一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂及试剂盒

专利名称：一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂及试剂盒

专利类型：实用新型专利

专利申请号：CN202211700726.7

专利申请（专利权）人：武汉艾米森生命科技有限公司
权利人地址：湖北省武汉市武汉东湖新技术开发区高新大道818号武汉高科医疗器械园B地块一期B10栋1层04号

专利发明（设计）人：蔡迪,张良禄,董兰兰,陈艾敏,廖旦旦

专利摘要：本申请涉及一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂及试剂盒。该试剂包括检测目标区域的甲基化水平的试剂，所述目标区域包括Chr1:3746525‑3747320、Chr1:16226730‑16227150、Chr1:16227533‑16228079、Chr1:63319620‑63320656和Chr1:90726838‑90727252中至少一个区域的全长或部分区域。本申请通过检测所述目标区域的甲基化水平可以对膀胱癌进行诊断或辅助诊断，具有非侵入性的、便捷的、高灵敏度的特性，有望提高我国膀胱癌的检出率，降低该疾病的发病率与死亡率。

主权利要求：
1.一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂，其特征在于，所述试剂包括核苷酸序列如SEQIDNO.34 35和SEQIDNO.67 68所示的引物对，以及核苷酸序列如SEQIDNO.36和~ ~SEQIDNO.69所示的探针。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂通过甲基化特异性荧光定量PCR进行甲基化检测。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括亚硫酸氢盐。
4.一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1‑3任一项所述的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本包括组织和/或尿液。
6.权利要求1‑3任一项所述试剂在制备膀胱癌诊断或辅助诊断产品中的应用。 说明书 : 一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂及试剂盒技术领域[0001] 本申请涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂及试剂盒。背景技术[0002] 膀胱癌是全球第十大常见癌症，好发于男性，其在男性群体中的发病率和死亡率在癌症排名中分别居于第6位和第9位。在确诊膀胱癌时，大约75％的患者被诊断为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)，约25％的患者被诊断为肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。对于NMIBC和MIBC，其治疗方式和临床结果具有显著的差别。NMIBC通常未侵袭膀胱肌层，预后相对较好，可经尿道电切术治疗，但是其易复发，且存在发展为MIBC的可能性。MIBC通常已侵袭膀胱肌层，患者需要行根治性膀胱切除术进行治疗，且需要根据肿瘤的病理特征执行相应的化疗方案，对于已经发生转移的晚期膀胱癌患者，其存活率低于5％。因此，对膀胱癌患者进行早期诊断和早期治疗，是提高其生活质量和生命周期关键途径。[0003] 目前临床上常用的诊断膀胱癌的方法包括：膀胱镜、尿液脱落细胞学、荧光原位杂交(FISH)等。膀胱镜及病理活检是诊断膀胱癌的金标准，但是其作为侵入性检查，患者需要进行麻醉，且存在尿道穿孔、尿道感染等风险，导致患者的痛苦度高、接受度低。尿液脱落细胞学检查和荧光原位杂交法为非侵入性操作，其诊断膀胱癌的特异性较好，但是这两种方法对于早期非肌层浸润性癌的诊断灵敏度较低，且其诊断的准确性依赖于医师的诊断经验。因而，目前急需非侵入性的、便捷的、高灵敏度的诊断膀胱癌的方法。[0004] 膀胱癌的一个常见特征即癌细胞表观遗传机制的改变。表观遗传学是指在基因的DNA序列未发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，最终导致了表型的变化。DNA甲基化、组蛋白变异、染色质重塑和组蛋白翻译后修饰等是影响基因表达的主要表观遗传机制。总体看来，在癌细胞的基因组中，其DNA的甲基化程度降低，有助于原癌基因的过度表达、突变率的增加等；与此同时，其抑癌基因启动子区域的DNA则会高度甲基化，从而抑制抑癌基因的表达，有利于肿瘤侵袭、转移和血管生成。因此，异常的DNA甲基化可能作为膀胱癌诊断、预后和治疗的分子标记物。发明内容[0005] 基于此，为解决目前尚无高灵敏度且无创的诊断或辅助诊断膀胱癌的方法，有必要提供一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂及试剂盒。[0006] 具体技术方案如下：[0007] 一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂，所述试剂包括检测目标区域的甲基化水平的试剂，所述目标区域包括如下至少一个区域的全长或部分区域：区域1、区域2、区域3、区域4和区域5；[0008] 其中，以GRCh38.p14为参考基因组，所述区域1为Chr1:3746525‑3747320，所述区域2为Chr1:16226730‑16227150，所述区域3为Chr1:16227533‑16228079，所述区域4为Chr1:63319620‑63320656，所述区域5为Chr1:90726838‑90727252。[0009] 在其中一个实施例中，所述区域1的部分区域包括区域1‑1、区域1‑2、区域1‑3、区域1‑4和区域1‑5中的一个或多个；所述区域1‑1为Chr1:3746525‑3746671，所述区域1‑2为Chr1:3746695‑3746839，所述区域1‑3为Chr1:3746854‑3746987，所述区域1‑4为Chr1:3747021‑3747165，所述区域1‑5为Chr1:3747172‑3747320。[0010] 在其中一个实施例中，所述区域2的部分区域包括区域2‑1、区域2‑2、区域2‑3和区域2‑4中的一个或多个；所述区域2‑1为Chr1:16226730‑16226856，所述区域2‑2为Chr1:16226858‑16226981，所述区域2‑3为Chr1:16226949‑16227062，所述区域2‑4为Chr1:16227037‑16227150。[0011] 在其中一个实施例中，所述区域3的部分区域包括区域3‑1、区域3‑2、区域3‑3和区域3‑4中的一个或多个；所述区域3‑1为Chr1:16227533‑16227709，所述区域3‑2为Chr1:16227656‑16227788，所述区域3‑3为Chr1:16227829‑16227969，所述区域3‑4为Chr1:16227983‑16228079。[0012] 在其中一个实施例中，所述区域4的部分区域包括区域4‑1、区域4‑2、区域4‑3、区域4‑4、区域4‑5和区域4‑6中的一个或多个；所述区域4‑1为Chr1:63319620‑63319777，所述区域4‑2为Chr1:63319748‑63319883，所述区域4‑3为Chr1:63319927‑63320117，所述区域4‑4为Chr1:63320163‑63320286，所述区域4‑5为Chr1:63320290‑63320419，所述区域4‑6为Chr1:63320525‑63320656。[0013] 在其中一个实施例中，所述区域5的部分区域包括区域5‑1和区域5‑2中的一个或多个；所述区域5‑1为Chr1:90727082‑90727252；所述区域5‑2为Chr1:90726838‑90726994。[0014] 在其中一个实施例，所述目标区域包括区域1、区域2、区域3、区域4和区域5中的至少两个。[0015] 在其中一个实施例，所述目标区域包括区域1的部分区域、区域2的部分区域、区域3的部分区域、区域4的部分区域和区域5的部分区域中的至少两个。[0016] 在其中一个实施例中，所述试剂通过如下方法中的一种或几种实现对所述目标区域的甲基化检测：甲基化特异性PCR、甲基化特异性荧光定量PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率熔解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法。[0017] 在其中一个实施例中，所述试剂包括核酸分子。[0018] 在其中一个实施例中，所述核酸分子包括用于检测如下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的检测引物对及对应的检测探针的核酸组合：区域1、区域2、区域3、区域4和区域5。[0019] 在其中一个实施例中，所述用于检测区域1的全长或部分区域的甲基化水平的检测引物对及对应的检测探针包括SEQIDNO.16～18、SEQIDNO.19～21、SEQIDNO.22～24、SEQIDNO.25～27和SEQIDNO.28～30所示的核酸组合中的至少一组；所述用于检测区域2的全长或部分区域的甲基化水平的检测引物对及对应的检测探针包括SEQIDNO.31～33、SEQIDNO.34～36、SEQIDNO.37～39和SEQIDNO.40～42所示的核酸组合中的至少一组；所述用于检测区域3的全长或部分区域的甲基化水平的检测引物对及对应的检测探针包括SEQIDNO.43～45、SEQIDNO.46～48、SEQIDNO.49～51和SEQIDNO.52～54所示的核酸组合中的至少一组；所述用于检测区域4的全长或部分区域的甲基化水平的检测引物对及对应的检测探针包括SEQIDNO.55～57、SEQIDNO.58～60、SEQIDNO.61～63、SEQIDNO.64～66、SEQIDNO.67～69和SEQIDNO.70～72所示的核酸组合中的至少一组；和/或，所述用于检测区域5的全长或部分区域的甲基化水平的检测引物对及对应的检测探针包括SEQIDNO.73～75和SEQIDNO.76～78所示的核酸组合中的至少一组。[0020] 在其中一个实施例中，所述试剂包括能差异修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的试剂。[0021] 可选的，所述试剂为重亚硫酸氢盐。[0022] 一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂盒，包括上述任一项所述的试剂。[0023] 上述任一项的试剂在制备膀胱癌诊断或辅助诊断产品中的应用。[0024] 相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：[0025] 本申请发现，以人类基因组中1号染色体上5个DNA区域中的至少一个区域作为分子标记物，通过检测分子标记物的甲基化水平，可以对膀胱癌进行诊断或辅助诊断，本申请提供的分子标记物具有非侵入性的、便捷的、高灵敏度的特性，有望提高我国膀胱癌的检出率，降低该疾病的发病率与死亡率。[0026] 本申请提供的试剂盒可快速高效准确的进行诊断，有效避免泌尿系统其他疾病的干扰导致的假阳性，有助于区分膀胱癌患者和非膀胱癌患者。附图说明[0027] 图1分子标志物中对应的探针在膀胱癌组织和癌旁正常组织中的平均甲基化水平。具体实施方式[0028] 为了便于理解本申请，下面将对本申请进行更全面的描述。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本申请公开内容更加透彻全面。[0029] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。[0030] 术语解释[0031] 术语“和/或”均是指包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。[0032] 术语“多个”指两个以上；“多种”指两种以上；“以上”与数字结合表示数量时包括本数，例如“两个以上”包括两个。[0033] 术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。[0034] 术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。[0035] 术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。[0036] 术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100％，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。[0037] 术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本文公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。[0038] 术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pgDNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本文公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物，若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38)，则表明目标序列是甲基化的。[0039] 术语“甲基化特异性荧光定量PCR(q‑MSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，但是q‑MSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在q‑MSP反应系统中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，q‑MSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。[0040] 术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’‑3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。[0041] 本申请一实施方式提供了一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂，试剂包括检测目标区域的甲基化水平的试剂，目标区域包括如下至少一个区域的全长或部分区域：区域1、区域2、区域3、区域4和区域5；[0042] 其中，区域1为Chr1:3746525‑3747320，区域2为Chr1:16226730‑16227150，区域3为Chr1:16227533‑16228079，区域4为Chr1:63319620‑63320656，区域5为Chr1:90726838‑90727252。[0043] 需要说明的是，在本文中，如未特殊说明，染色体上的位置均是以GRCh38.p14为参考。此外，因为染色体上的DNA是由正链和负链组成的双链结构，对于用染色体位置表示的区域，如果未指明是DNA的正链还是负链，则表示既可以是该区域的DNA的正链，也可以是该区域的DNA的负链，还可以是该区域的DNA的正负两条链。[0044] 在一个具体示例中，区域1为Chr1:3746525‑3747320正链，区域2为Chr1:16226730‑16227150正链，区域3为Chr1:16227533‑16228079正链，区域4为Chr1:63319620‑63320656正链，区域5为Chr1:90726838‑90727252负链。[0045] 在一个具体示例中，目标区域包括区域1全长或部分区域、区域2全长或部分区域、区域3全长或部分区域、区域4全长或部分区域、区域5全长或部分区域中的至少两个。[0046] 在一个具体示例中，目标区域包括区域1的部分区域、区域2的部分区域、区域3的部分区域、区域4的部分区域和区域5的部分区域中的至少两个。[0047] 在一个具体示例中，区域1的部分区域包括区域1‑1、区域1‑2、区域1‑3、区域1‑4和区域1‑5中的一个或多个；其中，区域1‑1为Chr1:3746525‑3746671；区域1‑2为Chr1:3746695‑3746839；区域1‑3为Chr1:3746854‑3746987；区域1‑4为Chr1:3747021‑3747165；区域1‑5为Chr1:3747172‑3747320。在其他示例中，区域1的部分区域还包括其它未列举的位于Chr1:3746525‑3747320之间的DNA片段。[0048] 在一个具体示例中，区域2的部分区域包括区域2‑1、区域2‑2、区域2‑3和区域2‑4中的一个或多个；其中，区域2‑1为Chr1:16226730‑16226856；区域2‑2为Chr1:16226858‑16226981；区域2‑3为Chr1:16226949‑16227062；区域2‑4为Chr1:16227037‑16227150。在其他示例中，区域2的部分区域还包括其它未列举的位于Chr1:16226730‑16227150之间的DNA片段。[0049] 在一个具体示例中，区域3的部分区域包括区域3‑1、区域3‑2、区域3‑3和区域3‑4中的一个或多个；其中，区域3‑1为Chr1:16227533‑16227709；区域3‑2为Chr1:16227656‑16227788；区域3‑3为Chr1:16227829‑16227969；区域3‑4为Chr1:16227983‑16228079。在其他示例中，区域3的部分区域还包括其它未列举的位于Chr1:16227533‑16228079之间的DNA片段。[0050] 在一个具体示例中，区域4的部分区域包括区域4‑1、区域4‑2、区域4‑3、区域4‑4、区域4‑5和区域4‑6中的一个或多个；其中，区域4‑1为Chr1:63319620‑63319777；区域4‑2为Chr1:63319748‑63319883；区域4‑3为Chr1:63319927‑63320117；区域4‑4为Chr1:63320163‑63320286；区域4‑5为Chr1:63320290‑63320419；区域4‑6为Chr1:63320525‑63320656。在其他示例中，区域4的部分区域还包括其它未列举的位于Chr1:63319620‑63320656之间的DNA片段。[0051] 在一个具体示例中，区域5的部分区域包括区域5‑1和区域5‑2中的一个或多个；其中，区域5‑1为Chr1:90727082‑90727252；区域5‑2为Chr1:90726838‑90726994。在其他示例中，区域5的部分区域还包括其它未列举的位于Chr1:90726838‑90727252之间的DNA片段。[0052] 在一个具体示例中，目标区域包括区域1‑1、区域1‑2、区域1‑3、区域1‑4、区域1‑5、区域2‑1、区域2‑2、区域2‑3、区域2‑4、区域3‑1、区域3‑2、区域3‑3、区域3‑4、区域4‑1、区域4‑2、区域4‑3、区域4‑4、区域4‑5、区域4‑6、区域5‑1和区域5‑2中的至少一个。[0053] 在一个具体示例中，目标区域包括区域1‑1、区域1‑2、区域1‑3、区域1‑4、区域1‑5、区域2‑1、区域2‑2、区域2‑3、区域2‑4、区域3‑1、区域3‑2、区域3‑3、区域3‑4、区域4‑1、区域4‑2、区域4‑3、区域4‑4、区域4‑5、区域4‑6、区域5‑1和区域5‑2中的至少两个。[0054] 在一个具体示例中，目标区域包括区域1‑4、区域2‑2、区域3‑1、区域4‑5和区域5‑1中的任意两个组合。[0055] 考虑到尿液是极其容易获得的体液样本，泌尿系统肿瘤组织中的肿瘤细胞会持续不断地脱落并随尿液排出体外，且尿液样本中脱落细胞携带的遗传信息与原位组织是一致的，因此发明人认为尿液样本中脱落细胞基因组DNA能在一定程度上反应泌尿系统的病变特征。本申请中，通过检测两个目标区域组合的甲基化水平诊断膀胱癌患者尿液样本的灵敏度可达93％，其诊断泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性可达97.67％，其诊断健康人尿液样本的特异性可达100％，从而有效区分膀胱癌患者和非膀胱癌患者。[0056] 在一个具体示例中，试剂通过如下方法中的一种或几种实现对所述目标区域的甲基化检测：甲基化特异性PCR、甲基化特异性荧光定量PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率熔解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法。[0057] 在一个具体示例中，试剂包括核酸分子。[0058] 在一个具体示例中，核酸分子包括用于检测如下至少一个区域的全长或部分区域的甲基化水平的检测引物对和/或对应的检测探针。本申请的引物对及检测探针没有特别的限定，本领域技术人员在确定将上述区域作为诊断膀胱癌的检测目标区域之后，可根据本领域已知的方法和工具设计特异性引物对及检测探针，只要能够实现检测目标区域的甲基化水平的目的即可。[0059] 在一个具体示例中，用于检测区域1甲基化水平的引物对包括SEQIDNO.16～17所示的引物对、SEQIDNO.19～20所示的引物对、SEQIDNO.22～23所示的引物对、SEQIDNO.25～26所示的引物对和SEQIDNO.28～29所示的引物对中的至少一组；用于检测区域2甲基化水平的引物对包括SEQIDNO.31～32所示的引物对、SEQIDNO.34～35所示的引物对、SEQIDNO.37～38所示的引物对和SEQIDNO.40～41所示的引物对中的至少一组；用于检测区域3甲基化水平的引物对包括SEQIDNO.43～44所示的引物对、SEQIDNO.46～47所示的引物对、SEQIDNO.49～50所示的引物对和SEQIDNO.52～53所示的引物对中的至少一组；用于检测区域4甲基化水平的引物对包括SEQIDNO.55～56所示的引物对、SEQIDNO.58～59所示的引物对、SEQIDNO.61～62所示的引物对、SEQIDNO.64～65所示的引物对、SEQIDNO.67～68所示的引物对和SEQIDNO.70～71所示的引物对中的至少一组；和/或用于检测区域5甲基化水平的引物对包括SEQIDNO.73～74所示的引物对和SEQIDNO.76～77所示的引物对中的至少一组。[0060] 在一个具体示例中，用于检测区域1甲基化水平的检测探针包括SEQIDNO.18、SEQIDNO.21、SEQIDNO.24、SEQIDNO.27和SEQIDNO.30所示的检测探针中的至少一个；用于检测区域2甲基化水平的检测探针包括SEQIDNO.33、SEQIDNO.36、SEQIDNO.39和SEQIDNO.42所示的探针中的至少一个；用于检测区域3甲基化水平的检测探针包括SEQIDNO.45、SEQIDNO.48、SEQIDNO.51和SEQIDNO.54所示的探针中的至少一个；用于检测区域4甲基化水平的检测探针包括SEQIDNO.57、SEQIDNO.60、SEQIDNO.63、SEQIDNO.66、SEQIDNO.69和SEQIDNO.72所示的探针中的至少一个；和/或用于检测区域5甲基化水平的检测探针包括SEQIDNO.75和SEQIDNO.78所示的探针中的至少一个。[0061] 在一个具体示例中，该试剂包括能差异修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的试剂。可选的，试剂为重亚硫酸氢盐。[0062] 本申请一实施方式还提供了一种用于膀胱癌诊断或辅助诊断的试剂盒，包括上述任一项所述的试剂。[0063] 在一个具体示例中，试剂盒还包括PCR扩增试剂、核酸提取试剂、核酸纯化试剂和样本的采样装置中至少一种。[0064] 在一个具体示例中，试剂盒检测的样本包括但不限于组织、血液、尿液等。[0065] 本申请一实施方式还提供了检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断或辅助诊断的产品中的应用，其中，目标区域包括上述任一项所述的目标区域。[0066] 本申请的膀胱癌诊断或辅助诊断包括区分膀胱癌患者和健康人，或包括区分膀胱癌患者和泌尿系统良性疾病患者。[0067] 具体实施例[0068] 下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。[0069] 下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。[0070] 实施例1分子标记物的选择[0071] 从TCGA数据库下载膀胱癌的DNA甲基化数据，经合并整理及校正后，分析各个探针在癌旁正常组织和癌组织中的甲基化水平，找出在膀胱癌组织中甲基化水平(β值)高于0.4，在癌旁正常组织中甲基化水平(β值)低于0.2，且在癌旁正常组织和癌组织中的甲基化水平具有统计学差异(P＜0.05)的探针，分析各个满足条件的探针识别的甲基化位点，发现所述探针可识别人类基因组1号染色体中的5个区域，即区域1、区域2、区域3、区域4和区域5。识别5个DNA区域的探针在膀胱癌组织和癌旁正常组织中的平均甲基化水平如图1所示，所有探针在癌组织中的甲基化水平明显高于其在癌旁正常组织中的水平。5个DNA区域在基因组(以GRCh38.p14为参考)中的具体位置及DNA序列如表1所示。[0072] 表1分子标记物的物理位置[0073][0074] 据此，选择表1中所展示的5个DNA区域作为诊断或辅助诊断膀胱癌尿液样本的潜在分子标志物，并将其分别命名为MarkerⅠ、MarkerⅡ、MarkerⅢ、MarkerⅣ和MarkerⅤ。[0075] 实施例2针对5个分子标记物的甲基化检测方法[0076] 为了达到简单、快捷地进行多样本同时检测的目的，本实施例提供了基于甲基化特异性荧光定量PCR法检测待测样本中5个分子标记物的甲基化水平的方法。[0077] 首先，基于模板设计甲基化检测引物对和检测探针。利用MethylPrimerExpress软件获取如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示的发生完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列，分别为SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和SEQIDNO.10；此外，分别将如SEQIDNO.1～SEQIDNO.5DNA序列中所有的C碱基替换为T碱基，得到完全未甲基化且经亚硫酸氢盐转化后的DNA序列，分别为SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14和SEQIDNO.15。将SEQIDNO.6～SEQIDNO.15分别人工合成并构建至质粒载体上，作为引物对筛选的模板备用。[0078] 分别以SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的DNA序列为模板，设计针对MarkerⅠ、MarkerⅡ、MarkerⅢ、MarkerⅣ和MarkerⅤ的甲基化检测引物对和检测探针。人工合成所设计的甲基化检测引物对和检测探针，以上述人工构建的质粒作为模板，进行qPCR实验检测引物对扩增目标区域的灵敏度和特异性。用于检测5个分子标记物的甲基化引物对除需要满足常规引物设计的要求以外还需满足以下条件：1)所述甲基化引物对对目标区域的扩增效率在100％左右，需超过90％而低于110％，因此，为提高甲基化荧光定量PCR的扩增效率，针对5个分子标记物的甲基化引物对所扩增的扩增子均不超过200bp；2)当PCR体系中同时加入甲基化的质粒模板和非甲基化的质粒模板时，甲基化的引物对仅扩增甲基化的质粒模板，而不扩增非甲基化的质粒模板。经过筛选，用于检测5个分子标志物各个目标区域的甲基化水平的检测引物对和检测探针的序列如表2所示。[0079] 表2甲基化检测引物对和检测探针[0080][0081][0082][0083] 表1中提供的检测探针均为TaqMan探针，其5’端连接有荧光基团，如FAM、ROX、VIC、CY5等，其3’端连接有荧光淬灭基团，如BHQ、BHQ1、MGB等。每对甲基化检测引物对可扩增的扩增子对应的DNA区域被称为目标区域，针对MarkerⅠ的5对甲基化检测引物对和检测探针可检测区域1内5个不同DNA区域(目标区域)的甲基化水平，其它甲基化检测引物对和检测探针也可分别检测各个分子标志物内的不同DNA区域(目标区域)的甲基化水平。具体地，每对甲基化检测引物对和检测探针可检测的DNA区域(目标区域)的物理位置及其可检测的甲基化的胞嘧啶位点如表3所示。[0084] 表3甲基化检测引物对和检测探针检测的目标区域及胞嘧啶位点[0085][0086][0087][0088] 在以人工合成的质粒作为模板进行qPCR反应来筛选甲基化检测引物对和检测探针以后，再分别以转化后的膀胱癌细胞系HTB9基因组DNA和转化后的人白细胞基因组DNA为模板检测所述甲基化引物对扩增目标区域的性能。此时，需在扩增体系中加入内参基因ACTB的扩增引物对和检测探针，用以监测样本质量，扩增ACTB基因的上游引物、下游引物及检测探针的序列分别为[0089] 5’‑AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG‑3’(SEQIDNO.79)，[0090] 5’‑AATAACACCCCCACCCTGC‑3’(SEQIDNO.80)，[0091] 5’‑GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQIDNO.81)。[0092] 经过验证，以转化后的膀胱癌细胞HTB9基因组DNA作为模板时，表1中提供的甲基化检测引物对和检测探针的扩增效率均在90％～110％之间，而以转化后人白细胞基因组DNA为模板时，表1中提供的甲基化检测引物对和检测探针的扩增特异性均高于90％。以上表明，表1中提供的引物探针可用于MarkerⅠ、MarkerⅡ、MarkerⅢ、MarkerⅣ和MarkerⅤ的甲基化水平的检测。[0093] 实施例3单分子标记物在尿液样本中的检测性能[0094] 1.样本收集：[0095] 收集经病理组织检测确诊为膀胱癌患者的尿液样本100例，收集健康人的尿液样本40例。此外，还收集了常见的泌尿系统良性疾病(腺性膀胱炎、泌尿道感染、前列腺增生、肾结石、肾积水等)患者的尿液样本86例，收集到的每份尿液样本的体积大于50mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。[0096] 2.尿液样本DNA的提取：[0097] 使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210740号)进行尿液样本DNA的提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。[0098] 3.尿液样本DNA的转化和纯化：[0099] 使用武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)进行尿液样本DNA的转化和纯化，具体操作步骤见试剂盒说明书。[0100] 4.甲基化特异性荧光定量PCR反应：[0101] 以经转化、纯化后的样本DNA为模板，使用表1中提供的甲基化检测引物对和探针进行MSP反应，检测待测样本中目标区域的甲基化水平。对于某一待测样本，在如表4的PCR反应体系中，需加入从该样本中提取转化纯化的DNA、检测某一目标区域的引物对和探针、内参基因ACTB的检测引物对和探针，以及Taq酶和相应的PCR缓冲液。随后按照qPCR程序进行扩增反应，其反应条件为：98℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃补充延伸5min(在退火及补充延伸过程中采集荧光)，共47个循环；4℃保存。本实施例中目标区域的检测探针5’端的荧光基团均为FAM，其3’端的荧光淬灭基团均为MGB，ACTB基因检测探针5’端的荧光基团为ROX，其3’端的荧光淬灭基团为BHQ。[0102] 表4PCR体系[0103][0104][0105] 此外，在PCR扩增的同时，需分别设置阳性对照和阴性对照。当扩增某一目标区域时，阳性对照PCR管的模板为含该目标区域的质粒和含转化后ACTB基因的质粒，其余与实验管相同；阴性对照PCR管的模板为超纯水，其余体系及反应程序均与实验管相同。PCR结束后，根据质量控制的要求剔除检测不成功的样本，读取合格样本的Ct值。所述质量控制的标准为：1)阴性对照管不起线，无扩增；2)阳性对照管扩增曲线呈S型，且所有基因的Ct值在25‑30之间；3)实验管内参基因的Ct值小于等于33。[0106] 5.结果判定：[0107] 在待测样本中，若扩增目标区域的Ct值小于等于38，则认为此样本中该目标区域为甲基化阳性，且该样本为癌症阳性样本；若扩增目标区域的Ct值大于38，则认为此样本中该目标区域为甲基化阴性，且该样本为癌症阴性样本。根据上述判断标准，利用5个分子标记物中21个目标区域的甲基化水平分别诊断部分尿液样本的性能如表5所示，表5中的部分样本包括膀胱癌患者的尿液样本60例，泌尿系统良性疾病患者的尿液样本43例，健康人尿液样本40例。表5中灵敏度为病理阳性的患者尿液样本中MSP法判定为阳性的比例，特异性为泌尿系统良性疾病患者和健康人尿液样本中MSP法判定为阴性的比例。[0108] 表5单分子标记物诊断尿液样本的性能[0109][0110][0111] 由表5可以看出，MarkerⅠ、MarkerⅡ、MarkerⅢ、MarkerⅣ和MarkerⅤ对于膀胱癌患者均具有良好的诊断效果。总体看来，通过检测所述5个分子标志物共21个目标区域的甲基化水平分别诊断膀胱癌患者尿液样本的灵敏度范围为66.67％～85.00％，其检测泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性范围为81.40％～97.67％，其检测健康人尿液样本的特异性范围为95％～100％。另外，所述5个分子标志物共21个目标区域检测尿液样本的特异性优于其检测尿液样本的灵敏度。具体来看，对于MarkerⅠ，区域1‑3检测癌症患者尿液样本的灵敏度最高，可达78.33％，而区域1‑4检测健康人和泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性最高，分别为100％和90.70％；对于MarkerⅡ，区域2‑1和区域2‑3检测癌症患者尿液样本的灵敏度最高，均为83.33％，而区域2‑2检测健康人和泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性最高，分别为100％和95.35％；对于MarkerⅢ，区域3‑3检测癌症患者尿液样本的灵敏度最高，可达78.33％，而区域3‑1检测健康人和泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性最高，分别为100％和97.67％；对于MarkerⅣ，区域4‑2检测癌症患者尿液样本的灵敏度最高，可达85.00％，而区域4‑5检测健康人和泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性最高，分别为100％和97.67％；对于MarkerⅤ，区域5‑2检测癌症患者尿液样本的灵敏度最高，可达81.67％，而区域5‑1检测健康人和泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性最高，分别为100％和93.02％.[0112] 实施例4双分子标记物在尿液样本中的检测性能[0113] 由表5可以看出，所述5个分子标志物共21个目标区域检测健康人和泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性均较好，因此可以考虑通过检测双分子标记物的甲基化水平来诊断膀胱癌，以进一步提高其检测膀胱癌尿液样本的灵敏度。分别选择5个分子标记物中特异性最佳的目标区域作为代表来分析标记物组合检测尿液样本的性能，其中，区域1‑4代表MarkerⅠ，区域2‑2代表MarkerⅡ，区域3‑1代表MarkerⅢ，区域4‑5代表MarkerⅣ，区域5‑1代表MarkerⅤ。首先，利用实施例2和3提供的方法检测上述5个目标区域在所有100例膀胱癌患者的尿液样本、40例健康人的尿液样本及86例泌尿系统良性疾病患者的尿液样本中的Ct值。然后，分析5个目标区域中任意2个目标区域在每个尿液样本中的甲基化水平，进而判定待测样本是否为膀胱癌阳性，具体的判定标准为：1)若某一待测样本中，2个目标区域中至少一个目标区域的Ct值小于等于38，即此待测样本在所检测的2个目标区域中至少一个区域为甲基化阳性，该样本为膀胱癌阳性样本；2)若某一待测样本中，2个目标区域的Ct值都大于38，即此待测样本在所检测的2个目标区域为甲基化阴性，该样本为膀胱癌阴性样本。根据以上判定标准，5个代表性的目标区域中任意2个目标区域组合诊断膀胱癌患者尿液样本的性能如表6所示。[0114] 表6双分子标记物在尿液样本中的检测性能[0115][0116][0117] 由表6可以看出，当检测两个标记物组合的甲基化水平时，其诊断膀胱癌患者灵敏度显著提升，而特异性没有明显下降，因此，使用两个标记物联合诊断的方式优于单标记物诊断的方式。总体看来，5个分子标记物中任意2个标记物组合来诊断膀胱癌患者尿液样本的灵敏度范围为78％～93％，其诊断泌尿系统良性疾病患者尿液样本的特异性范围为86.05％～97.67％，其诊断健康人尿液样本的特异性均为100％。具体来看，标记物组合MarkersⅠ+Ⅳ和MarkersⅡ+Ⅳ诊断膀胱癌患者尿液样本的灵敏度最高，均为93％，标记物组合MarkersⅢ+Ⅳ诊断泌尿系统良性疾病患者的特异性最高，为97.67％。另外，可以看出，标记物组合MarkersⅡ+Ⅳ和MarkersⅢ+Ⅳ诊断性能最佳。[0118] 综上，通过检测1号染色体上5个分子标记物中21个不同目标区域的DNA甲基化水平，可以有效区分膀胱癌患者和非膀胱癌患者，且5个分子标记物中任意2个标记物组合的诊断方式优于单标记物诊断。上述诊断方法所检测的样本均为尿液样本，且检测的灵敏度可达93％，特异性可达97.67％，为膀胱癌患者带来福音。[0119] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。[0120] 以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

专利地区：湖北

专利申请日期：2022-12-29

专利公开日期：2024-11-29

专利公告号：CN115976213B