番茄干旱响应基因FMO1及其编码蛋白与应用

专利名称：番茄干旱响应基因FMO1及其编码蛋白与应用

专利类型：发明专利

专利申请号：CN202211094765.7

专利申请（专利权）人：西南大学,湖北家得乐农业开发有限公司
权利人地址：重庆市北碚区天生路2号

专利发明（设计）人：李金华,习鹏,王璐璐,周银莲,丁寅

专利摘要：本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及番茄干旱响应基因FMO1及其编码蛋白与应用。该基因的cDNA序列全长如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.3所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.4所示。本发明从番茄cDNA中克隆得到全长的FMO1，分别构建超量表达(OE)载体和RNAi抑制表达(Ri)载体，通过农杆菌介导的遗传转化的方法将其成功转入干旱敏感番茄M82(Solanum lycopersicum cv.M82)中。通过对转基因植株进行表型鉴定和生理生化分析，发现抑制表达FMO1可以显著提高番茄的耐旱能力，超量表达使其更加敏感。

主权利要求：
1.潘那利番茄FMO1蛋白在提高番茄干旱胁迫敏感性中的应用，其特征在于，将编码所述蛋白的基因转入番茄基因组中，并在转基因番茄中超量表达，提高番茄对干旱胁迫的敏感性，其中，所述潘那利番茄FMO1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述蛋白的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
3.番茄FMO1基因在提高番茄抗旱能力中的应用，其特征在于，将抑制所述基因表达的核酸构建到抑制表达载体中，转入番茄基因组中，并使转基因番茄中内源的FMO1基因沉默表达，提高番茄抗旱能力，其中，所述番茄FMO1基因的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。 说明书 : 番茄干旱响应基因FMO1及其编码蛋白与应用技术领域[0001] 本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及番茄干旱响应基因FMO1及其编码蛋白与应用。背景技术[0002] 不同的技术，如标记辅助育种、数量性状位点定位和从野生基因库中导入，正被用于提高抗旱性(Guptaetal.2017)。尽管在提高植物抗旱性方面，常规育种被认为是重要的，但是随着对植物抗旱机理的逐渐了解，研究人员已经认识到基因工程在提高植物抗旱性中的重要性。在转基因文献中有一个普遍的现象，即自然选择并没有给予植物足够的抗旱性，而转基因是实现理想变化的唯一办法，因为尽管科学，但选育仍无法在任何合理的时间范围内做到这一点(Reddyetal.2002)，提高植物抗旱性的基因改造是非常可取的，通过基因转化可以插入各种感兴趣的基因(李金华etal.2017)。与传统育种相比，转基因技术似乎是一种更有吸引力的方法，它允许直接诱导单个或一组所需基因(Gosaletal.2009)。[0003] 通过基因工程改造，在植物中有很多成功的例子。向日葵属的同源结构域‑亮氨酸拉链家族(HD‑ZipI)的突变转录因子(HaHB4)转基因小麦，提高了水分利用效率和产量(Yangetal.2009)。在泛素启动子的作用下，从大豆中携带GmDREB1基因的转基因小麦表现出耐旱性(Fredericketal.2001b)。通过基因工程可以通过两种方式提高水的利用效率，这样植物就可以在水分胁迫下生长良好。一种方法是插入糖和氨基酸等兼容渗透调节物质的基因(Cattivellietal.2008b)。另一种策略是结构性过表达提供脱水耐性的晚期胚性丰富蛋白(LateEmbryogenesisAbundantproteins,LEA蛋白)，LEA蛋白是一类非生物胁迫相关蛋白，广泛存在于植物的细胞质和细胞核中，对多种非生物胁迫信号作出反应。它们能在非生物胁迫诱导的植物细胞中大量积累，并进行渗透调节，防止植物因水分过度流失而死亡(于正阳2020)。[0004] 在番茄中，通过基因工程的方法提高抗旱性已经有很多成功的例子(李金华etal.2017)。如Li等研究发现，SlDREB通过下调赤霉素生物合成所需的关键基因的表达来限制叶片扩张和节间伸长，从而在干旱胁迫响应中起正向调控作用(Lietal.2012)。Orellana等研究发现在胁迫试验中，大规模基因表达分析表明，与野生型和SlAREB1下调的转基因植物相比，SlAREB1的过度表达也上调了一些基因基因编码的与生物应激反应相关的防御蛋白(Orellana2010)。Gao等研究发现SlWRKY8的过表达在植物抵抗病原体感染的免疫力以及植物对干旱和盐胁迫的反应中起着积极的调节作用(Yong‑Fengetal.2019)。[0005] 单加氧酶基因(Monooxygenase)是利用一些有机辅因子将电子传递链给O2从而实现O2的激活，在底物引入单个氧原子的催化酶。目前研究最为广泛的即为细胞色素P450单加氧酶(CytochromeP450enzymes)家族，P450单加氧酶可以催化多种氧化反应，在真核、原核细胞中均有存在(李仁结etal.2019)，被称为“生物界万能的催化剂”。依赖于蛋白进化的高通量筛选策略可提高P450的催化性能(李敏奇etal.2020)。有研究表明，AA9家族裂解多糖单加氧酶(Lyticpolysaccharidemonooxygenases,LpMO)通过氧化裂解破坏纤维素的结晶结构，可提高其酶水解效率(吴帅帅etal.2020)。单加氧酶基因表达蛋白能催化苯甲硫醚生成具有一定对映选择性的苯砜，解决了硫醚底物底物不对称氧化的难题(张红燕etal.2015)。裂解性多糖单加氧酶LpMO以不同的反应途径及机制介导白腐菌等木质素的生物降解。文献报道称，ARRO‑1(不定根发生相关加氧酶基因)在不定根诱导时上调表达，推段其与木本植物不定根的形成存在一定相关性，在野生型拟南芥中转进目的基因ARRO‑1后，互补株系地下部分的表型包括主根长度，以及不定根的再生能力均得到了很大程度的恢复。[0006] 基于目前的研究进展，对单加氧酶基因的功能研究还仅限于医学和微生物，在其他作物包括番茄中，目前单加氧酶基因的研究还未见报道。发明内容[0007] 为了解决上述问题，本发明提供了番茄干旱响应基因FMO1及其编码蛋白与应用。[0008] 首先，本发明提供番茄FMO1蛋白，其为：[0009] 1)由SEQIDNo.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或[0010] 2)由SEQIDNo.4所示的氨基酸组成的蛋白质。[0011] 本发明还提供编码所述番茄FMO1蛋白的基因。[0012] 优选的，所述基因的序列如SEQIDNo.1或者SEQIDNo.3所示。[0013] 本发明还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。[0014] 本发明还提供所述基因在提高植物干旱胁迫敏感性中的应用。[0015] 在本发明一个具体实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，提高植物对干旱胁迫的敏感性。[0016] 本发明还提供所述基因在提高植物抗旱能力中的应用。[0017] 在本发明一个具体实施方案中，将所述基因构建到抑制表达载体中，转入植物基因组中，并使转基因植物中内源的FMO1基因沉默表达，提高植物抗旱能力。[0018] 本发明克隆得到番茄和野生潘那利番茄(Solanumpennellii)的FMO1的全长序列，全长1293bp，编码430个氨基酸。生物信息学分析表明：FMO1基因与拟南芥中CTF2A和CTF2B基因有很高的同源性，在启动子区域中发现激素与逆境应答相关的顺势作用元件。同时该基因在普通栽培种AC(S.lycopersicumcv.AilsaCraig)各组织中均有表达，在花果中表达最高，说明干旱应答基因FMO1可能在植株生长发育后期具有重要意义。利用Real‑timePCR检测了FMO1在激素ABA以及各种逆境调节因子处理下的表达模式。结果表明，在ABA处理下，FMO1迅速下调表达(1h)，但之后又逐渐恢复到正常水平。在干旱和盐处理后，FMO1也是迅速下调表达(0.25h)，但是在0.5h又上调表达，这些说明FMO1在逆境发生的初期就迅速响应，是一个逆境的负调控因子。[0019] 为了研究FMO1基因的功能，分别构建了该基因的超量表达和RNAi抑制表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法，获得超量和抑制的转基因株系，对其进行表达分析，筛选出显著表达差异的超表达(OE‑8、OE‑10)和RNAi抑制表达(Ri‑1、Ri‑3)转基因株系用于下一步的基因功能分析。以FMO1超量和沉默表达转基因植株为材料进行干旱胁迫处理，进行表型鉴定和生理生化分析阐明FMO1基因在番茄抗旱中的功能。转基因植株干旱处理结果表明，相对野生型对照，FMO1RNAi沉默表达转基因提高了普通栽培番茄的耐旱性，而超量表达FMO1使其更敏感。生理生化研究结果表明，RNAi沉默表达转基因植株在干旱后积累了较多脯氨酸(Pro)，过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性均高于野生型对照，同时相对电导率、丙二醛(MDA)含量均低于野生型和超量表达株系，通过DAB和NBT进行组织染色表明，相对于Ri植株而言，FMO1超量表达株系和野生型植株在进行干旱胁迫处理后有较多的H2O22‑和O 富集。[0020] 目前，虽然有很多正向提高植物抗逆的转录因子报道出来，但是，负向调控植物抗逆性的基因还很少，所以研究这个基因的分子机理有重要的理论意义。同时，CRISPR/Cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR‑associatedprotein)系统，只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，操作简单。例如，利用此系统将番茄的SlMAPK3进行定点敲除，番茄表现对干旱的高度敏感(Wangetal.,2017)。因此，作为负向调控抗旱的基因FMO1，不但可以用此基因来作为后期分子标记辅助选择抗旱育种的参考，还可以直接利用CRISPR/Cas9对其进行定向修饰、并且能够获得不含转基因痕迹的后代，直接运用于生产实践。附图说明[0021] 图1所示是FMO1蛋白氨基酸序列比对。[0022] 图2所示是FMO1进化树分析。[0023] 图3所示是FMO1基因启动子区域顺式作用元件分析。[0024] 图4所示是FMO1基因组织表达模式分析(R：根；S：茎；L：叶；FL：花；FR：果)。[0025] 图5所示是FMO1在ABA处理下的表达谱(时间：h)。[0026] 图6所示是FMO1在各种逆境处理下的表达谱(时间：h)。[0027] 图7所示是FMO1番茄遗传转化示意图。A：预培养；B：愈伤组织分化出抗性苗；C：抗性苗生根；D：阳性苗的移栽入钵。[0028] 图8所示是FMO1部分转基因番茄阳性植株的PCR鉴定。M：DL2000Marker；N：野生型番茄；阳：以确定为转基因植株的样为模板的阳性对照；阴：以水为模板的阴性对照。[0029] 图9所示是FMO1转基因番茄表达量分析。超量和沉默株系分别进行鉴定。WT：野生型番茄；OE‑8、OE‑10：超表达FMO1的转基因株系；Ri‑1、Ri‑3：FMO1RNAi沉默转基因株系。[0030] 图10所示是FMO1转基因番茄和野生型番茄干旱处理后的表型图分析。WT：野生型番茄M82；OE‑8、OE‑10：超表达FMO1的转基因株系；Ri‑3、Ri‑1：FMO1RNAi沉默株系。[0031] 图11所示是FMO1转基因株系和野生型WT番茄在MS培养基上模拟干旱处理的表型差异。注：每个株系三个生物学重复。WT：M82野生型；OE‑8：超表达FMO1转基因株系；Ri‑1：FMO1RNAi沉默转基因株系。Control：未进行干旱处理的对照组；Drought：甘露醇处理组。[0032] 图12所示是FMO1转基因番茄和野生型植株在甘露醇和盐胁迫处理下的根长和苗高。[0033] 图13所示是正常生长和干旱胁迫下野生型和FMO1转基因植株丙二醛含量的变化。注：Control：正常浇水生长的对照组；Drought：干旱脱水处理。M82：野生型番茄；OE‑8、OE‑10：超表达FMO1的转基因株系；Ri‑1、Ri‑3：FMO1RNAi沉默株系。显著性分析采用t检验法，与野生型(WT)差异显著(P＜0.05)的标记为“*”。[0034] 图14所示是正常生长和干旱胁迫下野生型和FMO1转基因植株脯氨酸含量的变化。注：Control：正常浇水生长的对照组；Drought：干旱脱水处理。WT：野生型番茄；OE‑8、OE‑10：超表达FMO1的转基因株系；Ri‑1、Ri‑3：FMO1RNAi沉默株系。显著性分析采用t检验法，与野生型(WT)差异显著(P＜0.05)的标记为“*”。[0035] 图15所示是正常生长和干旱胁迫下野生型和FMO1转基因植株相对电导率含量的变化。注：Control：正常浇水生长的对照组；Drought：干旱脱水处理。WT：野生型番茄M82；OE‑8、OE‑10：超表达FMO1的转基因株系；Ri‑1、Ri‑3：FMO1RNAi沉默株系。显著性分析采用t检验法，与野生型(WT)差异显著(P＜0.05)的标记为“*”。[0036] 图16所示是正常生长和干旱胁迫下野生型和FMO1转基因植株CAT、POD含量变化。注：Control：正常浇水生长的对照组；Drought：干旱脱水处理。WT：野生型番茄；OE‑8、OE‑10：超表达FMO1的转基因株系；Ri‑1、Ri‑3：FMO1RNAi沉默株系。显著性分析采用t检验法，与野生型(WT)差异显著(P＜0.05)的标记为“*”。[0037] 图17所示是干旱胁迫下野生型和FMO1转基因植株组织染色。WT：野生型番茄M82；OE‑8、OE‑10：超表达FMO1的转基因株系；Ri‑1、Ri‑3：FMO1RNAi沉默株系。具体实施方式[0038] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。[0039] 本试验以普通栽培品种S.lycopersicumcv.M82为受体材料，进行基因的克隆和遗传转化，利用番茄品种AC(S.lycopersicumcv.AilsaCraig)进行激素处理和表达分析。所有番茄试验材料以及后续试验的转基因株系均种植于西南大学校内网室基地。[0040] 本试验所用的引物均利用Oligo7和Primer3Plus软件进行设计，引物合成(表1)交由北京六合华大基因科技有限公司，终浓度为10pmol/μL，‑20℃保存备用。[0041] 表1引物序列[0042][0043] 实施例1FMO1基因的克隆和生物信息学分析[0044] 通过干旱转录组数据分析筛选得到一个干旱应答基因，根据注释信息，该基因是FAD‑bindingMonooxygenase，将其命名为FMO1。通过PCR扩增分别从野生潘那利番茄和番茄栽培种中克隆得到FMO11293bp的cDNA全长，编码430个氨基酸。[0045] FMO1蛋白与其它物种同源性较高的蛋白利用DNAMAN软件进行序列比对分析结果如图1所示，所有和FMO1高度同源的FMO都来自植物，并且具有很高的相似性。如SlFMO1蛋白序列与SpFMO1(来自Solanumpennellii)和ScFMO1(S.chilense)的相似性分别为99％和97％。并且这些FMO蛋白都具有两个保守的结合域：靠近蛋白质N端的是FAD结合“GxGxxG”基序，靠近蛋白质的中心的FMO识别基序“FxGxxxHxxxY/F”；同时利用MEGA6软件构建番茄与其他物种的FMO基因的进化树，如图2所示，所有茄科FMO都聚集在一起，SlFMO1与其对应的SpFMO1蛋白进化关系最近，而与栓皮栎的QsFMO蛋白距离最远。[0046] 基于番茄基因组序列，对FMO1基因上游‑2000bp启动子区域的顺式作用调控元件进行分析。如下图3所示，在FMO1基因启动子区域中发现激素与逆境应答相关的顺势作用元件：包括赤霉素反应元件(P‑box)、脱落酸反应元件(ABRE)、水杨酸反应元件(TCA‑element)以及参与光反应的顺式作用元件(G‑box)。[0047] 实施例2FMO1基因表达模式分析[0048] 利用Ream‑timePCR技术分析了FMO1在普通栽培番茄品种AC各个组织器官的表达情况，如下图4所示(以根的表达量归1)，FMO1基因在我们选择的所有的组织中均有一定表达量，其中在花中的表达量最高，在果实中的表达量次之。有研究发现，干旱胁迫一定程度提高了柠檬秋花春熟果花芽分化率(范玉花2017)。因此，干旱应答基因FMO1可能在植物生长发育后期参与保花保果的过程中具有很重要的功能。[0049] 采用实时定量Ream‑timePCR检测了外源植物激素ABA的处理(如图5所示)对FMO1基因表达水平的影响。由于FMO1受到光周期诱导表达，在我们取样的每个时间点的表达是变化的，因此我们利用每个时间点的处理之后比上处理之前来计算基因的相对表达量。结果显示：在ABA处理下，FMO1基因先是在1h处迅速出现下调表达，随后在6‑12h上调表达。激素处理结果表明FMO1基因可能在植物激素响应和信号转导中起着重要作用，是一个在胁迫前期迅速响应的负调控因子。[0050] 为了了解FMO1基因是否会参与非生物胁迫的应答，我们同样采用qRT‑PCR的方法检测了不同逆境胁迫处理下FMO1基因的表达情况(如图6所示)。对经干旱处理AC不同部位(根、茎、叶)对FMO1基因表达量影响。结果表明在干旱处理下，番茄的茎出现基因下调表达，后期上调表达，但是在根和叶中的表达相反，这说明该基因在干旱处理下，在不同的组织部位的表达模式是不一样的。[0051] 在番茄叶片中，我们利用MV(甲基紫精：产生氧化胁迫)、NaCl和PEG进行逆境处理的表达分析。由于该基因受到光周期诱导表达(图5)，因此我们利用同一个时间点处理之后比上未处理的得到相对表达量。结果如图6所示，在MV1h，Nacl0.25h和PEG0.25h，FMO1均迅速下调表达。这些结果说明FMO1基因不仅对干旱胁迫有响应，还可能受到多种逆境胁迫因子如MV和Nacl的诱导表达，并在胁迫初期迅速响应并下调表达，说明FMO1基因在逆境响应的初期是一个负调控因子。[0052] 实施例3FMO1基因载体构建和转基因番茄的获取[0053] FMO1超量表达载体pMV‑FMO1(pMV由pBI121改造而来)及RNAi表达载体pHGRV‑FMO1(pHGRV由Hellsgate2改造而来)，表达载体构建方法参见(Li,J.,Wang,Y.,Wei,J.,Pan,Y.,Su,C.andZhang,X.(2018)Atomatoproline‑,lysine‑,andglutamic‑richtypegeneSpPKE1positivelyregulatesdroughtstresstolerance.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,499,777‑782.)。成功构建潘那利番茄FMO1超表达载体以及番茄FMO1的RNAi表达载体。[0054] 农杆菌介导转化番茄的方法如下：[0055] (1)种子消毒：挑选颗粒饱满、无杂质的番茄种子至组培瓶，在超净工作台下用75％酒精消毒30s‑1min，用无菌水冲洗2‑3次。重新换到干净的瓶子里再加入一定量的20％次氯酸钠消毒20‑25min，无菌水冲洗9‑10次，封口在220rpm，25℃震荡培养2‑3d；待种子露白后在超干净工作台上将其转移至事先倒好的MS培养基上，在适宜的生长条件下培养直至长出两片子叶。[0056] (2)切苗：[0057] ①于切苗液中剪下两片子叶(两篇子叶角度在45°‑180°之间)，减掉子叶两端，留取子叶中间部分(距离生长点远些)，[0058] ②随后将子叶正面朝上放于预培养基上，避光培养24‑36h。[0059] (3)摇菌：[0060] 将已经进行菌斑检测且条带正确的含有超表达载体和RNAi沉默表达载体的菌斑分别接种于3‑5mLYEB液体培养基(+500μg/mLCb+500μg/mLRif+50μg/mLKan)中，28℃培养2d。[0061] (1)活化：[0062] 将上述培养物的加入到30‑50ml液体培养基(YEB+500μg/mLCb+500μg/mLRif+50μg/mLKan)中，28℃振荡培养8‑12h，使OD600值在1.0左右。[0063] (2)侵染：[0064] ①将(4)中菌液平分至50mL已灭菌的大离心管中，4℃，4000rpm离心10min；②弃上清液，用不加抗生素的YEB液体培养基重悬菌体，4℃，4000rpm离心10min；[0065] ③倒掉上清液，用重悬液重悬菌体。[0066] ④将避光保存放至在预培养基中的叶片转移至无菌的空皿中，将③中重悬液倒入空皿中侵染10‑15min；[0067] ⑤共培养：将侵染好的子叶转移至含有无菌滤纸的培养皿中吸干水分(不可时间太久)，晾干后重新转移至原来的预培养基上，暗培养2d左右转到筛选培养基上，28℃培养，随后以每3周一次的频率更换筛选培养基。[0068] (6)生根：将愈伤上分化出的幼苗剪下插入生根培养基中进行生根筛选。[0069] (7)移栽：将生根的幼苗从培养基中取出，用清水小心清洗根部培养基，然后先移栽到全蛭石的营养钵中生长一周左右(注意覆膜保湿)，再转移到含有基质：蛭石：珍珠岩＝3：1：1的营养钵中生长，待条件合适，转移至西南大学网室室外繁种(图7)。[0070] 利用CTAB法提取已获得的卡那霉素(Kan)抗性番茄植株的基因组DNA，以未经转化的植株为对照，利用NPTⅡ基因引物对已提取的超量表达基因的转基因植株DNA进行PCR扩增，PCR产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果显示得到PCR扩增出720bp左右的目标条带(详见图8)，表明pMV‑FMO1和pHGRV‑FMO1载体上的基因已成功转入到番茄基因组中。[0071] 通过T1遗传和表达分析，我们从转基因植株中筛选差异显著的转基因植株进行进一步的功能分析。在T2代再次确定转基因株系的相对表达量：首先分别提取各个转基因株系提取了RNA，反转录为cDNA后进行了qRT‑PCR表达分析。如图9所示为FMO1转基因株系的定量结果：OE‑8、OE‑10均为超表达株系，表达量相对野生型对照WT而言，分别提高了30倍和6倍；同样，在RNAi抑制株系中Ri‑3、Ri‑1的表达量分别为WT的0.31倍和0.02倍，为FMO1RNAi沉默株系。[0072] 实施例4FMO1基因转基因株系在干旱胁迫中的功能分析[0073] 如图10所示，在干旱处理前，野生型和转基因株系均长势良好且处于四叶一心生长期。干旱处理5d后，野生型植株叶片和FMO1超量表达株系已开始出现萎蔫，FMO1RNAi沉默株系生长良好。在干旱至12d时，野生型植株和FMO1超量表达株系叶片出现严重萎蔫，甚至开始干枯，而FMO1RNAi沉默株系叶片部分开始萎蔫。随后对所有植株进行复水处理，复水第3d后，野生型植株和FMO1超量表达株系叶片仍处于萎蔫干枯状态，而FMO1RNAi沉默株系叶片恢复生长。实验结果表明：与野生型WT相比，抑制FMO1基因的表达能提高番茄的抗旱性。[0074] 如图11‑12所示，可以看出，野生型和FMO1超量表达株系的长势和根系长度要低于转FMO1基因RNAi沉默株系。这进一步说明，抑制FMO1基因的表达能提高番茄的抗旱性。[0075] 为了进一步了解FMO1转基因植株在干旱胁迫时的生理生化差异，本实验测定了干旱胁迫后FMO1转基因番茄和野生型番茄植株的的丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(Pro)含量、相对电导率、抗氧化相关酶CAT、POD的活性以及对植物成熟叶片进行了组织化学染色。[0076] 实验结果显示，在正常生长条件下，FMO1转基因植株和野生型WT植株MDA含量没有明显的差异，但在经过干旱处理后，野生型WT和超量表达株系番茄的MDA含量要高于FMO1RNAi沉默株系的MDA含量，表明野生型WT番茄和超量表达株系在经过干旱处理后细胞膜脂质过氧化程度更高，其对干旱的适应能力低于FMO1RNAi沉默转基因株系(图13)。即在干旱胁迫下抑制FMO1基因的表达，能够减缓转基因番茄中的丙二醛含量的提高，进而提高了FMO1RNAi抑制株系的耐旱性。[0077] 将野生型M82和FMO1超表达株系和FMO1RNAi抑制株系进行正常浇水和干旱处理，选表型明显的植株测定脯氨酸含量。结果发现，在正常浇水情况下，野生型WT和FMO1转基因株系的脯氨酸含量没有显著差异(图14)。当进行干旱处理后，所有株系的Pro含量都升高了，相比于野生型WT，Ri‑1和Ri‑3中Pro含量最高，达到了显著水平。结果表明，在干旱胁迫下抑制FMO1基因的表达，能够提高转基因番茄中的脯氨酸含量，提高FMO1RNAi抑制株系的耐旱性。[0078] 对正常浇水和干旱处理后的转基因植株和野生型对照植株进行叶片相对电导率测定。结果如图15所示，进行干旱处理组的各株系的相对电导率值均高于正常浇水对照组的相对电导率值，说明干旱胁迫使叶片相对电导率增加，但野生型和FMO1超量表达转基因株系的相对电导率增加高于FMO1RNAi沉默株系。实验结果表明，干旱胁迫后，野生型WT和FMO1超量表达转基因株系番茄叶片的细胞膜遭受伤害的程度高于FMO1RNAi沉默株系。[0079] 如图16所示，在正常生长条件下，FMO1转基因番茄植株和野生型番茄植株CAT和POD活性没有明显的差异，但是在干旱处理后，所有株系的CAT和POD活性都升高了，FMO1RNAi沉默株系的CAT和POD活性要高于野生型对照和FMO1超量表达株系。本实验表明，在干旱胁迫下抑制FMO1基因的表达，能够提高转基因番茄中的CAT和POD的活性，提高了FMO1RNAi抑制株系的耐旱性。[0080] DAB和NBT是定位过氧化物酶重要的显色底物，能被催化分别生成棕黄色和蓝色产物，能直观地观察到植物组织中过氧化物的积累情况进而反应植物脂质过氧化的程度。选取干旱处理下表型明显的野生型WT和FMO1转基因株系进行DAB和NBT组织化学染色结果分别如图17所示，FMO1RNAi沉默株系的棕黄色和蓝色相较野生型和FMO1超量表达转基因株系的染色要浅，说明FMO1RNAi沉默株系积累较少的过氧化氢，膜脂过氧化程度较轻，结果表明干旱胁迫后，野生型WT和FMO1超量表达转基因株系番茄叶片的膜脂过氧化程度高于FMO1RNAi沉默株系。因此，在干旱胁迫下抑制FMO1基因的表达，可以提高相关抗氧化酶的活性，清除过氧化氢等一些ROS，从而可提高番茄的耐旱性。[0081] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

专利地区：重庆

专利申请日期：2022-09-08

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN116162604B