植物乳植杆菌TRB14及其在发酵转化人参皂苷Rb1制备稀有人参皂苷中的应用

专利名称：植物乳植杆菌TRB14及其在发酵转化人参皂苷Rb1制备稀有人参皂苷中的应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202311619388.9

专利申请（专利权）人：吉林省农业科学院(中国农业科技东北创新中心)
权利人地址：吉林省长春市净月开发区彩宇大街1363号

专利发明（设计）人：李盛钰,杨舸,高岩松,高磊,赵玉娟,赵子健

专利摘要：植物乳植杆菌TRB14及其在发酵转化人参皂苷Rb1制备稀有人参皂苷中的应用，涉及益生菌发酵领域。植物乳植杆菌TRB14于2023年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20231992。本发明以人参皂苷Rb1为原料，利用该植物乳植杆菌TRB14对人参皂苷Rb1进行生物发酵转化获得了含量较高的稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5，具有反应温和、成本低、工艺安全的优点，为稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5的制备提供新途径。

主权利要求：
1.植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14，其特征在于，已于2023年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M20231992。
2.如权利要求1所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14在发酵转化人参皂苷Rb1制备稀有人参皂苷中的应用，其特征在于，所述稀有人参皂苷为20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述稀有人参皂苷的生物转化合成路线为：所述人参皂苷Rb1在植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14水解人参皂苷Rb1C‑20位的葡萄糖后脱水生成稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：制备植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14菌悬液；
将植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14接种于液体MRS培养基，37～
45℃静置培养16～25h，4～10℃、4000～8000rpm离心5～10min，收集菌体沉淀，用发酵灭菌
9 10
培养基水溶液悬浮，调整活菌数为1.0×10 ～1.0×10 CFU/ml，获得植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14菌悬液；
步骤二：发酵转化；
配置液体发酵培养基，向其中加入10～20g/L人参皂苷Rb1，并以10～30ml/L的接种量接种植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14菌悬液，37～42℃静置发酵14～28天；发酵结束后，所得发酵产物进行低温减压浓缩及冷冻干燥，其产物用甲醇萃取，离心，上清减压回收溶剂后进行冷冻干燥，获得含有稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5的干燥产物。 说明书 : 植物乳植杆菌TRB14及其在发酵转化人参皂苷Rb1制备稀有人
参皂苷中的应用技术领域[0001] 本发明涉及益生菌发酵技术领域，具体涉及一种植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14及其在发酵转化人参皂苷Rb1制备稀有人参皂苷中的应用。背景技术[0002] 人参(Panaxginseng)被广泛认为是一种珍贵的中草药，拥有多种药理活性成分，其中最重要的是人参皂苷。人参皂苷被认为具有多种药用和保健效应，如抗疲劳、改善认知功能、提高免疫力和抗氧化等作用。然而，不同种类的人参皂苷在药效上存在差异，其中一些具有强大的药理活性，被称为稀有人参皂苷。[0003] 乳酸菌是一类益生菌，已广泛用于食品发酵、益生菌制备和药物生产等领域。近年来，乳酸菌的发酵技术引起了对其在草本植物活性成分提取和改良中的应用的兴趣。将乳酸菌应用于人参皂苷的转化和提取是一种新颖的方法，旨在提高人参提取物中稀有人参皂苷的含量，从而提高其药理活性和药效。乳酸菌发酵技术为提高草本药物的药效和品质提供了一种新的方法。通过这一技术，可以转化人参皂苷，尤其是稀有人参皂苷，为药物和保健品制备带来新的机遇。这不仅提高了中药制剂的质量，还降低了生产成本，同时也为医药和保健领域带来了更多的创新。未来的研究和实践将进一步探索乳酸菌发酵技术在活性成分提取和改进中的应用，为植物药物的研究和开发提供可能性。目前，利用乳酸菌转化稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5的报道并不多。发明内容[0004] 为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种植物乳植杆菌TRB14(Lactiplantibacillusplantarum)及其在发酵转化人参皂苷Rb1制备稀有人参皂苷中的应用。本发明以人参皂苷Rb1为底物，利用所提取的植物乳植杆菌TRB14进行发酵转化来制备稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5。[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：[0006] 本发明提供的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14，已于2023年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M20231992。[0007] 本发明提供的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14在发酵转化人参皂苷Rb1制备稀有人参皂苷中的应用。[0008] 作为一种优选的实施方式，所述稀有人参皂苷包括20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5。[0009] 作为一种优选的实施方式，所述稀有人参皂苷的生物转化合成路线为：所述人参皂苷Rb1在植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14水解人参皂苷Rb1C‑20位的葡萄糖后脱水生成稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5。[0010] 作为一种优选的实施方式，本发明提供的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14在发酵转化人参皂苷Rb1制备稀有人参皂苷中的应用，主要包括以下步骤：[0011] 步骤一：制备植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14菌悬液；[0012] 将植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14接种于液体MRS培养基，37～45℃静置培养16～25h，4～10℃、4000～8000rpm离心5～10min，收集菌体沉淀，用9 10发酵灭菌培养基水溶液悬浮，调整活菌数为1.0×10 ～1.0×10 CFU/ml，获得植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14菌悬液；[0013] 步骤二：发酵转化；[0014] 配置液体发酵培养基，向其中加入10～20g/L人参皂苷Rb1，并以10～30ml/L的接种量接种植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14菌悬液，37～42℃静置发酵14～28天；发酵结束后，所得发酵产物进行低温减压浓缩及冷冻干燥，其产物用甲醇萃取，离心，上清减压回收溶剂后进行冷冻干燥，获得干燥产物，该干燥产物中含有稀有人参皂苷。[0015] 作为一种优选的实施方式，所述液体发酵培养基包括：葡萄糖2～5g/L和酵母浸粉1～3g/L；pH6.0～7.0。[0016] 本发明的有益效果如下：[0017] 为了实现生物转化制备稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5，本发明首先从传统发酵的腌黄瓜样品中筛选到了一株菌株TRB14，并对其进行了鉴定，结果鉴定为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)，并于2023年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M20231992。然后以人参皂苷Rb1为原料，利用该植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14对人参皂苷Rb1进行生物发酵转化获得了稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5，同时采用HPLC色谱分析法对转化后的稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1、Rg5进行了鉴定，结果显示人参皂苷Rb1转化产物与稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5标准品的保留时间一致。因此利用本发明的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14发酵转化人参皂苷Rb1能够获得高含量的稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5，具有反应温和、成本低、工艺安全的优点，并且所制备的稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5用途广泛，具有广阔的应用前景。附图说明[0018] 图1为人参皂苷Rb1发酵第0、7、14、21、28天的HPLC色谱图。[0019] 图2为稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1、Rg5的生物转化合成路线。具体实施方式[0020] 本发明提供的一株植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14，已于2023年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M20231992。[0021] 本发明提供了植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14在发酵转化人参皂苷Rb1制备稀有人参皂苷中的应用，其主要包括以下步骤：[0022] 步骤一：制备植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14菌悬液；[0023] 将植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14接种于液体MRS培养基，37～45℃静置培养16～25h，4～10℃、4000～8000rpm离心5～10min，收集菌体沉淀，用9 10发酵灭菌培养基水溶液悬浮，调整活菌数为1.0×10 ～1.0×10 CFU/ml，获得植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14菌悬液；[0024] 步骤二：发酵转化；[0025] 配置液体发酵培养基，液体发酵培养基包括葡萄糖2～5g/L和酵母浸粉1～3g/L；pH6.0～7.0；向液体发酵培养基中加入10～20g/L人参皂苷Rb1，并以10～30ml/L的接种量接种植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14菌悬液，37～42℃静置发酵14～28天；发酵结束后，所得发酵产物进行低温减压浓缩及冷冻干燥，其产物用甲醇萃取，离心，上清减压回收溶剂后进行冷冻干燥，获得干燥产物，该干燥产物中含有稀有人参皂苷。[0026] 其中，稀有人参皂苷主要包括20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5。[0027] 其中，稀有人参皂苷的生物转化合成路线为：所述人参皂苷Rb1在植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14水解人参皂苷Rb1C‑20位的葡萄糖后脱水生成稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5。[0028] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。[0029] 实施例1菌株的分离、鉴定和保藏[0030] 1、菌株的分离[0031] 分离菌株所采用的样品为2018年9月采集自吉林省延吉市传统发酵的腌黄瓜样品。将采集的传统发酵的腌黄瓜样品进行研磨，然后用无菌生理盐水按10的倍数进行逐级稀释获取稀释液；将各级稀释液分别涂布于添加有溴甲酚紫的产酸菌分离培养基平板上，并在37℃下培养48h；产酸菌分离培养基平板上出现单菌落时，根据单菌落形态挑取能够使溴甲酚紫产生变色的菌落一半进行镜检，菌落另一半接入MRS固体培养基进行继续培养，进一步挑出G(+)菌落，如此反复3次，分离纯化得到纯培养；将获得的纯培养的菌种接种到液体MRS培养基中继续培养，加入60％甘油后，置于‑80℃冰箱保存。将其中1株乳杆菌命名为TRB14。[0032] 2、菌株的鉴定[0033] (1)菌株TRB14的生理生化鉴定结果：革兰氏染色阳性，过氧化氢酶试验阴性，联苯胺试验阴性，吲哚试验阴性，乙酰甲基甲醇试验阳性；不水解淀粉，不液化明胶，不产生硫化氢，发酵葡萄糖产酸不产气；不运动的杆菌；在15℃和45℃能够生长，最适生长温度为37～42℃；适宜pH为5.0～7.0；耐受6.5％NaCl；在液体MRS培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。[0034] (2)16SrDNA序列同源性分析：提取菌株TRB14基因组DNA，采用16sF和16sR组成的引物对(16sF：5＇‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3＇；16sR：5＇‑AGAAAGGAGGTGATCCAGC‑3＇)进行PCR扩增，PCR扩增条件为：预变形：95℃5min；变性：95℃15s，退火：55℃15s，延伸：72℃1.5min，共35个循环；最后延伸：72℃7min，4℃保存。然后将扩增产物进行测序，16srDNA序列如SEQIDNO:1所示；将16srDNA序列通过BLAST程序在GenBank库中进行同源性比对分析，发现菌株TRB14与LactiplantibacillusplantarumstrainMSJK0068(GenBank:CP136674.1)的同源性达到99 .7％。根据以上结果，菌株TRB14被鉴定为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)。[0035] 其中，所说的引物对序列信息具体如下：[0036] 16sF：5＇‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3＇；[0037] 16sR：5＇‑AGAAAGGAGGTGATCCAGC‑3＇。[0038] 3、菌株的保藏[0039] 本发明的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14，已于2023年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学保藏中心)，保藏编号为：CCTCCNO：M20231992。[0040] 实施例2利用植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14发酵转化人参皂苷Rb1制备稀有人参皂苷[0041] 1、植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14菌悬液的制备[0042] 将植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14接种于液体MRS培养基，37℃静置培养16h，4℃、6000rpm离心8min，收集菌体沉淀；用发酵灭菌培养基水溶液悬9浮，调整活菌数为1.0×10CFU/mL，获得植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14菌悬液。[0043] 2、准备人参皂苷Rb1[0044] 采用商购人参皂苷Rb1，购自上海源叶生物技术有限公司，其纯度大于98％。[0045] 3、发酵转化[0046] 配置液体发酵培养基，液体发酵培养基包括葡萄糖3g/L和酵母浸粉1g/L，pH6.6，在121℃灭菌15min制备获取。液体发酵培养基中，人参皂苷Rb1的添加量为10g/L，并按10ml/L的接种量接种植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14菌悬液，37℃静置发酵21天。发酵结束后，所得发酵产物进行低温(50℃)减压浓缩以及真空冷冻干燥(‑80℃，5pa)后，其产物用甲醇进行萃取，离心(10000rpm，15min，4℃)，上清减压回收溶剂后进行真空冷冻干燥(‑80℃，5pa)，获得干燥产物，该干燥产物中含有稀有人参皂苷。[0047] 实施例3稀有人参皂苷的鉴定[0048] 利用高效液相色谱法(HPLC)检测稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5：分别将人参皂苷Rb1以及上述获得的干燥产物溶于甲醇，经0.22μm微孔滤膜过滤后用于HPLC色谱分析。[0049] HPLC色谱分析方法为：色谱柱Agilentpursuit5SB‑C18色谱柱，进样量20μL，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长203nm。流动相为A：水，B：乙腈，0～40min18～21％(B)；40～42min21～26％(B)；42～46min26～32％(B)；46～66min32～34％(B)；66～71min34～38％(B)；71～77.70min38.0～49.1％(B)；77.70～82min49.1％(B)；82～83min49.1～50.6％(B)；83～88min50.6～59.6％(B)；88～89.80min59.6～65.0％(B)；89.80～97min65％(B)；97～102min65～75％(B)；102～110min75～85％(B)；110～115min85％(B)；115～125min85～18％(B)；125～130min18.0％(B)。[0050] HPLC色谱鉴定结果如图1所示，通过对发酵前后产物中人参皂苷类成分的定性和定量分析可知，人参皂苷Rb1转化产物与稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5标准品的保留时间一致。由此证明，人参皂苷Rb1可经过植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14发酵转化为稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5。并且，如图2所示，在利用植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14发酵转化制备稀有人参皂苷的生物转化合成路线为：人参皂苷Rb1在植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)TRB14水解人参皂苷Rb1C‑20位的葡萄糖后脱水生成稀有人参皂苷20(R)‑Rg3、20(S)‑Rg3、Rk1和Rg5。[0051] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。[0052][0053]

专利地区：吉林

专利申请日期：2023-11-30

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN117625477B