一种从中药复方中富集甘草三萜皂苷类化合物的方法

专利名称：一种从中药复方中富集甘草三萜皂苷类化合物的方法

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202310818040.6

专利申请（专利权）人：徐州医科大学
权利人地址：江苏省徐州市铜山路209号

专利发明（设计）人：季帅,马瑞利,吴卫国,朱翠翠,王紫钰,陈小斐

专利摘要：本发明公开了一种从中药复方中富集甘草三萜皂苷类化合物的方法，是利用聚离子液体修饰的磁性MOF材料与中药复方提取液共孵育，在磁铁作用下收集甘草三萜皂苷类成分，然后用洗脱剂洗脱，再次分离材料，收集洗脱液，挥干，复溶，即得甘草三萜皂苷类成分；最佳富集条件是（材料用量5 mg，吸附时间3 min，样品溶液pH=10，洗脱溶剂70%乙醇‑0.1M HCl，洗脱体积3 mL，洗脱时间3 min）。与富集前的中药复方提液相比，富集液中甘草三萜皂苷类成分的相对含量明显增大，而其他类化合物的相对含量显著减少，该聚离子液体修饰的磁性MOF材料对甘草三萜皂苷类化合物具有良好的吸附特异性，且操作简单。

主权利要求：
1.一种从中药复方中富集甘草三萜皂苷类化合物的方法，其特征在于，是利用聚离子液体修饰的磁性MOF材料为吸附剂，与中药复方提取液共孵育，在磁铁作用下收集聚离子液体修饰的磁性MOF材料，然后用洗脱剂洗脱，再次分离材料，收集洗脱液，挥干，复溶，即得甘草三萜皂苷类成分；
所述的甘草三萜皂苷类结构式如下式所示：
；
所述的聚离子液体修饰的磁性MOF材料为Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl，其中，p[VBAI]Cl为以1‑(4‑乙烯基)苄基‑3‑丁基咪唑为阳离子，氯为阴离子的聚离子液体；
所述的聚离子液体修饰的磁性MOF材料，制备方法如下：
（1）磁性MOF材料的制备：采用溶剂热法制备Fe3O4微粒，并在其表面依次修饰SiO2和UiO‑66‑(SH)2，MOF材料UiO‑66‑(SH)2通过SiO2固定于磁性纳米粒子Fe3O4，得到Fe3O4@UiO‑
66‑(SH)2微粒；
（2）聚离子液体修饰的磁性MOF材料的制备：在步骤（1）所得材料表面修饰以1‑(4‑乙烯基)苄基‑3‑丁基咪唑为阳离子，氯为阴离子的聚离子液体p[VBAI]Cl，合成Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl材料；
所述的中药复方是香砂和胃丸和参苓白术散；以甘草酸为代表，是按2mL上述中药复方提取液加入聚离子液体修饰的磁性MOF材料1 7mg的比例共孵育；吸附时间为0.5 7~ ~min；溶液pH为2 12；洗脱溶剂为以v/v=7/3的比例混合的甲醇‑0.1MHCl、以v/v=7/3的~比例混合的乙腈‑0.1MHCl、以v/v=9/1的比例混合的甲醇‑乙酸、以v/v=7/3的比例混合的
70%乙醇‑0.1MHCl、以v/v=7/3的比例混合的水‑0.1MHCl之任一种；洗脱体积为0.5 6~mL；洗脱时间为0.5 7min。
~
2.根据权利要求1所述的一种从中药复方中富集甘草三萜皂苷类化合物的方法，其特征在于，所述的甘草三萜皂苷类成分以甘草酸为研究目标时，富集优化条件为：选取聚离子液体修饰的磁性MOF材料用量为5mg；吸附时间为3min、样品溶液pH为10、洗脱溶剂为以v/v=7/3的比例混合的70%乙醇‑0.1MHCl、洗脱体积为3mL、洗脱时间为3min进行富集。 说明书 : 一种从中药复方中富集甘草三萜皂苷类化合物的方法技术领域[0001] 本发明属于富集分析技术领域，具体涉及一种聚离子液体修饰的磁性MOF材料的制备，及其用于富集中药复方中的甘草三萜皂苷类成分（甘草酸和甘草皂苷G2）。背景技术[0002] 甘草是最常用的中药之一，除了中国药典，也被日本药典、欧洲药典以及美国药典所收录。甘草药性温和，是中医不可或缺的药材，始载于《神农本草经》，主要用于治疗肝炎、流感、脾胃虚弱和胃溃疡等病症。甘草的化学成分众多，主要为三萜皂苷类、黄酮糖苷类以及异戊烯基黄酮类化合物。其中，三萜皂苷在甘草中含量丰富，被认为是甘草的主要特征成分，该类化合物通常由齐墩果烷型三萜皂苷元与葡萄糖醛酸组成，具有弱酸性和良好的水溶性。代表性化合物主要有甘草酸、甘草皂苷G2等，具有保肝抗炎、抗血栓、抗肿瘤、抗病毒等多种活性。虽然三萜皂苷在甘草中的含量较高，但是在含有甘草的中药复方中，该类成分往往含量较低，其定量分析受其他成分的干扰较大。目前，对甘草三萜皂苷的富集主要通过液‑液萃取的方法，但是该种方法不具有选择性，会同时萃取出三萜皂苷和其他类成分，难以实现三萜皂苷类成分的特异性富集。[0003] 离子液体是一类由有机阳离子，无机或有机阴离子组成的液态有机盐类，具有结构可设计，绿色无污染等优点。聚离子液体（pIL）是离子液体共聚物或其与其他种类单体的共聚物，除了具有离子液体固有的优点外，聚离子液体还具有不易挥发，稳定性强等优点，已广泛用于固相萃取领域。然而，聚离子液体在固相萃取过程中通常与目标化合物接触面积有限，导致萃取效率受到限制。金属有机骨架（MOF）是由有机连接体和无机节点组成的晶体多孔材料，具有孔隙率高、比表面积大、热稳定性好等优点，其中，UiO‑66是一种典型的Zr‑MOF材料，由于其可调的表面性质和足够的稳定性已广泛用于吸附分离领域。另一方面，对于传统的固相萃取过程，通常存在提取时程长，分离步骤复杂等缺点，而磁性固相萃取通过使用磁性吸附剂和外部磁场可以实现分析物与吸附剂的简单快速分离。[0004] 但目前尚无聚离子液体修饰的磁性MOF材料用于富集中药复方中的甘草三萜皂苷类成分的报道。发明内容[0005] 本发明的目的是提供一种从中药复方中富集甘草三萜皂苷类化合物的方法，首先制备一种新的聚离子液体修饰的磁性MOF材料（Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl），并将该材料用于富集中药复方中的甘草三萜皂苷类成分（甘草酸和甘草皂苷G2），该方法特异性好，操作简单。[0006] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现：[0007] 从中药复方中富集甘草三萜皂苷类化合物的方法，是利用聚离子液体修饰的磁性MOF材料与中药复方提取液共孵育，在磁铁作用下收集甘草三萜皂苷类成分，然后用洗脱剂洗脱，再次分离材料，收集洗脱液，挥干，复溶，即得甘草三萜皂苷类成分。[0008] 所述的甘草三萜皂苷类结构式如式1、2所示：[0009][0010] 上述从中药复方中富集甘草三萜皂苷类化合物的方法，以甘草酸为研究目标，富集优化条件为：材料用量为5mg，吸附时间为3min，样品溶液pH为10，洗脱溶剂为70%乙醇‑0.1MHCl，洗脱体积为3mL，洗脱时间为3min。[0011] 以甘草酸为研究目标，富集优化条件为：[0012] 选取聚离子液体修饰的磁性MOF材料用量为1 7mg；~[0013] 吸附时间为0.5 7min；~[0014] 样品溶液pH为2 12；~[0015] 洗脱溶剂为甲醇‑0.1MHCl(v/v，7/3)、乙腈‑0.1MHCl(v/v，7/3)、甲醇‑乙酸(v/v，9/1)、70%乙醇‑0.1MHCl(v/v，7/3)、水‑0.1MHCl(v/v，7/3)之任一种；[0016] 洗脱体积为0.5 6mL；洗脱时间为0.5 7min。~ ~[0017] 详言之，上述以甘草酸为研究目标，富集优化条件为：[0018] 选取聚离子液体修饰的磁性MOF材料用量为5mg；[0019] 吸附时间为3min、样品溶液pH为10、洗脱溶剂为70%乙醇‑0.1MHCl(v/v，7/3)、洗脱体积为3mL、洗脱时间为3min进行富集。[0020] 所述的聚离子液体修饰的磁性MOF材料为Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl，其中，p[VBAI]Cl为以1‑(4‑乙烯基)苄基‑3‑丁基咪唑为阳离子，氯为阴离子的聚离子液体。[0021] 所述的聚离子液体修饰的磁性MOF材料制备方法如下：[0022] （1）磁性MOF材料的制备[IntegrationofFe3O4@UiO‑66‑NH2@MONcore‑shellstructuredadsorbentsforspecific preconcentrationandsensitivedeterminationofaflatoxinsagainstcomplexsamplematrix；JournalofHazardousMaterials,2020，384,121348]：采用溶剂热法制备Fe3O4微粒，并其表面依次修饰SiO2和UiO‑66‑(SH)2，MOF材料UiO‑66‑(SH)2通过SiO2固定于磁性纳米粒子Fe3O4，得到Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2微粒；[0023] （2）聚离子液体修饰的磁性MOF材料的制备：在步骤（1）所得材料表面修饰以1‑(4‑乙烯基)苄基‑3‑丁基咪唑为阳离子，氯为阴离子的聚离子液体p[VBAI]Cl，合成Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl材料。[0024] 使用上述聚离子液体修饰的磁性MOF材料与中药复方提取液共孵育后，在磁铁作用下收集聚离子液体修饰的磁性MOF材料，加入洗脱液超声洗脱，再次分离材料，收集洗脱液，挥干，复溶，即得甘草三萜皂苷类成分。[0025] 有益效果：本发明制备聚离子液体修饰的磁性MOF材料及富集甘草三萜皂苷类成分的具体方法如下：[0026] 1、采用溶剂热法制备Fe3O4微粒，在其表面依次修饰SiO2和UiO‑66‑(SH)2，并进一步修饰p[VBAI]Cl，合成Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl材料。并通过SEM、TEM、EDS、FT‑IR、XRD、BET、VSM等方法对材料进行表征。[0027] 2、以Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl为吸附剂，结合HPLC检测，采用单因素分析实验分别考察不同材料用量、吸附时间、样品溶液pH、洗脱溶剂种类、洗脱体积、洗脱时间对目标化合物富集效率的影响，最终确定为吸附剂材料用量5mg；吸附时间3min；样品溶液pH=10；洗脱溶剂70%乙醇‑0.1MHCl（v/v，7/3）；洗脱体积3mL；洗脱时间3min。[0028] 3、采用最优条件富集中药复方（香砂和胃丸和参苓白术散）中的两种甘草三萜皂苷类成分（甘草酸和甘草皂苷G2），具有良好的富集效果。附图说明[0029] 图1为聚离子液体修饰的磁性MOF材料（Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl材料）的合成路线图。[0030] 图2为聚离子液体修饰的磁性MOF材料的扫描电镜和透射电镜图。[0031] 图3为聚离子液体修饰的磁性MOF材料的元素分析图。[0032] 图4为聚离子液体修饰的磁性MOF材料的红外光谱图。[0033] 图5为聚离子液体修饰的磁性MOF材料的X射线衍射图谱。[0034] 图6为聚离子液体修饰的磁性MOF材料的N2吸附‑脱附等温线。[0035] 图7为聚离子液体修饰的磁性MOF材料的磁滞回线图。[0036] 图8为不同材料用量对甘草酸吸附效率的影响。[0037] 图9为不同吸附时间对甘草酸吸附效率的影响。[0038] 图10为不同样品溶液pH对甘草酸吸附效率的影响。[0039] 图11为不同洗脱溶剂对甘草酸洗脱效率的影响。[0040] 图12为不同洗脱体积对甘草酸洗脱效率的影响。[0041] 图13为不同洗脱时间对甘草酸洗脱效率的影响。[0042] 图14为聚离子液体修饰的磁性MOF材料从中药复方（香砂和胃丸和参苓白术散）中富集甘草三萜皂苷类成分的HPLC色谱图。[0043] 图15是聚离子液体修饰的磁性MOF材料与其他材料对甘草酸的吸附效果比较图；a是聚离子液体修饰的磁性MOF材料，b是聚离子液体修饰的磁性材料，不含MOF，c是磁性MOF材料，不含聚离子液体。具体实施方式[0044] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0045] 一、一种聚离子液体修饰的磁性MOF材料的制备方法，具体包括如下步骤：[0046] （1）磁性MOF材料的制备[0047] 将FeCl3·6H2O和无水乙酸钠分散于乙二醇中，在200℃下反应8h，得到磁性Fe3O4微粒。将磁性Fe3O4微粒、氨水、正硅酸乙酯分散于乙醇中，机械搅拌12h，得到SiO2包覆的Fe3O4微粒。将SiO2包覆的Fe3O4微粒、四氯化锆、对巯基对苯二甲酸分散于N,N‑二甲基甲酰胺中，在120℃下反应20h，得到Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2微粒。[参考文献：IntegrationofFe3O4@UiO‑66‑NH2@MONcore‑shell structuredadsorbentsforspecificpreconcentrationandsensitivedeterminationofaflatoxinsagainstcomplexsamplematrix；《JournalofHazardousMaterials》,2020，384,121348]：[0048] （2）聚离子液体修饰的磁性MOF材料的制备：将步骤（1）得到的Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2微粒、1,2‑二氯乙烷、碳酸钾、碘化钠分散于N,N‑二甲基甲酰胺中，在75℃下反应12h，得到Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2‑Cl微粒。将Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2‑Cl微粒与N‑(4‑乙烯基)苄基咪唑、1‑氯丁烷、二乙烯苯、聚乙烯吡咯烷酮、偶氮二异丁腈分散于甲苯中，在60℃下机械搅拌12h，得到聚离子液体修饰的磁性MOF材料（Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl材料），工艺流程见图1。[0049] （3）采用SEM和TEM对材料的形貌和结构进行表征，如图2所示，所得聚离子液体修饰的磁性MOF材料为不规则的球形，粒径为500nm左右，表面粗糙，具有层层包裹的结构。通过EDS对材料进行元素分析，如图3所示，所得聚离子液体修饰的磁性MOF材料中包含Fe，Si，‑1O，C，Zr，S，N，Cl等元素。在400‑4000cm 范围内，记录材料的红外吸收光谱，如图4所示，所得聚离子液体修饰的磁性MOF材料中同时存在Fe3O4、SiO2、UiO‑66‑(SH)2和p[VBAI]Cl的吸收峰。利用XRD对材料的晶体结构进行分析，如图5所示，材料的衍射峰中同时包含UiO‑66‑(SH)2和Fe3O4（SiO2修饰）的特征峰，且峰形和出峰位置与UiO‑66‑(SH)2和Fe3O4（SiO2修饰）分别吻合，p[VBAI]Cl的修饰并未改变Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2的晶体结构。通过BET法对材料的孔隙结构参数进行了研究，如图6所示，相比于Fe3O4（SiO2修饰），涂覆UiO‑66‑(SH)2后，所得聚离子液体修饰的磁性MOF材料的比表面积和孔隙体积明显增大。利用VSM考察材料的磁性能，如图7所示，修饰UiO‑66‑(SH)2和p[VBAI]Cl后，材料依然具有较强的磁强度，可以在外加磁场的作用下实现快速分离。[0050] 二、一种利用Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl材料富集甘草三萜皂苷类化合物（以甘草酸为代表），具体包括如下步骤：[0051] 精密称取5mg实施例1所得Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl材料，加入3mL甲醇活化，弃去活化后的废液，加入2mLpH为10的0.01mg/mL甘草酸标准品溶液，涡旋3min后采用磁铁分离材料，加入1mL70%乙醇‑0.1MHCl（v/v，7/3）洗脱液，超声3min，再次在磁铁作用下分离材料，按此操作洗脱3次后（每次1mL），合并洗脱液，挥干，采用甲醇复溶后用于HPLC分析。[0052] 实验中依次改变材料用量、吸附时间、样品溶液pH、洗脱剂种类、洗脱剂体积、洗脱时间等富集条件，考察它们对富集效率的影响。各实验均平行做三次。[0053] 1、材料用量的选择[0054] 按照上述富集条件，其他实验条件相同，分别考察了不同质量（1，2，3，5，7mg）Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl材料对目标化合物吸附效率的影响。如图8所示，当磁性MOF材料用量从1mg增加到5mg时，甘草酸的吸附效率逐渐增大，而当继续增加材料用量时，甘草酸的吸附效率变化不显著，提示甘草酸样品已被完全吸附。[0055] 2、吸附时间的选择[0056] 按照上述富集条件，其他实验条件相同，分别考察了不同吸附时间（0.5，1，3，5，7min）对目标化合物吸附效率的影响。如图9所示，当吸附时间从0.5min增加到3min时，甘草酸的吸附效率逐渐增大，进一步延长吸附时间后，甘草酸的吸附效率变化不显著，提示吸附过程已经达到了平衡。[0057] 3、样品溶液pH的选择[0058] 按照上述富集条件，其他实验条件相同，分别考察了不同样品溶液pH（2，4，6，8，10，12）对目标化合物吸附效率的影响。如图10所示，当样品溶液pH达到10时，甘草酸的吸附效率最大，而继续增大pH时，甘草酸的吸附效率反而下降。[0059] 4、洗脱溶剂的选择[0060] 按照上述富集条件，其他实验条件相同，分别考察了不同洗脱溶剂（甲醇‑0.1MHCl(v/v，7/3)，乙腈‑0.1MHCl(v/v，7/3)，甲醇‑乙酸(v/v，9/1)，70%乙醇‑0.1MHCl(v/v，7/3)，水‑0.1MHCl(v/v，7/3)）对目标化合物洗脱效率的影响。如图11所示，洗脱溶剂为70%乙醇‑0.1MHCl（v/v，7/3）时，甘草酸的洗脱效率最大。[0061] 5、洗脱溶剂体积的选择[0062] 按照上述富集条件，其他实验条件相同，分别考察了不同洗脱溶剂体积（0.5，1，2，3，4，6mL）对目标化合物洗脱效率的影响。如图12所示，当洗脱体积从0.5mL增加到3mL时，甘草酸的洗脱效率逐渐增大，继续增加洗脱剂用量对洗脱效率没有显著影响，提示甘草酸已经被洗脱完全。[0063] 6、洗脱时间的选择[0064] 按照上述富集条件，其他实验条件相同，分别考察了不同洗脱时间（0.5，1，3，5，7min）对目标化合物洗脱效率的影响。如图13所示，当洗脱时间达到3min时，甘草酸的洗脱效率到达最大，继续延长洗脱时间，甘草酸的洗脱效率反而下降。[0065] 综合上述试验内容，以甘草酸为研究目标，富集优化条件为：选取聚离子液体修饰的磁性MOF材料用量为1 7mg；吸附时间为0.5 7min；样品溶液pH为2 12；洗脱溶剂~ ~ ~为甲醇‑0.1MHCl(v/v，7/3)、乙腈‑0.1MHCl(v/v，7/3)、甲醇‑乙酸(v/v，9/1)、70%乙醇‑0.1MHCl(v/v，7/3)、水‑0.1MHCl(v/v，7/3)之任一种；洗脱体积为0.5 6mL；洗~脱时间为0.5 7min。~[0066] 详言之，上述以甘草酸为研究目标，富集优化条件为：选取聚离子液体修饰的磁性MOF材料用量为5mg；吸附时间为3min、样品溶液pH为10、洗脱溶剂为70%乙醇‑0.1MHCl(v/v，7/3)、洗脱体积为3mL、洗脱时间为3min进行富集。[0067] 实施例1[0068] 采用Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl材料富集香砂和胃丸和参苓白术散中甘草三萜皂苷类化合物（甘草酸和甘草皂苷G2）的方法：[0069] 将香砂和胃丸和参苓白术散经粉碎机打碎后，称取粉末，按照固液比30mL/g加入甲醇超声处理，经0.22μm滤膜过滤去除药渣，获得提取液。精密称取5mgFe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl材料，加入3mL甲醇活化，弃去活化后的废液，加入2mL上述提取液，涡旋3min后采用磁铁分离材料，加入1mL70%乙醇‑0.1MHCl（v/v，7/3）洗脱液，超声3min，再次在磁铁作用下分离材料，按此操作洗脱3次后（每次1mL），合并洗脱液，挥干。挥干后的洗脱液经甲醇复溶后，通过HPLC分析可知（图14），经材料富集后，甘草三萜皂苷类成分的峰面积明显增大，是洗脱液的主要成分，而其他成分的峰面积显著变小。[0070] 对照例1[0071] 将中药复方（香砂和胃丸和参苓白术散）经粉碎机打碎后，称取粉末，按照与实施例1中相同的固液比加入甲醇超声处理，经0.22μm滤膜过滤去除药渣，获得提取液。提取液通过HPLC分析可知（图14），其中的甘草三萜皂苷类成分含量较低，而其他类成分含量较高。[0072] 对照例2[0073] 参照实施例1的样品处理方法，比较不同材料对甘草酸的吸附效果；结果见图15所示，其中，a是聚离子液体修饰的磁性MOF材料，b是聚离子液体修饰的磁性材料，不含MOF，c是磁性MOF材料，不含聚离子液体。可见，相较于其他材料，聚离子液体修饰的磁性MOF材料吸附效率提升很多。[0074] 结论：本发明首次制备了聚离子液体修饰的磁性MOF材料Fe3O4@UiO‑66‑(SH)2@p[VBAI]Cl，并首次将其用于富集中药复方中的甘草三萜皂苷类成分，富集液中其他类型成分的含量较低。同时，该方法操作简单。

专利地区：江苏

专利申请日期：2023-07-05

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN116925172B