菌液；在所得菌液中加入灭菌后的80％(v/v)甘油混匀后‑80℃保存于甘油管中。同时，将鼠李糖乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，广州，保藏日期为2022年11月21日，保藏编号为：GDMCCNO：62991。[0050] (1)鼠李糖乳杆菌JY027胞外多糖的提取[0051] 将活化后的鼠李糖乳杆菌JY027以5％的比例接种于无菌MRS液体培养基中，于37℃厌氧的条件下培养24h后。将培养液于4℃条件下10000g离心10min，弃菌体沉淀取上清发酵液，加入80％的三氯乙酸溶液，使其最终浓度为4％，于4℃静置12h。离心除去蛋白质沉淀。离心之后的上清液通过旋蒸浓缩体积至原体积的20％，然后加入3倍体积冷却的无水乙醇至最终浓度75％，置于4℃静置12h，10000g离心10min收集沉淀，加适量去离子水溶解沉淀。将溶液用8000‑13000Da的透析袋透析72h，期间每8h换一次去离子水。透析完成后进行真空冷冻干燥，最后获得EPS。使用苯酚‑硫酸法测定提取的多糖纯度，保证纯度在80％以上以便用于体内实验。[0052] (2)动物模型的建立[0053] 试验使用50只7‑8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重25‑30g。使用正常饲料、自由饮水适应性喂养1周后，随机分为5组(每组10只)：正常组(NC)、高尿酸血症并发糖尿病组(HUA+DM)、鼠李糖乳杆菌JY027组(LR)、鼠李糖乳杆菌JY027胞外多糖组(EPS)、菌糖复合组(LR+EPS)。除正常组外其余组使用高脂高糖饲料喂养4周。造模前禁食不禁水12h，腹腔注射链脲佐菌素150μg/g，72h后测小鼠尾静脉随机血糖，大于11.1mmol/L为造模成功。使造模成功的小鼠血糖稳定1周后，灌胃500mg/kg·d的次黄嘌呤并注射100mg/kg·d的氧嗪酸钾，共4周，9从灌胃次黄嘌呤的第8天开始给药，持续21天。给药组分别为0.2mL的10 cfu/mL鼠李糖乳杆9菌JY027、150mg/kg.bw的EPS和0.2mL的10cfu/mL鼠李糖乳杆菌JY027及150mg/kg.bw的EPS复合物。[0054] (3)菌糖复合物对小鼠高尿酸血症的作用[0055] 试验结束前小鼠禁食12h，然后眼球取血，血液经离心后收集小鼠血清，用于测定小鼠血清中的尿酸含量，将收集的小鼠血清按照试剂盒说明检测血清中的尿酸水平。试验结束前一天，收集小鼠的尿液，用于测定小鼠尿液中尿酸含量。收集的小鼠尿液按照试剂盒说明检测尿液中的尿酸水平。试验结束后，小鼠麻醉断颈处死，体表经消毒后进行解剖，收集小鼠的肝脏置于液氮速冻后‑80℃保存。将小鼠肝脏加入pH＝7.4的PBS缓冲液，肝脏质量：PBS溶液＝1：9(m/v)，冰浴匀浆后经3100g离心10min收集上清，按照试剂盒说明检测小鼠肝脏中XOD含量。[0056] 结果：如图1‑图3所示，相比于NC组，HUA+DM组小鼠血清尿酸、尿液尿酸及肝脏中XOD均有不同程度的升高(p<0.05)。但经灌胃鼠李糖乳杆菌JY027和胞外多糖后，各组含量相比于HUA+DM组均有不同程度的降低，LR组对三个指标的降低程度比单独的EPS灌胃要明显一些，说明该菌株具有一定的降尿酸功能。而经菌糖复合灌胃后，小鼠血清尿酸、尿液尿酸及肝脏中XOD三个指标的降低效果最显著(p<0.05)，说明菌糖复合起到了协同作用，使菌株的降尿酸效果更好。[0057] (4)菌糖复合物对小鼠糖尿病的作用[0058] 试验结束前小鼠禁食12h，然后眼球取血，血液经离心后收集小鼠血清，用于测定小鼠血糖、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白‑胆固醇(LDL‑C)、高密度脂蛋白‑胆固醇(HDL‑C)含量。[0059] 结果：如图4‑图8所示，相比于NC组，HUA+DM组小鼠空腹血糖、TC、TG、LDL‑C含量均有不同程度的升高，而HDL‑C值明显降低(p<0.05)。但经灌胃鼠李糖乳杆菌JY027和胞外多糖后，各组含量相比于HUA+DM组均有不同程度的降低(升高)，EPS组对几个指标的缓解程度比单独灌胃菌株的效果要明显一些，说明该多糖具有一定的降血糖功能。而经菌糖复合灌胃后，小鼠血糖等指标的缓解效果最显著(p<0.05)，说明菌糖复合起到了协同作用，使菌株的降血糖效果更好。[0060] 综上所述，本发明的鼠李糖乳杆菌JY027及其胞外多糖可以缓解、治疗2型糖尿病并发高尿酸血症。[0061] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

专利地区：黑龙江

专利申请日期：2024-03-03

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN117904000B